Anda di halaman 1dari 3

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN


Pada praktikum kali ini yang berjudul Isolasi DNA Tanaman dan Elektroforesis
bertujuan untuk mengetahui cara mengisolasi DNA tanaman, memahami prinsip kerja dan
kegunaan elektroforesis, serta untuk memahami cara memisahkan asam-asam nukleat dan
molekul protein dengan menggunakan pelaratan elektroforesis. Praktikum isolasi DNA tanaman
dilaksanakan pada Jumat, 25 November 2016 dan Elektroforesis dilaksanakan pada tanggal
Jumat, 9 Desember 2016. di Laboratorium Biologi Dasar FMIPA UNY.
Ekstraksi atau isolasi pada dasarnya adalah pemisahan DNA dari bahan-bahan yang tidak
dikehendaki. Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses
isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan
RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan
tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan
cepat. Isolasi DNA tanaman pada praktikum ini menggunakan metode Orozco-Castillo yang
sudah di modifikasi. Metode ini banyak digunakan untuk isolasi DNA tanaman karena mudah
dan kemungkinan adanya enzim pendegradasi DNA lebih kecil dibandingkan dengan metode
yang lain (Rogers & Bendich, 1994). Isolasi dari organisme eukariotik biasa dilakukan melalui
proses penghancuran sel (lysis), pemusnahan protein dan RNA, serta pemurnian DNA.
Metode isolasi diawali dengan penyiapan alat dan bahan yang diperlukan dalam isolasi
DNA. Adapun alat-alat yang diperlukan adalah neraca analitik, mortar dan penggerus, pipet tetes,
gelas ukur 10 ml, waterbath, thermometer, sentrifus, mikropipet dan tip, sarung tangan lateks,
inkubator dan lemari pendingin sedangkan bahan-bahan yang diperlukan adalah sampel daun,
PVP, buffer ekstraksi (CTAB), larutan chloroform : isoamilalkohol (CI), isopropanol dingin,
alkohol 70%, dan aquadest. Selanjutnya, menimbang sebanyak 0,50 gram daun tanaman (dalam
kelompok ini menggunakan daun melati bintang (Jasminum multiflorum)) di neraca analitik.
Sebelum ditimbang, daun dicuci terlebih dahulu supaya terhindar dari kotoran-kotoran yang
melekat di daun maupun hewan-hewan kecil yang dapat mempengaruhi hasil isolasi DNA.
Pemilihan daun untuk isolasi DNA diutamakan yang masih muda, agar mudah pada saat
pemecahan selnya. Setelah ditimbang, daun digerus menggunakan mortar dan penggerus untuk
membantu memecahkan dinding sel secara mekanik. Penambahan PVP kurang lebih 0,1 gram
dan 5 ml buffer (CTAB) dituangkan sedikit demi sedikit pada proses penggerusan. Selama proses

isolasi DNA, praktikan menggunakan sarung tangan lateks supaya tetap steril. Penambahan PVP
saat penggerusan dan CTAB bertujuan untuk menghambat enzim polifenol oksidase yang dapat
mendegradasi rantai DNA dan menyebabkan teroksidasinya senyawa fenol. Suatu detergen
kationik yang terdapat dalam buffer ekstraksi yaitu CTAB berfungsi membantu proses
pemecahan membrane sel. Terjadinya oksidasi ditandai dengan terbentuknya warna coklat pada
jaringan tanaman yang akan diisolasi.
Setelah daun tergerus halus atau larut, campuran tersebut dimasukkan kedalam tabung 15
ml dan dilanjutkan pengocokan secara bolak balik. Selanjutnya campuran dipanaskan selama 30
menit pada suhu 65oC di waterbath. Adapun pengecekan suhu dilakukan menggunakan
thermometer. Pemanasan ini, dilakukan karena CTAB yang memiliki kemampuan melisis
membrane sel akan aktif pada kondisi panas (65oC). Larutan detergen berfungsi untuk
menurunkan tegangan permukaan cairan dan melarutkan lipid sehingga membrane sel
mengalami degradasi dan organel-organel didalamnya dapat keluar dari sel. Isolasi DNA dari
tanamn sering menghasilkan ekstrak yang mengandung polisakarida. Penambahan CTAB yang
bermuatan positif, juga berfungsi untuk memisahkan polisakarida dari DNA dengan cara
mengikat DNA yang bermuatan negatif.
Usai proses pemanasan selama 30 menit, larutan ekstrak buffer dibiarkan dingin pada
suhu kamar, kemudian ditambahkan 5 ml larutan Chloroform : Isoamilalkohol (CI) lalu dikocok
bolak-balik. Larutan di sentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 3.500 rpm. Dengan proses
sentrifugasi, komponen campran yang lebih rapat akan bergerak menjauh dari sumbu sentrifuga
dan membentuk endapan (pellet) dan menyisakan supernatan yang dapat diambil dengan
dekantasi. Setelah proses sentrifugasi, akan terbentuk lapisan-lapisan yang berwarna hijau
kecoklatan dengan tekstur berlendir. Adanya indicator berupa warna kecoklatan dan tekstur yang
berlendir dimungkinkan terdapat kontaminasi zat-zat lain dari daun, seperti polisakarida,
fenol,protein, dsb (Rogers & Bendich, 1994). Lapisan paling atas yaitu supernatan, dibawahnya
terdapat lapisan debris, dibawah lapisan debris terdapat lapisan resin, dan lapisan terakhir yaitu
chloroform. Lapisan atas diambil menggunakan pipet kedalam tabung baru dan ditambahkan
isopropanol dingin sebanyak 1 volume (4 ml). Pada saat pengambilan lapisan ini, dilakukan
secara hati-hati agar tidak terkontaminasi oleh lapisan yang ada dibawahnya. Setelah lapisan
teratas diambil, kemudian dikocok perlahan hingga homogen. Penambahan isopropanol
bertujuan untuk purifiksi atau menghilangkan DNA/ molekullain yang terkontaminasi. Jika telah

homogen, kemudian disimpan dalam kulkas (4 oC) selama 30 menit, lalu disentrifus 15 menit
dengan kecepatan 3.500 rpm.
Setelah sentrifugasi, terbentuk cairan dengan 2 lapisan yaitu lapisan atas supernatan dan
lapisan dibawahnya yang disebut pellet. Pellet yang terbentuk dari isolasi daun melati bintang,
terdapat lapisan tipis seperti selaput yang berwarna hitam. Lapisan berwarna hitam tersebut
dimungkinkan adalah kontaminan protein yang berasal dari daun. Cairan atau supernatan
selanjutnya dibuang dan pellet DNA dibilas dengan alkohol 70%, kemudian disentrifugasi 10
menit dengan kecepatan 3.500 rpm. Cairan atau supernatan yang terbentuk dari hasil
sentrifugasi, dibuang dan DNA dikeringkan dengan cara membalikkan tabung. Kemudian, pellet
dimasukkan kedalam incubator hingga pellet kering. Setelah itu, pellet DNA dilarutkan dalam 1
ml aquadest . Setelah pellet larut, pellet dimasukkan kedalam tabung ependorf dan disimpan
dalam lemari pendingin sampai digunakan. Untuk mengetahui ada tidaknya DNA, dapat diuji
dengan elektroforesis gel agarose 1,2 %.
Daftar pustaka:
Roger, S.O.dan A.J. Bendich.1994. Extraction of Total Cellular DNA from Plant, Alage, and
Fungi. Molecular biology Manual.
Surzycki, S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. New York: Springer-Verlag.