Anda di halaman 1dari 24

LBM 3 HERBAL UPGRADE HASIL UJI IN VITRO

TERNYATA RUMIT YA...


STEP 1
STEP 2
1. Pengertian uji in vivo dan uji in vitro beserta
kelebihan dan kekurangannya?
2. Bagaimana tahapan melakukan uji in vivo dan uji
in vitro assay?
3. Bagaimana cara melakukan pemilihan subjek uji,
metode uji, parameter yang akan diukur serta uji
analisis pada in vivo dan in vitro ?
4. Apa yang dimaksud dengan desain uji farmakologi
dan uji toksikologi ?
STEP 3
1. Apa yang dimaksud dengan desain uji farmakologi
dan uji toksikologi ?
Uji farmakologi : uji untuk mengetahui khasiat
dari suatu tanaman obat atau senyawa obat.
Bisa dlihat dari ED50.
Uji toksikologi : uji untuk mengetahui toksisitas
dari tanaman obat atau senyawa obat, dapat
dilihat dari LD50.
2. Pengertian uji in vivo dan uji in vitro beserta
kelebihan dan kekurangannya, contoh?
IN VITRO
Adalah penelitian yang dilakukan dalam suatu
tabung uji, (diluar tubuh)

Kelebihan : banyak digunakan, murah dan


cepat, untuk menyimpulkan tindakan
mekanisme biologis lebih tepat daripada in
vivo, sampel lebih sedikit.
Dapat benar-benar dikontrol var luar nya,
lebih murah,
Kekurangan : bertentangan dengan hasil in
vivo
Contoh uji efek mukolitik, uji antifungi,
antikalkuli, uji sitotoksik, uji aktifitas
antiaskariasis
Uji toksisitas in vitro dapat dilakukan
dengan uji sitotoksik dan uji brain shrimp test
IN VIVO
Penelitian di dalam tubuh (manusia, hewan)
Di hewan : 2 spesies (rodent dan non rodent)
Kekurangan : kebutuhan sample lebih
banyak, mahal dan lama
Kelebihan : sesuai dengan sistem tubuh, efek
farmakokinetik lebih bisa dilihat (ADME)
Contoh : obat fertilitas digunakan dengan
hewan uji galur SD karena mempunyai anak
lebih banyak sehingga pengamatan akan lebih
baik
3. Bagaimana tahapan melakukan uji in vivo dan uji
in vitro assay?
IN VITRO
Tahapan :
preparasi kultur sel penanaman sel
pemanenan sel dihitung jumlah sel

ditempatkan di well plate uji sitotoksik senyawa


(perlakuan) diamati
IN VIVO
Pemilihan hewan uji (sesuai dengan tujuan
penelitian) adaptasi 5-7 hari pemberian
perlakukan pengamatan pelaporan
4. Bagaimana cara melakukan pemilihan subjek uji,
metode uji, parameter yang akan diukur serta uji
analisis pada in vivo dan in vitro ?
Pemilihan subjek uji disesuaikan tujuan
penelitian
Cth : uji fertilitas tikus galur SD
Metode uji disesuaikan mgg pre post test,
post test only
Desain penelitian :
Variabel tunggal :
Pra eksperimental design/ non design
: one shot case study satu
kelompok diberi treatment kemudian
diobservasi hasil. One group pre test
post test design : dibandingkan pre
dan post perlakuan. Intact group
comparison design : satu kelompok
dibagi 2, kontrol dan perlakuan.
True eksperimental design : variabel
luar bs dikontrol. Validitas interna
tinggi. Ciri : sampel random, ada
kontrol dan perlakuan.
- Post test only control design : 2
kelompok dirandom
- Pre post control group

- The Solomon four group : salah


satu dipilih random kemudian 2
grup diberi pre test, yg 2 tanpa pre
test. 2 grup yg diberi pre test
diambil 1. Grup yg tanpa pre test
diambil 1. Diberi perlakuan. Hasil
ke empatnya di post test.

Eksperimental quasi design


- Time design series
- Non equivalent control group
- Counter balance design
Parameter

STEP 4

Uji
penelitian

IN VITRO
(LUAR)

IN VITRO
(DALAM)

UJI EFEK
MUKOLITIK
- UJI ANTIFUNGI
- UJI ANTIKALKULI
- UJI TOKSISITAS
IN VITRO
- UJI AKTIFITAS
ANTIASKARIASIS

TAHAPAN

TAHAPAN
Pemilihan hewan
uji (sesuai
dengan tujuan
penelitian)

STEP 7 LI LBM 3 Herbal


1. Apa yang dimaksud dengan desain uji farmakologi
dan uji toksikologi ?
Uji kemanjuran (efficacy) dilakukan untuk mendapatkan data
kemanjuran dan kisaran dosis efektif tengah (ED50) suatu sediaan obat,
senyawa kimia maupun obat tradisional. Sedangkan untuk menilai
keamanannya dilakukan dengan mengevaluasi data ketoksikan akut (LD 50)
subkronik, dan keteratogenikan suatu obat atau obat tradisional dan
untuk mendapatkan data prakiraan batas aman (LD50/ED50).
Sementara itu uji toksisitas diperlukan untuk menilai keamanan suatu
obat, maupun bahan yang dipakai sebagai siplemen ataupun makanan.
Berdasarkan lama paparan dan dosis, diketahui ada 3 tingkatan uji
ketoksikan yaitu akut, sub kronik, dan kronik. Toksisitas Akut digunakan
untuk menilai ketoksikan suatu bahan dengan pemberian suatu bahan
sampel dosis tunggal dalam waktu akut (singkat), biasanya 24 jam.
Toksisitas sub kronik dilakukan dengan pemberian suatu bahan sampel
dengan dosis berulang selama jangka waktu kurang dari 3 bulan.
Toksisitas kronik dilakukan seperti sub kronik tetapi selama lebih dari 3
bulan. Uji Toksisitas subkronik atau kronik dianjurkan tetap perlu dilakukan
meskipun senyawa tersebut diketahui mempunyai toksisitas rendah. Ini
ditujukan untuk melakukan antisipasi kemungkinan adanya efek toksik
terhadap organ tubuh dari senyawa tersebut jika digunakan dalam waktu
lama. Hal ini perlu dipahami oleh produsen obat, makanan, maupun
makanan suplemen, agar dapat melindungi keamanan dan keselamatan
konsumen. Untuk itu LPPT UGM yang telah mempunyai kompetensi dalam
penanganan
dan
pengembangan
hewan
percobaan
standard,
menyediakan fasilitas uji farmakologi dan toksisitas yang dapat
dimanfaatkan oleh industri obat maupun makanan.
Tujuan Uji Toksisitas dan Farmakologi adalah :

Menilai keamanan obat, obat tradisional bahan kimia sebagai


makanan atau suplemen

Menilai potensi suatu obat, obat tradisional untuk efektifitas


farmakologi tertentu.
http://lppt.ugm.ac.id/berita-200-uji-farmakologi-dan-ujitoksisitas.html
alah satu syarat agar suatu calon obat dapat dipakai dalam praktek
kedokteran dan pelayanan kesehatan formal (fitofarmaka) adalah jika

bahan baku tersebut terbukti aman dan memberikan manfaat klinik.


Untuk membuktikan keamanan dan manfaat ini, maka telah
dikembangkan perangkat pengujian secara ilmiah yang mencakup :
1.
Uji farmakologi (pembuktian efek atau pengaruh obat),
2.
Uji toksikologi (pembuktian syarat keamanan obat secara formal),
dan
3.
Uji klinik (manfaat pencegahan dan penyembuhan penyakit atau
gejala penyakit).
Pengujian bahan obat dimaksud agar obat-obat yang dipakai dalam
praktek klinik pada manusia dapat dipertanggung jawabkan khasiat,
manfaat, serta keamanannya secara ilmiah.
Uji Farmakologi

Uji farmakologi merupakan salah satu persyaratan uji untuk calon obat.
Dari uji ini diperoleh informasi tentang efikasi (efek farmakologi) dan profil
farmakokinetik (meliputi absorpsi, distribusi, metabolisme dan eliminasi
obat) calon obat. Hewan yang baku digunakan adalah galur tertentu dari
mencit, tikus, kelinci, marmot, hamster, anjing atau beberapa uji
menggunakan primata, hewan-hewan ini sangat berjasa bagi
pengembangan obat.
Semua hasil pengamatan pada hewan menentukan apakah dapat
diteruskan dengan uji pada manusia. Ahli farmakologi bekerja sama
dengan ahli teknologi farmasi dalam pembuatan formula obat,
menghasilkan bentuk-bentuk sediaan obat yang akan diuji pada manusia.
Di samping uji pada hewan, untuk mengurangi penggunaan hewan
percobaan telah dikembangkan pula berbagai uji in vitrountuk
menentukan khasiat obat contohnya uji aktivitas enzim, uji antikanker
menggunakan cell line, uji anti mikroba pada perbenihan mikroba, uji
antioksidan, uji antiinflamasi dan lain-lain untuk menggantikan uji khasiat
pada hewan tetapi belum semua uji dapat dilakukan secara in vitro.
Uji Toksisitas
Uji toksisitas akut sangat penting untuk mengukur dan mengevaluasi
karakteristik toksik dari suatu bahan kimia. Uji ini dapat menyediakan
informasi tentang bahaya kesehatan manusia yang berasal dari bahan
kimia yang terpapar dalam tubuh pada waktu pendek melalui jalur oral.
Data uji akut juga dapat menjadi dasar klasifikasi dan pelabelan suatu
bahan kimia.
Toksisitas akut didefinisikan sebagai kejadian keracunan akibat
pemaparan bahan toksik dalam waktu singkat, yang biasanya dihitung

dengan menggunakan nilai LC50 atau LD50. Nilai ini didapatkan melalui
proses statistik dan berfungsi mengukur angka relatif toksisitas akut
bahan kimia.
Toksisitas akut dari bahan kimia lingkungan dapat ditetapkan secara
eksperimen menggunakan spesies tertentu seperti mamalia, bangsa
unggas, ikan, hewan invertebrata, tumbuhan vaskuler dan alga. Uji
toksisitas akut dapat menggunakan beberapa hewan mamalia, namun
yang dianjurkan untuk uji LD50 diantaranya tikus, mencit dan kelinci. Di
samping
pengamatan
terhadap
gejala
klinis
dan
uji
LD50 , bisa dilakukan juga pengujian terhadap organ gastrium, duodenum
dan
ginjal untuk
melihat
gambaran
histopatologinya. Gambaran
histopatologi ini bisa diambil dari organ hewan uji kemudian
didokumentasikan menggunakan kamera mikroskop.

Uji toksisitas kronis diperlukan jika uji toksisitas akut tidak menghasilkan
efek, maka bukan berarti toksikan tidak bersifat toksik. Oleh karena itu
perlu uji kronis.Percobaan ini dilakukan dengan memberikan dosis tertentu
bahan kimia terhadap hewan percobaan melalui penelanan atau inhalasi
terhadap bahan kimia yang sedang diuji selama masa hidupnya. Untuk
mencit dapat memakan waktu hingga 2 tahun sedangkan untuk tikus
sedikit lebih singkat.
Maksud dari uji kronik (seumur hidup), untuk menentukan apakah bahan
kimia dapat menimbulkan setiap efek kesehatan yang mungkin
memerlukan waktu yang lama untuk menimbulkan suatu efek seperti
kanker, atau paparan jangka panjang terhadap bahan kimia menimbulkan
efek kesehatan pada organ seperti ginjal.
Setelah calon obat dinyatakan mempunyai kemanfaatan dan aman pada
hewan percobaan maka selanjutnya diuji pada manusia (uji klinik). Uji
pada manusia harus diteliti dulu kelayakannya oleh komite etik mengikuti
Deklarasi Helsinki.
Uji Klinik
Setelah praklinis selesai, kemudian diujikan kepada manusia. Dari yang
sakit kemudian yang sehat. Biayanya besar, sampai miliaran rupiah.
Sehingga, biasanya harus kerja sama dengan industri. Dalam uji klinis,
obat alam tadi dibandingkan dengan placebo yaitu senyawa tanpa efek,
misalnya isi serbuk atau tepung. Sama-sama berbentuk kapsul, satu berisi
obat dan satunya isi serbuk. Orang yang diuji tidak boleh tahu. Pengujinya
kadang juga tidak tahu. Hal itu supaya tidak bias cara melihat efek.

Uji klinik pada manusia baru dapat dilakukan jika syarat keamanan
diperoleh dari pengujian toksisitas pada hewan serta syarat mutu sediaan
memungkinkan untuk pemakaian pada manusia. Pengujian klinik calon
obat pada manusia terbagi dalam beberapa fase yaitu :
Fase I :
Dilakukan pada sukarela sehat untuk melihat apakah efek farmakologi,
sifat farmakokinetik yang diamati pada hewan juga terlihat pada
manusia. Pada fase ini ditentukan hubungan dosis dengan efek yang
ditimbulkan dan profil farmakokinetik obat pada manusia.
Fase II :
Dilakukan pada kelompok pasien secara terbatas (100-200 pasien) untuk
melihat kemungkinan penyembuhan dan pencegahan penyakit. Pada fase
ini rancangan penelitian masih dilakukan tanpa kelompok pembanding
(kontrol), sehingga belum ada kepastian bukti manfaat terapetik.
Fase III :
Dilakukan pada pasien dengan rancangan uji klinik yang memadai,
memakai kontrol sehingga didapat kepastian ada tidaknya manfaat
terapetik.
Fase IV :
Pemantauan pasca pemasaran (surveilan post marketing) untuk melihat
kemungkinan terjadinya efek samping yang tidak terkendali pada waktu
pengujian pra klinik atauklinik fase 1 , 2 , 3.

2. Pengertian uji in vivo dan uji in vitro beserta


kelebihan dan kekurangannya, contoh?
In vivo :
Terletak di dalam tubuh manusia digunakan hewan
utuh dan kondisi hidup (baik sadar atau teranestesi)
dalam lingkungan yang terkendali
Syarat hewan yg digunakan sangat banyak tgt jenis
obatnya, missal yang jelas harus dilakukan control
terhadap galur/spesies, jenis kelamin, umur, berat
badan (mempengaruhi dosis)
harus dilakukan pada minimal 2 spesies yakni
rodent/hewan mengerat dan non rodent. Alasannya
krn system fisiologi dan patologi pada manusia
merupakan perpaduan antara rodent dan non rodent.
kekurangan

Kebutuhan sample yang digunakan lebih banyak


Mahal dan lama
Contoh
:
- utk obat fertilitas digunakan hewan uji tikus/rat galur
Sprague Dowley/SD bukan Wistar atau jenis tikus lainnya,
krn tikus jenis SD memiliki anak banyak shg pengamatan
akan lbh baik dg jumlah sample yg banyak.
- Utk uji painkiller digunakan mencit/mice jika utk
menilai nyeri ringan yakni dengan penyuntikan asam
asetat glacial ke peritoneum mencit, tapi jika sasarannya
nyeri tekanan digunakan tikus bias Wistar atau SD, karena
tikus akan dijepit ekornya atau telapak jarinya dengan alat
tertentu, sementara kalo nyeri berupa panas, digunakan
boleh mencit atau tikus krn hewan akan diletakkan di hot
plate.
- Utk antidiabetika, seharusnya digunakan babi atau
sapi yg pankreasnya banyak kemiripan dg manusia,
namun dengan tikus sudah cukup dengan adanya
keterbatasan
subyek
uji
- Utk antiemetik/anti muntah digunakan burung
merpati, krn bisa dirangsang utk muntah berkali-kali sbg
kuantifikasi, sementara hewan lain hanya muntah sekali.
- Utk obat antihipertensi, digunakan kucing atau anjing
teranestesi, krn system kardiovaskulernya paling mirip dg
manusia
- Utk obat antiinflamasi digunakan baik tikus yang
disuntik karagenan di bawah kulitnya shg melepuh atau
telinga mencit disuntik croton oil, bahkan kaki tikus sering
dipotong
utk
menimbang
udem
yg
terbentuk
- utk antipiretik/penurun panas, digunakan kelinci utk

diukur

suhu

duburnya

setelah

disuntik

pyrogen

- Utk asam urat digunakan ayam/burung yg dikasih


makan jus hati ayam (ayam makan ayam) krn
metabolisme asam urat pada manusia mirip dg yg terjadi
dg
biokimiawi
di
keluarga
burung.
- Uji stamina digunakan tikus atau mencit, krn tubuhnya
kuat dan tahan di dalam air, hewan diuji dg berenang dan
lari
di
treadmill.
- Uji libido, digunakan tikus dalam keadaan estrus/siap
menerima
pejantan.
- Utk uji kanker, digunakan punggung tikus yg diimplan
dg sel kanker, atau paru-paru tikus setelah dipejankan
benzo(a)pirena
Hasilnya berupa : efek farmakologi, dosis terapi
ED50=dosis yang menghasilkan 50% efek maksimum.
(KEPUTUSAN
MENTERI
KESEHATAN
REPUBLIK
INDONESIA
NOMOR 761/MENKES/SK/IX/1992 TENTANG PEDOMAN
FITOFARMAKA)
In vitro :
Terletak di dalam suatu system tetapi di luar tubuh
manusia
dilakukan mikroorganisme pada tidak hidup tetapi
dalam lingkungan terkontrol, misalnya di dalam tabung
reaksi atau cawan Petri
Jenis penelitian ini bertujuan untuk menjelaskan
pengaruh dari variabel eksperimental pada subset dari
bagian pokok suatu organisme. Hal ini cenderung untuk
memfokuskan pada organ , jaringan , sel , komponen
sel, protein , dan / atau biomolekul

tingkat penyederhanaan sistem yang diteliti lebih


besar , sehingga peneliti dapat fokus pada sejumlah
komponen. Sebagai contoh , identitas protein dari
sistem kekebalan tubuh ( misalnya antibodi ) , dan
mekanisme yang mengenali dan mengikat antigen asing
akan tetap sangat jelas jika tidak untuk penggunaan
ekstensif kerja in vitro untuk mengisolasi protein ,
mengidentifikasi sel-sel dan gen yang memproduksi
mereka , mempelajari fisik sifat interaksi mereka dengan
antigen , dan mengidentifikasi bagaimana interaksi
mereka menyebabkan sinyal seluler yang mengaktifkan
komponen lain dari sistem kekebalan tubuh
Respon seluler adalah spesies - spesifik , lintas analisis bermasalah spesies . Metode baru spesies - sasaran
yang sama - , studi multi- organ yang tersedia untuk
memotong hidup , pengujian lintas-spesies
kekurangan :
- Banyak percobaan biologi seluler dilakukan di luar
organisme atau sel ; karena kondisi pengujian mungkin
tidak sesuai dengan kondisi di dalam organisme, ini
dapat mengakibatkan hasil yang tidak sesuai dengan
situasi yang muncul dalam organisme hidup. Akibatnya,
hasil eksperimen tersebut sering dijelaskan dengan in
vitro, bertentangan dengan in vivo.
- Namun, kondisi yang terkendali hadir dalam sistem in
vitro berbeda secara signifikan dari yang in vivo, dan
dapat memberikan hasil yang menyesatkan. Oleh
karena itu, dalam studi in vitro biasanya diikuti oleh
studi vivo.
Contohnya termasuk:
- Dalam biokimia, fisiologis stoikiometri konsentrasi nonaktif dapat mengakibatkan enzim dalam arah terbalik,
misalnya beberapa enzim dalam siklus Krebs mungkin
tampak memiliki tata-nama, salah.

- DNA dapat mengadopsi konfigurasi lainnya, seperti A


DNA .
- Protein lipat mungkin berbeda seperti dalam sel ada
kepadatan tinggi protein lain dan ada sistem untuk
membantu lipat, sementara in vitro, kondisi kurang
bergerombol dan tidak membantu.
-

Kelebihan
Kebutuhan sample yang digunakan lebih sedikit
Murah dan cepat
Dalam penelitian in vitro yang lebih cocok dibandingkan
in vivo untuk menyimpulkan tindakan
mekanisme
biologis. Dengan variabel yang lebih sedikit dan
perseptual diperkuat menyebabkan reaksi halus, hasil
yang umumnya lebih jelas.
in vitro lebih cocok untuk mengamati efek keseluruhan
percobaan pada subjek hidup
Contoh :
-

uji pada mikroba jika antibiotic;


pada sel kanker dari hewan utk obat anti kanker;
pada plasmodium utk obat anti malaria;
pada
jamur
missal
candida
pada
obat
anti
keputihan/candidiasis;
pada cacing utk obat cacing;
pada virus utk obat antivirus;
pada bagian organ tertentu dari hewan contoh obat
asma bronkodilator diuji pada otot polos trachea
marmot;
pada jantung hewan dalam chamber utk obat angina
dan
aritmia;
dll.
http://chemedu09.wordpress.com/2012/05/23/apa
-sih-bedanya-antara-in-vivo-in-vitro-dan-ex-vivo/

1. Vignais, Paulette M.; Pierre Vignais (2010). Discovering Life,


Manufacturing Life: How the experimental method shaped
life sciences. Berlin: Springer. ISBN 90-481-3766-7 .

2. ^ Jacqueline Nairn; Price, Nicholas C. (2009). Exploring


proteins: a student's guide to experimental skills and
methods. Oxford [Oxfordshire]: Oxford University
Press. ISBN 0-19-920570-1 .
3. ^ Sunshine, Geoffrey; Coico, Richard (2009). Immunology: a
short course. Wiley-Blackwell. ISBN 0-470-08158-9 .
4. ^ "Existing Non-animal Alternatives" . Source: AltTox.org . 8
September 2011.

3. Bagaimana tahapan melakukan uji in vivo dan uji


in vitro assay?
a. Menumbuhkan Sel HeLa (atau cell line yang
lain dari Penyimpanan Nitrogen Cair Cell line
dimasukkan dalam tabung conical + 5 ml
media pencuci (RPMI) lalu dikocok.
Disentrifus 1500 g, 10, Pencucian dilakukan 3
X. Sel dimasukkan dalam flask + media
penumbuh (RPMI + FBS).
Semua kegiatan dilakukan secara aseptis
dalam laminar air flow cabinet.
Sel tersebut kemudian diinkubasi pada 37C
dengan aliran CO2 5%.
Perkembangan sel diamati tiap hari & tiap 3
hari
media diganti baru.
b. Panen Sel
Sel yang sudah tumbuh memenuhi flask
diganti medianya lalu dilepas dari dinding
flask dengan penambahan 100 l larutan EDTA
/ tripsin. Flask dikocok perlahan sampai sel
terlepas semua. Suspensi sel tersebut
dimasukkan dalam
tabung conical lalu disentrifus 1500 g, 10.
Supernatan dibuang, pelet disuspensikan lagi

dengan media pencuci 5 ml. Suspensi


disentrifus 1500 g, 10. Pencucian dilakukan 2
X
c. Hitung Sel
Pelet hasil pencucian disuspensikan dalam
media penumbuh sampai diperoleh kepadatan
sel 5 X 105 (jumlah sel dihitung dengan
Nebauer Hemocytometer dengan pewarna biru
tripan).
d. Mengkultur sel & pemberian sampel
Tiap 100 l suspensi sel dimasukkan dalam
tiap sumuran Tissue culture cluster 96 ,
kemudian diinkubasi 4 jam, 37C, CO2 5%.
Ditambahkan sampel yang akan diuji sitotoksik
dengan konsentrasi bertingkat, (dikocok
perlahan dengan pipet), lalu diinkubasi lagi 24
jam, 37C,
CO2 5%.
Pada akhir inkubasi, sel diamati di bawah
mikroskup (melihat perbedaan antara sel yang
diberi perlakuan dengan zat sitotoksik dengan
sel kontrol)
e. Penetapan Viabilitas Sel
Dilakukan penggantian media penumbuh lalu
+ 10 l MTT (5mg/ml) pada tiap sumuran,
inkubasi 4 jam, 37C, 5% CO2. Amati
pembentukan garam formazan di bawah
mikroskup.
Setelah 4 jam, + 100 l 0,04 M asam kloridaisopropanol pada tiap sumuran lalu dikocok
keras.

OD tiap sumuran dibaca dengan Elisa Reader


pada panjang gelombang 550 nm, hitung LC50
dari zat sitotoksik yang diuji
4. Bagaimana cara melakukan pemilihan subjek uji,
metode uji, parameter yang akan diukur serta uji
analisis pada in vivo dan in vitro ?
Pemilihan subjek uji
Menggunakan hewan utuh
(Harmanto, Ning. Subroto, Ahkam. 2007. Pilih Jamu
dan Herbal Tanpa Efek Samping. Jakarta: Elex Media
Komputindo)
Spesies yang ideal untuk uji toksisitas sebaiknya memenuhi
criteria-kriteria sebagai berikut:
Berat badan lebih kecil dari 1 kg
Mudah di ambil darahnya dan jumlah darah yang dapat
diambil cukup banyak
Mudah dipegang dan dikendalikan
Pemberian materi mudah dilakukan dengan berbagai rute
(oral, subkutan)
Mudah dikembangbiakan dan mudah dipelihara di
laboratorium
Lama hidup relative singkat
Fisiologi diperkirakan sesuai/identik dengan manusia/hewan
yang dituju
(Kusumawati.2004.Bersahabat
dengan
hewan
coba.Yogyakarta:Gadjah Mada University Press)

Kesehatan hewan bebas dari penyakit


Disesuaikan dengan tujuan penelitian
Kebutuhan bahan makanan di sesuaikan berat badan
BB disesuaikan dengan rancangan penelitian
(Bersahabat dengan hewan coba UGM)

Prosedur pengujian dapat dibagi menjadi 4 tahapan kegiatan,


yaitu pemilihan hewan uji, pemberian perlakuan, pengamatan
dan pelaporan.
1. Pemilihan Hewan Uji.
Paling tidak hal yang harus diperhatikan dalam memilih
hewan uji, yaitu :
a. species dan strain hewan yang akan digunakan,
b. usia,
c. jenis kelamin dan
d. jumlahnya.
Species mamalia yang umum digunakan adalah tikus,
mencit dan kelinci. Untuk unggas digunakan embrio
ayam (percobaan in ovo). Kemajuan teknik laboratorium
yang ada sekarang dan reaksi dari pemerhati hak
binatang telah membuka kemungkinan penggunaan
hanya organ, jaringan atau sel saja menggantikan
hewan uji (kultur organ atau kultur sel melalui
percobaan in vitro). Teknik ini sangat penting terutama
dalam upaya mengungkap mekanisme teratogenesis
suatu agensia. Di Indonesa hewan uji yang populer
digunakan adalah mencit dan tikus, karena itu tulisan
ini selanjutnya akan membicarakan pengujian dengan
menggunakan hewan uji tersebut.
Hewan betina yang digunakan adalah betina dara
sedangkan untuk jantan dipilih pejantan yang sudah
terbukti baik fertilitasnya. Hewan dikawinkan di malam
hari dengan cara mencampur 1 jantan dengan 3 betina
dalam satu kandang. Jika keesokan harinya ditemukan
adanya sumbat vagina (vaginal plug) atau adanya
sperma di vagina yang dideteksi melalui pemeriksaan
mikroskopis apusan vagina, maka itu pertanda
perkawinan sudah berlangsung dan hari tersebut
dtentukan sebagai hari ke nol kebuntingan.
Jumlah hewan uji yang digunakan paling tidak sebanyak
20 ekor betina bunting untuk tiap kelompok perlakuan.
Karena kelompok perlakuan biasanya terdiri atas paling
tidak 3 taraf dan 1 kelompok kontrol, maka jumlah
hewan bunting yang dibutuhkan adalah 80 ekor.
2. Pemberian Perlakuan.
Untuk agensia berupa senyawa kimia, dosis tertinggi
perlakuan sebaiknya tidak > 1000 mg/kg berat badan
per hari dengan pemberian per oral atau subkutan,

sedangkan untuk agensia lain disesuaikan dengan


besaran paparan yang mungkin diterima dari
lingkungan.
Dosis tertinggi sebaiknya lebih kecil dari angka LD-50
dan 2 kelompok dosis berikutnya ditata dengan interval
sama di bawah dosis tertinggi tadi (misalnya LD-50, 2/3
LD-50, 1/3 LD-50, dan kontrol).
Kelompok kontrol disesuaikan dengan percobaan.
Aturan yang umum digunakan adalah apabila agensia
dilarutkan dengan suatu pelarut maka kepada kelompok
kontrol diberikan pelarut saja dengan cara pemberian
yang persis sama dengan cara pemberian pada
kelompok perlakuan. Untuk kontrol positif dapat dipilih
agensia-agensia yang sudah dikenali memiliki efek
teratogenik. Penggunaan kontrol positip adalah untuk
menilai kepekaan strain yang digunakan.
Cara pemberian perlakuan yang paling umum adalah
pemberian per oral (pencekokan). Cara lain dapat dipilih
dengan
pertimbangan
khusus,
seperti
inhalasi,
subkutan,
intraperitoneal
atau
intramuskuler.
Pertimbangan utama dalam pemilihan cara-cara itu
adalah kemiripannya dengan cara masuk agensia toksis
tadi ke dalam tubuh.
Durasi perlakuan disesuaikan dengan tujuan pengujian.
Untuk pengujian toksisitas perkembangan umum
perlakuan dapat diberikan selama masa kebuntingan.
Dapat juga diberikan perlakuan tunggal 1 kali saja pada
titik waktu spesifik jika yang akan diamati adalah efek
suatu agensia terhadap perkembangan organ tertentu.
Yang paling umum dilakukan adalah pemberian
perlakuan dalam beberapa hari saja, yaitu selama masa
organogenesis (hari ke 6 hingga hari ke 15).
3. Pengamatan.
Meskipun
pengujian
ini disebut uji tokskologi
perkembangan ruang lingkup pengamatan tidaklah
terbatas pada embrio yang sedang berkembang itu saja
melainkan
juga
mencakup
beberapa
bagian
pengamatan terhadap induk.
Induk hewan coba diamati kondisi kesehatannya setiap
hari dan hal-hal khusus seperti adanya gejala
keracunan atau kematian dicatat. Berat badan

ditimbang paling tidak sekali 3 hari. Data berat badan


selain sebagai petunjuk efek toksik terhadap induk juga
digunakan untuk menentukan jumlah pemberian
perlakuan (mg/kg berat badan). Hewan coba dipelihara
dengan baik selama kebuntingan dan selanjutnya
dikurbankan 1 hari sebelum melahirkan (tikus hari ke20/21; mencit hari ke-19). Betina tidak dibiarkan sampai
melahirkan karena jika itu terjadi ia akan memakan
anak-anaknya yang cacat. Hewan uji dibedah caesar
dengan membuat irisan di garis tengah ventral tubuh
mulai dari area bukaan genitalia hingga ke leher.
Rongga perut dan rongga dada dibuka dan organ dalam
tubuh diamati. Uterus diangkat dan ditimbang bersamasama dengan embrio di dalamnya. Selanjutnya uterus
ditempatkan di dalam cairan fisiologis, lalu dibelah dan
embrionya dilepas.
Pada saat ini juga status implantasi dipastikan: fetus
yang berkembang penuh dan merespon sentuhan
dikategorikan fetus hidup; fetus yang berkembang
penuh dan tidak ada tanda-tanda autolisis tetapi tidak
merespon
sentuhan
dikategorikan
fetus
mati;
implantasi yang menunjukkan adanya ciri-ciri fetus
tetapi mengalami autolisis digolongkan sebagai fetus
yang diresorpsi pada tingkat lanjut (late resorption);
implantasi
yang
tidak
menunjukkan
adanya
karakteristik fetus digolongkan pada fetus yang
mengalami resorpsi dini (early resorption). Selanjutnya
ovarium diamati dan jumlah corpora lutea dihitung.
Jumlah corpora lutea umumnya bersesuaian dengan
jumlah implantasi karena corpora lutea adalah petunjuk
folikel yang berovulasi dan berubah menjadi badan
hormonal yang berperan dalam mempertahankan
kebuntingan. Kehilangan sebelum implantasi dapat
dihitung berdasarkan selisih antara jumlah corpora
lutea dengan jumlah implantasi.
Tanda-tanda keracunan induk diamati pada organ-organ
visceral. Kelenjar timus diamati ukuran, warna dan
adanya tanda-tanda hemoragi. Pulmo diamati ukuran,
warna dan jumlah lobusnya, demikian juga hepar
diamati ukuran, warna, tekstur dan jumlah lobusnya.
Lambung dibuka dengan sayatan sepanjang curvatura
besar dan permukaan mukosalnya diamati. Ginjal

diamati bentuk, ukuran, warna dan kelainan yang


mungkin terlihat dari luar, dan selanjutnya dibelah
untuk mengamati struktur internalnya. Tiap-tiap
kelainan
dicatat
dan
sedapat
mungkin
didokumentasikan dengan fotografi dan jaringan yang
mengalami kelainan tersebut difiksasi dengan formalin
atau larutan Bouin dan diproses melalui metode parafin
untuk pembuatan sediaan bagi pengamatan histologis.
Pengamatan fetus dimulai dengan penimbangan berat
badan. Penimbangan hendaknya dilakukan ketika fetus
masih segar (segera setelah uterus dibuka, sebelum
fetus difiksasi). Pengamatan malformasi dimulai dari
daerah kepala. Pertama-tama diperhatikan bentuk dan
ukuran kepala serta adanya tanda-tanda gangguan
penutupan (closure defect). Di kepala harus terdapat 2
tonjolan mata (masih tertutup), 2 nares, 5 papila
fascialis,dan 2 pinnae. Mulut dan bibir diamati ukuran,
betuk dan adanya gangguan perkembangan. Mulut
dibuka untuk mengamati dan memastikan ada tidaknya
celah di langit-langit mulut (cleft palate). Kemudian
aspek ventral dan dorsal tubuh diamati apakah ada
closure defect, dan dilanjutkan dengan pengamatan
tungkai. Pada tungkai diamati ukuran, kelengkapan ruas
dan arah rotasi / fleksi bahu, siku, telapak dan jemari.
Jumlah jemari (masing-masing 5 depan dan 5 belakang)
dihitung dan adanya kelainan pada jumlah ukuran, fusi
atau adanya selaput dicatat. Ekor juga diamati
keberadaan, ukuran dan pembengkokannya. Ekor
selanjutnya diangkat dan jarak antara bukaan anus
dengan genitalia diperkirakan untuk penentuan jenis
kelamin (jarak tersebut sangat dekat pada betina dan
jauh pada jantan). Selanjutnya kira-kira setengah
bagian dari jumlah fetus yang diperoleh difiksasi
dengan alkohol 95 % dan setelah beberapa hari
dieviserasi dan dikuliti. Fiksasi dipertahankan hingga 2
mnggu, kemudian fetus diwarnai dengan Alcian blue
dan Alizarin Red S dan selanjutnya dibuat transparan
dalam gliserin. Dengan teknik ini dapat diamati secara
langsung komponen tulang (merah) dan kartilago (biru)
fetus dan kelainannya. Pengamatan rangka meliputi
adanya hambatan atau percepatan penulangan,
kelainan bentuk dan jumlah komponen rangka. Rangka

diamati mulai dari cranium, sternum, columna


vertebralis, os pectoralis, os pelvis, tulang-tulang
tungkai dan terutama jemari. Jumlah komponen tulang
telapak dan jemari yang telah mengalami penulangan
dihitung. Kelainan struktur komponen rangka yang
sering
teramati
adalah
hambatan
osifikasi,
penambahan atau pengurangan jumlah costae,
centrum vertebra berbentuk kupu-kupu, costae
menggelombang, fusi rusuk, fusi vertebra, tungkai
pekuk dan lain-lain
Cara pemilihan
Mencit
Bila dibutuhkan hewan coba dalam jumlah banyak, misalnya
pada evaluasi terhadap toksisitas akut dan kemampuan
karsinogenik, maka hewan yang paling sesuai untuk itu
adalah mencit. Kekurangannya adalah kesulitan memperoleh
darah dalam jumlah yang cukup untuk rangkaian
pemeriksaan hematologi.
Tikus
Tikus tampaknya merupakan spesies ideal untuk uji
toksikologi karena berat badannya dapat mencapai 500 gram
sehingga lebih mudah dipegang, dikendalikan atau dapt
diambil darahnya dalam jumlah yang relative besar.
Ciri-ciri morfologi Rattus norvegicus antara lain memiliki :
berat 150-600 gram, hidung tumpul dan badan besar dengan
panjang 18-25 cm, kepala dan badan lebih pendek dari
ekornya, serta telinga relatif kecil dan tidak lebih dari 20-23
mm (Depkes 2011).
Menurut Besselsen (2004)
taksonomi tikus adalah:
Kingdom : Animalia
Filum : Chordata
Subfilum : Vertebrata
Kelas : Mamalia
Subkelas : Theria

dan

Depkes

(2011)

Ordo : Rodensia
Subordo : Sciurognathi
Famili : Muridae
Subfamili : Murinae
Genus : Rattus
Spesies : Rattus norvegicus
Ada dua sifat utama yang membedakan tikus dengan hewan
percobaan
lainnya, yaitu tikus tidak dapat muntah karena struktur
anatomi yang tidak lazim pada tempat bermuara esofagus ke
dalam lambung sehingga mempermudah proses pencekokan
perlakuan menggunakan sonde lambung, dan tidak
mempunyai kandung empedu (Smith dan Mangkoewidjojo
1988).

Selain itu, tikus


hanya mempunyai kelenjar keringat di
telapak kaki. Ekor tikus menjadi bagian badan yang paling
penting untuk mengurangi panas tubuh. Mekanisme
perlindungan lain adalah tikus akan mengeluarkan banyak
ludah dan menutupi bulunya dengan ludah tersebut (Sirois
2005).

Terdapat tiga galur atau varietas tikus yang memiliki


kekhususan tertentu yang biasa digunakan sebagai hewan
percobaan yaitu (Malole dan Pramono 1989) :
- galur Sprague dawley berwarna albino putih, berkepala
kecil dan ekornya lebih panjang dari badannya,
- galur Wistar ditandai dengan kepala besar dan ekor yang
lebih pendek, dan
- galur Long evans yang lebih kecil daripada tikus putih dan
memiliki warna hitam pada kepala dan tubuh bagian
depan.
Tikus yang
digunakan dalam penelitian adalah galur
Sprague Dawley berjenis kelamin jantan berumur kurang
lebih 2 bulan. Tikus Sprague Dawley dengan jenis kelamin
betina tidak digunakan karena kondisi hormonal yang sangat
berfluktuasi pada saat mulai beranjak dewasa, sehingga
dikhawatirkan akan memberikan respon yang berbeda dan
dapat mempengaruhi hasil penelitian (Kesenja 2005). Tikus
putih galur ini mempunyai daya tahan terhadap penyakit
dan cukup agresif
dibandingkan dengan galur lainnya
(Harkness dan Wagner 1983).
Anjing
Anjing dengan bulu pendek dan berat sekitar 12 kg paling
sesuai untuk uji toksikologi. Umur paling baik dipakai adalah
14-16 minggu, sementara dibutuhkan 4 minggu untuk
adaptasi dengan lingkungan yang baru.
Primata
Pengguanaan kera lebih menguntungkan dibandingkan
pemakaian hewan-hewan lain, terutama dalam hal berat
badan dan postur tubuhnya yang menyerupai manusia.
Postur seperti ini memungkinkan untuk mencatat observasi
penting terutama bila neurophaty perifer merupakan
manifestasi toksik. Kerugiannya perlu banyak hewan yang
dibutuhkan untuk uji fertilitas karena produktivitasnya
rendah.
(Kusumawati.2004.Bersahabat dengan hewan
coba.Yogyakarta:Gadjah Mada University

Press) dan
http://repository.ipb.ac.id/bitstream/handle/123
456789/56395/Bab%20II%20Tinjauan
%20Pustaka.pdf?sequence=4

Metode uji
Desain penelitian :
Variabel tunggal :
Pra eksperimental design/ non design
: one shot case study satu
kelompok diberi treatment kemudian
diobservasi hasil. One group pre test
post test design : dibandingkan pre
dan post perlakuan. Intact group
comparison design : satu kelompok
dibagi 2, kontrol dan perlakuan.
True eksperimental design : variabel
luar bs dikontrol. Validitas interna
tinggi. Ciri : sampel random, ada
kontrol dan perlakuan.
- Post test only control design : 2
kelompok dirandom
- Pre post control group
- The Solomon four group : salah
satu dipilih random kemudian 2
grup diberi pre test, yg 2 tanpa pre
test. 2 grup yg diberi pre test
diambil 1. Grup yg tanpa pre test
diambil 1. Diberi perlakuan. Hasil
ke empatnya di post test.

Eksperimental quasi design


- Time design series
- Non equivalent control group

- Counter balance design


Parameter