04/05/2016

A Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) - University of Queensland Diamantina Institute - The University of Queensland, Austrlia

A Universidade de Queensland

Universidade de Queensland Diamantina Instituto

A Reaco em Cadeia da Polimerase (PCR)

A reao em cadeia da polimerase uma tcnica que revolucionou a biologia molecular desde o seu
desenvolvimento no incio de 1980. Ela permite que os investigadores a amplificar pequenas quantidades de ADN a
quantidades que podem ser utilizadas para anlise. Alguns dos usos para as quais foi solicitada PC R incluem:
Diagnstico de doenas, em que o agente causador de uma doena identificado pelo seu ADN . Isto
particularmente til quando os agentes de doenas so difceis de cultivar em cultura ou esto presentes em
nveis baixos numa amostra
Investigaes forenses, em que quantidades vestigiais de ADN encontradas em cenas de crime (por ex. No
cabelo, tecido ou fluidos corporais) pode ser amplificado at um nvel que permite que sejam analisados
utilizando mtodos como o ADN de perfis. De PC R pode tambm ser utilizada em outras reas em que a
quantidade de ADN recuperado muito pequeno ou danificado (por exemplo. Arqueologia)
A engenharia gentica, em que os genes so introduzidos em novas espcies - para fazer isso, o material
gentico a ser introduzido deve ser em quantidade suficiente para assegurar a eficincia de transformao do
hospedeiro celular
PC R depende de um nmero de caractersticas do ADN de molcula:
A estrutura do DNA consiste de duas fitas de cadeias de molculas chamadas nucleotdeos . C ada um
destes nucletidos consiste num grupo fosfato, um acar (desoxirribose) e um de quatro bases contendo
azoto (adenina, timina, guanina ou citosina). C ada fio corre no sentido oposto para o outro (isto . Que so
anti-paralelo ), apenas com certas bases encontrando-se opostas uma outra (uma adenina sempre
oposto uma timina e uma guanina est sempre de frente para uma citosina). Isto significa que as duas
cadeias so complementares uns aos outros na ordem das suas bases.
As duas cadeias de ADN so mantidas juntas por ligaes de hidrognio entre nucletidos pares de bases. As
ligaes de hidrognio so muito mais fracas do que as ligaes covalentes que ligam individuais nucleotdeos
dentro de um fio e pode ser interrompido por aquecimento do DNA . Portanto, pode-se separar as duas
cadeias de ADN sem quebrar o DNA strands para baixo por meio de aquecimento a cerca de 95 C - este
processo chamado de desnaturao .
Os iniciadores so sequncias curtas de complementar de ADN que se ligam a certos nucletidos
sequncias ao longo do ADN de cadeia. Eles tendem a ligar-se ao individuais de ADN fios a temperaturas
mais elevadas do que toda a cadeia complementar. Isto significa que, se a temperatura arrefecida desde 95
C a cerca de 50-60 C , os iniciadores ligar-se s cadeias simples antes de as cadeias inteiras
complementares fazer. Este processo chamado de recozimento .
A produo de uma nova cadeia complementar de ADN usando um nico fio realizada por uma classe de
enzimas chamadas polimerases . Estas enzimas comear por ligao aos iniciadores e, em seguida,
estender os iniciadores por adio de novos nucletidos extremidade 3 ', utilizando a cadeia simples de ADN
como um modelo.
A maioria das polimerases funcionar melhor s temperaturas que as clulas operam em (por exemplo. 37 C
para humanos clulas ). No entanto, a esta temperatura, a maior parte de toda a cadeias complementares
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tambm recolocar e interferem com a funo da polimerase (em clulas , o ADN de cadeia mantido
desenrolado durante a replicao por enzimas , tais como helicase). H alguns organismos que operam a
temperaturas muito mais elevadas - Thermus aquaticus uma bactria que vive em ebulio fontes termais.
As polimerases que utiliza operam melhor em torno de 72 C . Por conseguinte, estas enzimas podem ser
usadas para assegurar que os cordes so mantidos separados durante o processo de extenso.
PC R usa essas caractersticas para fazer cpias de DNA - basicamente, um despojado-down in vitro verso dos
mtodos que as clulas -se usar para copiar o seu prprio DNA .
Uma tcnica de PC R necessita dos seguintes reagentes:
Um ADN da amostra, que actua como o modelo no qual o novo ADN ser construdo
4 trifosfatos desoxirribonucleido (trifosfato de adenosina, guanosina trifosfato, trifosfato de timidina e
trifosfato de citidina) - estes so os "blocos de construo" a partir da qual os novos DNA sero feitos
molculas
Polimerase Taq, polimerase ou semelhante enzima , que opera melhor a temperaturas elevadas
2 Os iniciadores (directo e inverso) para iniciar o processo de replicao. Estes iniciadores foram concebidos
para serem complementares aos nucletidos sequncias no incio e no final da seco de ADN que queremos
para amplificar
Tampes e sais para criar as condies corretas para a enzima para funcionar
Um monte de trabalho tem de ir
para

projetar

os

primers

Em

primeiro lugar, precisamos saber a

sequncia da seo do DNA que
esto querendo para amplificar, em
particular o "comeo" (5 ') e "fim"
(3') da sequncia. Os

iniciadores

devem ser concebidos de modo a

que sejam complementares a uma
sequncia nica de nucletidos "a
montante" e "a jusante da sequncia
de

interesse.

corresponder

Eles
a

no

uma

podem

sequncia

dentro da rea de interesse (ou a

PC R vai comear tarde demais e perder uma parte da rea que queremos amplificar), e eles tambm no devem ter
regies complementares dentro de si (ou eles vo dobrar sobre e se ligam para si, formando um "gancho de
cabelo". por ltimo, a frente e reverso iniciadores no deve ser complementar, ou que ir hibridar com o outro e
formar um "dmero de primer". podemos evitar a maioria destes problemas usando iniciadores de 15-20 nucletidos
de comprimento (note que os exemplos nos diagramas abaixo usam 5 nucleotdeos primers para a simplicidade que no iria us-los em uma reaco PC R real.
Diferentes protocolos tm de ser desenvolvida para cada procedimento de PC R, de acordo com os iniciadores
utilizados, o comprimento do molde de ADN ou do tipo de polimerase envolvido. No entanto cada protocolo tem as
seguintes etapas bsicas:

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Estes passos so repetidos entre 25 e 35 vezes, com a quantidade de ADN de cerca de duplicao de cada vez. Isso
pode no parecer muito, mas depois de 35 ciclos, um DNA molcula poderia, teoricamente, produzir em excesso de
34,359,738,370 molculas (2 de 35 ).

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Quando PC R foi desenvolvido pela primeira vez, os cientistas tiveram que mudar a temperatura manualmente,
trocando as amostras entre tanques de imerso mantido apenas na temperatura certa. No entanto, agora eles usam
mquinas cycler PC R que aquecem e amostras frescas precisamente e automaticamente.
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A melhor maneira de aprender sobre como funciona PC R para v-lo em ao. Visite O Dolan DNA Learning C entre
e assistir a animao de Reaco em C adeia da Polimerase (nota: isto abre para um site externo).
Voc tambm pode querer ouvir "de Biorad msica PC R " (nota: isso abre para o You Tube - o site pode no estar
disponvel para alguns usurios).

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