Anda di halaman 1dari 20

Praktikum : ELISA

Posted by : Mifa Nurfadila Kamis, 26 Februari 2015


http://mifa-s.blogspot.co.id/2015/02/praktikum-elisa.html

ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY


Abstrak

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) merupakan teknik penapisan imunologis yang


memanfaatkan ikatan spesifik antara antibodi dan antigen. ELISA dapat dibagi menjadi tiga yaitu Direct
ELISA, Indirect ELISA, dan Sandwuch ELISA. Praktikum ELISA yang dilakukan yaitu indirect ELISA. Teknik
tersebut merupakan teknik yang paling sederhana. Tujuan dilakukanya praktikum ELISA yaitu agar dapat
memahami prinsip kerja ELISA, mengetahui konsentrasi antibodi dalam sampel dengan teknik ELISA, dan
menentukan tingkat proteksi terhadap penyakit dari hasil pengolahan data ELISA. Penerapan ELISA antara lain
untuk mengidentifikasi paternitas, diagnotis suatu penyakit, dan menghitung konsentrasi sampel. Hasil
praktikum yang didapat dari pengolahan data menunjukan bahwa sampel target adalah negatif.

Kata kunci: antibodi, antigen, dan ELISA.


I.
Pendahuluan
Praktikum biologi molekuler diawali dari isolasi DNA untuk memisahkan DNA dari sel suatu individu.
Selanjutnya dilakukan proses spektrofotometri untuk mengetahui kemurnian DNA tersebut. Tahap selanjutnya
yaitu amplifikasi dengan teknik PCR. DNA kemudian dielektroforesis dengan tujuan untuk memisahkan
DNAdari RNA dan pengotor lain. Tahap berikutnya yaitu digesti untuk memotong sekuen DNA spesifik yang
diinginkan. kemudian dilakukan sequencing. Dari semua tahapan yang dilakukan, masih terdapat satu langkah
lagi yaitu ELISA yang berguna untuk mengetahui jumlah atau konsentrasi sampel yang didapat.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan suatu teknik biokimia untuk mendeteksi
kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi
dengan spesifitas untuk antigen tertentu. ELISA terdiri atas tiga macam yaitu Direct ELISA, Indirect ELISA, dan
Sandwich ELISA (Baker dkk. 2007: 211).
Direct ELISA merupakan jenis ELISA yang digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi suatu
antigen. Antigen yang akan dideteksi akan berikatan langsung (direct) dengan antibodi detector (antibodi yang
telah dilabeli oleh enzim reporter). Antibodi yang digunakan pada teknik direct ELISA berjumlah satu buah.
Kelebihan dari direct ELISA yaitu Cepat dan tidak terdapat Cross Reaksi dengan antibodi sekunder. Akan
tetapi, direct ELISA memiliki kekurangan yaitu harga pelabelan antibodi primer yang mahal, tidak ada
fleksibilitas pemilihan antibodi primer, dan sinyal amplifikasinya sedikit (Walker & Rapley 2008: 668).
Indirect ELISA merupakan jenis ELISA yang digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi
antigen atau antibodi. Teknik tersebut memiliki karakteristik yaitu antigen tidak menempel langsung pada
antibodi detector (indirect). Antigen akan berikatan dengan antibodi lain terlebih dahulu. Antibodi tersebut
kemudian akan berikatan dengan antibodi yang telah dilabeli. Kelebihan indirect ELISA yaitu memiliki
sensitivitas tinggi dan sinyal amplifikasi yang tinggi. Kekurangan indirect ELISA yaitu membutuhkan waktu
yang lama dan terjadi cross reaksi terjadi (Walker & Rapley 2008: 669).
.
Sandwich ELISA merupakan jenis ELISA yang dapat digunakan untuk mengukur antigen maupun
antibodi,. Karakteristik khas dari sandwich ELISA adalah menggunakan antibodi penangkap atau primer

antibodi. Antigen yang akan dideteksi dan diukur konsentrasinya berikatan terlebih dahulu dengan antibodi
penangkap. Antigen akan berikatan kembali dengan antibodi sesuai jenis sandwich ELISA yang digunakan.
Sandwich ELISA dibagi menjadi dua jenis yaitu sandwich direct ELISA dan sandwich indirect ELISA
(Crowther 1995: 39 43).
Sandwich direct ELISA menggunakan dua antibodi yaitu antibodi penangkap dan antibodi yang dilabeli
enzim. Antigen yang telah berikatan dengan antobodi penangkap akan berikatan kembali dengan antibodi yang
dilabeli enzim. Sandwich indirect ELISA menggunakan tiga antibodi yaitu antibodi penangkap, antibodi
detektor, dan anti-antibodi yang dilabeli enzim. Antigen yang telah berikatan dengan antibodi penangkap akan
berikatan dengan antibodi detektor dan anti-antibodi yang dilabeli enzim (Crowther 1995: 39). Antigen dalam
sandwich ELISA tidak perlu dimurnikan sebelum digunakan. Sandwich ELISA sangat spesifik sehingga tidak
semua antibodi dapat digunakan.
Contoh aplikasi terapan menggunakan teknik ELISA adalah mendeteksi dan menghitung jumlah antibodi
virus HIV. Antigen (virus HIV) akan ditangkap oleh antibodi reseptor di dalam tubuh. Selanjutnya antigen akan
berikatan dengan anti-antibodi di dalam tubuh yang terdapat enzim dan akan memberikan sinyal kepada tubuh.
II.

Metodologi

Alat yang digunakan dalam prktikum ELISA antara lain adalah ELISA reader, ELISA washer, well
plate, dan mikropipet beserta tips. Bahan yang digunakan antara lain blocking buffer, washing buffer, antigen,
antibodi monoklonal, dan suatu substrat.
Cara kerja praktikum ELISA adalah sebagai berikut. Pertama, well plate dilapisi dengan antibodi
penangkap. Kedua, well plate dicuci dengan menggunakan washing buffer. Ketiga, antigen diberikan pada
well plate dan well plate kemudian dicuci dengan menggunakan washing buffer. Keempat, well plate diberi
antibodi detektor dan well plate kembali dicuci menggunakan washing buffer. Kelima, anti-antibodi yang
dilabeli enzim ditambahkan pada well plate dan well plate kembali dicuci menggunakan washing buffer.
Keenam, substrat dimasukkan agar enzim dapat berikatan dan memberikan sinyal terhadap keberadaan antigen
(GenScript 2010 : 3).
III.

Hasil dan Pembahasan

Antigen merupakan molekul yang menginduksi respon sistem imun atau molekul yang akan dikenali
oleh sistem imun yang spesifik. Antibodi merupakan protein-protein yang terbentuk sebagai respon terhadap
antigen yang masuk ke tubuh dan bereaksi secara spesifik dengan antigen tersebut (Rao 2001 : 1). Antigen dan
antibodi dapat dideteksi dengan menggunakan teknik ELISA.
Jenis ELISA yang dilakukan dalam praktikum adalah indirect sandwich. penambahan antibodi
penangkap ke dalam well plate bertujuan untuk melapisi dasar well plate dengan antibodi agar dapat mengikat
antigen. Pencucian dengan menggunakan washing buffer bertujuan untuk menghilangkan antibodi penangkap
yang tidak sesuai dan tidak dapat berikatan dengan antigen target. Washing buffer juga digunakan untuk
membersihkan antigen yang tidak berikatan dengan antibodi penangkap. Penambahan well plate dengan
antigen bertujuan agar antigen dapat berikatan dengan antibodi penangkap dan dapat di deteksi. Well plate
kemudian dicuci kembali dengan menggunakan washing buffer agar antigen yang tidak sesuai dengan antibodi
penangkap dapat hilang sehingga hanya terdapat antigen sesuai target. Penambahan antibodi detektor bertujuan
sebagai penghubung antara antigen dengan anti-antibodi yang di labeli dengan enzim (Crowther 1995: 41 42).
Anti-antibodi yang dilabeli dengan enzim tidak dapat berikatan langsung dengan antigen.
Pencucian dengan washing buffer kembali dilakukan dengan tujuan agar anti-antibodi yang tidak berikatan
dengan antibodi detektor dapat terbuang. Selanjutnya adalah penambahan anti-antibodi yang dilabeli enzim.
Hal tersebut bertujuan agar enzim dapat memberikan sinyal yang menandakan bahwa terdapat antigen. Enzim
tersebut harus berikatan dengan suatu substrat agar dapat memberikan sinyal tersebut dengan cara terjadinya

perubahan warna. Selanjutnya hasil konsentrasi antigen dapat dibaca dengan menggunakan ELISA reader
(Crowther 1995: 41 42).
Hasil dari proses ELISA terdiri dari dua bentuk yaitu kualitatif dan kuantitatif. Hasil secara kualitatif
adalah perubahan warna pada well plate yang mengindikasikan bahwa terjadi reaksi yang spesifik antara
antigen dengan antibodi. Perubahan warna tersebut dihasilkan oleh reaksi antara substrat dengan enzim yang
terdapat di anti-antibodi. Hasil secara kuantitatif berupa besaran konsentrasi dan nilai adsorbsi (y) pada sampel.
Pengukuran y pada hasil ELISA menggunakan mesin ELISA reader yang pronsipnya sama dengan mesin
spektrofotometer. Intensitas cahaya yang diserap oleh sampel pada panjang gelombang tertentu berbanding
lurus dengan besar nilai y. Jika semakin banyak intensitas cahaya yang diserap, maka semakin besar nilai y.
Semakin kecil nilai intensitas cahaya yang diserap oleh sampel, semakin kecil pula nilai y (Crowther 2001: 10).
.
----------Grafik 1.1--------Persamaan kurva regresi serum standar adalah y= - 0,400x + 1,729. Variabel y menyatakan nilai
adsorbsi sedangkan variabel x merupakan nilai yang dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi antibodi
atau antigen target. Nilai x dapat diperoleh dengan memasukkan nilai y pada persamaan tersebut. Nilai x yang
didapat dapat digunakan untuk mencari konsentrasi (C) dengan C = log -1 x. Berdasarkan pengolahan grafik,
konsentrasi yang didapat berbanding terbalik dengan nilai x. Semakin besar nilai x, semakin kecil nilai
konsentrasi dan sebaliknya. Hal tersebut terlihat dalam grafik 1.1. tanda panah menunjukan puncak C, x , dan y.
Nilai konsentrasi antibodi yang didapat berada di bawah 0,35. Hal tersebut menunjukan bahwa sampel tersebut
adalah negatif.
IV.

Kesimpulan

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah metode uji imunitas atau keberadaan dan
konsentrasi suatu protein penyusun antigen berdasarkan reaksi antara antibodi dan antigen itu sendiri. Teknik
tersebut tidak hanya dapat digunakan untuk mendeteksi antigen, tetapi dapat digunakan untuk mendeteksi
antibodi di dalam tubuh. Prinsip kerja dari teknik ELISA adalah berdasarkan reaksi spesifik antara antibodi dan
antigen dengan menggunakan enzim sebagai penanda (marker). Enzim tersebut akan memberikan suatu tanda
terdapatnya suatu antigen jika antigen tersebut sudah bereaksi dengan antibodi. Reaksi tersebut memerlukan
antibodi spesifik yang berikatan dengan antigen.
Konsentrasi antigen dan antibodi dalam suatu sampel dapat diketahui dengan menggunakan tabel, kurva
standar, dan perhitungan persamaan linearnya. Berdasarkan perhitungan yang dilakukan, konsentrasi
berbanding terbalik dengan nilai x. Nilai konsentrasi yang didapat sangat kecil yaitu dibawah 0,35. Oleh karena
itu, dapat disimpulkan bahwa sampel adalah negatif.
V.

Daftar Acuan

Enzyme-Linked Immune-Sorbent Assay atau ELISA


http://wanenoor.blogspot.co.id/2012/11/metode-elisa-enzyme-linked-immune.html#.VlZL3176fIU
Enzyme-Linked Immune-Sorbent Assay atau ELISA atau yang sering sebut uji kekebalan enzimatis. ELISA
relatif murah dan lebih aman dibanding RIA (radio Immuno Assay) yang menggunakan bahan radiokatif dan
dapat dikerjakan di laboratorium kecil tanpa alat pemecah radioaktif gamma. Metode ELISA (enzym-linked
immunosorbent assay) metode dalam penelitian dengan Berdasarkan : Ikatan spesifik antara antigen (Ag)
antibody(Ab).
ELISA dipakai untuk pengujian semua antigen, hapten atau antibody. Paling banyak dipakai di laboratorium
klinis, misalnya uji immunoglobulin G dan E, hormone seperti insulin, esterogen dan gonadotrofin.
Antibody yaitu Antibodi disekresi oleh Sel Plasma (Sel B), Biasanya digunakan monoklonal Antibody karena
lebih spesifik untuk epitop tertentu daripada policlonal antibodi. Dapat dibeli terpisah atau dalam paket ELISA
Kit, biasanya diproduksi dengan cara induksi respon imun humoral pada hewan coba ( rat, mouse) dengan cara
injeksi Antigen berulang, dilakukan ekstraksi sel dan purifikasi Ab. Dapat juga diekstraksi dari manusia yang
telah diimunisasi dengan Ag tertentu.
Terdapat 2 Teknik Metode ELISA
Teknik Kualitatif adalah Berdasarkan bahwa tiap antibodi berikatan pada antigen yang spesifik.
Teknik kuantitatif berdasarkan jumlah ikatan antigen-antibodi yang ditentukan dengan nilai absorbansi.
Teknik ini menggabungkan spesifitas antibody dengan kepekaan uji enzymatis dengan spektrofotometer biasa
atau antigen dilekatkan pada enzyme yang mudah ditera.
Beberapa type ELISA, sebagai berikut :
1. Direct ELISA, biasanya digunakan dengan kompetisi dan Inhibisi ELISA. Digunakan untuk deteksi
antigen.
2. Indirect ELISA, antigen terikat pada plate. Digunakan untuk deteksi antibody.
3. Sandwich ELISA, antibodi terikat pada Plate. Digunakan untuk deteksi antigen.
4. Capture ELISA, antihuman antibodi terikat pada Plate. Digunakan untuk deteksi antibody.
ELISA dapat dipakai untuk pengujian antigen lewat cara persaingan (kompetitip) atau cara antibody ganda
(double antibody). Cara Persaingan. Campuran dari antigen yang dilekatkan pada enzim yang diketahui
jumlahnya dengan antigen tanpa enzim yang belum diketahui jumlahnya, direaksikan dengan antibody yang
dilekatkan pada permukaan padat. Setelah reaksi selesai membentuk kompleks lalu dicuci, kemudian
ditambahkan substrat yang cocok untuk enzim dan aktivitas enzim diukur. Sejumlah antigen yang belum
diketahui jenisnya direaksikan dengan antibody tertentu yang dilekatkan pada permukaan padat, dicuci dan
direaksikan dengan antibody berenzim. Setelah dicuci lagi, ditambahkan substrat enzim khusus. Aktivitas
enzim yang diuji dengan cara biasa menunjukkan jumlah antigen yang ada. Antiserum yang dicurigai,
direaksikan dengan antigen khusus yang dilekatkan pada bahan padat,kemudian dicuci. Selanjutnya direaksikan
dengan antibody yang bersifat anti-immunoglobulin berenzim yang akan melekat pada antibody yang tadi
tererap dari anti serum mula-mula. Kompleks yang terjadi dicuci, ditambahkan substrat, aktivitas enzim sesuai
jumlah antibody pada serum mula-mula.
Beberapa bahan yang digunakan dalam teknik ELISA, yaitu :
1. Bahan padat yang dipakai dalam ELISA termasuk selulosa, dextran berangkai silang, poliacrilamide,
polistiren dan polipropilen. Bentuknya dapat berupa butiran, lempeng atau tabung.

2. Antigen dapat dilekatkan secara adsorpsi pasif atau diikat secara kovalen dengan sianoben-bromida.
3. Enzim dipilih yang aktivitasnya tinggi misalnya fosfatse alkalis dan peroksidase. Bahan pengabung
yang sering dipakai adalah glutaraldehide.
4. Substrat paling baik jika stabil, aman dan murah. Substrat tidak berwarna yang menjadi berwarna karena
perubahan oleh enzim. Misalnya : p-nitrofenilfosfat berubah menjadi p-nitrofenol berwarna kuning oleh
enzim fosfatase alkalis. Substrat lain, misalnya diamino benzidine,5-aminosalisilat, O-fenilen-diamin
dipakai untuk enzim peroksidase.
Material dalam metode ELISA

AntigenM

onoclonal Ab

Microplate

Blocking Buffer

Serum sample

Conjugate (secondary Ab + Enzyme)

Subtrate

Stop Sol.

Alat yang digunakan dalam metode ELISA

96-Wells Microplate

Micropipettes

Multichannel pipette

Elisa test kit

TEKNIK ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)


TEKNIK ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Makhyan Jibril A*
* Pendidikan Master Biomedik, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya
http://makhyanjibril.blogspot.co.id/2012/03/teknik-elisa-enzyme-linked.html
1. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
ELISA (singkatan bahasa Inggris: Enzyme-linked immunosorbent assay) atau 'penetapan
kadar imunosorben taut-enzim' merupakan uji serologis yang umum digunakan di berbagai
laboratorium imunologi. Uji ini memiliki beberapakeunggulan seperti teknik pengerjaan
yang relatif sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA
diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya

interaksi antigen dengan


antibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan enzim
sebagai pelapor (reporter label) (Lequin, 2005).
1.2. Tujuan
Untuk mengetahui proses dan teknik pelaksanaan ELISA
2. TINJAUAN PUSTAKA
Enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) atau dalam bahasaindonesianya disebut sebagai uji
penentuan kadar imunosorben taut-enzim,merupakan teknik pengujian serologi yang didasarkan
pada prinsip interaksiantara antibodi dan antigen. Pada awalnya, teknik ELISA hanya digunakan
dalam bidang imunologi untuk mendeteksi keberadaan antigen maupun antibodi dalamsuatu
sampel seperti dalam pendeteksian antibodi IgM, IgG, & IgA pada saat terjadi infeksi (pada
tubuh manusia khususnya). Namun seiring dengan perkembangan ilmu pengetahuan, teknik
ELISA juga diaplikasikan dalam bentuk lain termasuk menganalisis kadar hormon yang terdapat
dalam suatu organisme.Secara singkat dapat dikatakan bahwa teknologi ELISA yang
digunakanuntuk
asai
hormon
dalam
cairan
tubuh
adalah
system
competitive enzymeimmunoassay yang analog dengan teknik RIA. Antigen yang berlabel dan
antigenyang tidak berlabel saling bersaing untuk berikatan dengan tapak pengikatanantibodi
yang terdapat dalam jumlah terbatas. Saturasi antibodi terjadi secarasimultan bila semua
reaktan
diinkubasikan
bersama

sama.
Contoh
reaksi
sepertii
ni adalah ELISA untuk mengukur progesteron, estradiol, dan kortisol.
Pengukuran
hormon
kortisol dalam saliva menggunakan teknik ELISA dapat mengetahui tingkat stres yang di alami
oleh organisme (Haussmann et al., 2007).
Teknik ELISA merupakan teknik kuantitatif yang sangat sensitif, penggunaannya
sangat luas,
memerlukan peralatan yang sedikit, reagen yangdiperlukan sudah tersedia dan dijual secara
komersial
dan
sangat
mudah
didapat.
Tes ELISA dapat
digunakan untuk
mendeteksi antigen maupun antibody. Pemeriksaan ELISA dapat digunakan untuk mendeteksi
antibodi dalam tubuh manusia maupun hewan. Terdapat berbagai teknik dalam pemeriksaan
ELISA.Tes ini dapat dilakukan dengan kit yang sudah jadi atau dapat juga dilakukan dengan
menggunakan antigen yang diracik sendiri (Setiawan, 2007).
ELISA
tradisional secara
khusus
memiliki
reporter dan
substrat
yang
menghasilkan beberapa bentuk perubahan
warna yang
dapat diamati untuk mengetahui
kehadiran antigen atau analyte. Bentuk teknik ELISA terbaru seperti teknik flurogenic,electro
chemiluminescent , dan real-time PCR dibuat untuk mengetahui sinyal kuantitatif. Metode ini
dapat memberikan berbagai keuntungan diantaranya sensitifitas yang tinggi dan bersifat
multiplexing (Leng et al , 2008).
3. MATERI DAN METODE
3.1 Bahan yang Digunakan
Antibody anti-uPar, BSA, PBS, Coating Buffer, PBS-Tween, Alumunium foil, Anti-Rabbit igG, TMB,
H2SO4.
3.2. Metode
a. Persiapan Bovin Serum Albumin (BSA) 1 % untuk ELISA
Untuk membuat larutan BSA 1 % sebanyak 10 mL maka dibutuhkan BSA sebanyak
BSA 1 % = 1 gram x 10 mL
100 mL
= 0,1 gram
BSA sebanyak 0,1 gram dilarutkan dengan 10 mL larutan PBS
b. Pembuatan Larutan Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7,4
Larutan PBS dapat dibuat dari KCl sebanyak 0,1 gram, KH 2PO4 sebanyak 0,1 gram, Na Cl
sebanyak 4 gram, dan Na2HPO4.H2O Sebanyak 1,08 gram. Bahan-bahan tersebut dilarutkan
dalam 250 mL akuades steril dan dihomogenkan menggunakan magnetik stirer dalam gelas
kimia 500
mL. pH larutan diatur hingga mencapai 7,4 dengan larutan NaOH 1 M menggunakan pH meter.
Kemudian dipindahkan larutan ke dalam labu ukur 500 mL dan ditambahkan akuades steril
hingga tanda batas.
c. Pembuatan Larutan PBS-Tween

Larutan PBS pH 7,4 sebanyak 200 mL ditambah 1 tetes Tween dengan menggunakan pipet tetes.
Larutan dihomogenkan menggunakan magnetik stirer.
d. Pembuatan Larutan Coating Buffer
Ditimbang 0,159 gram Na2CO3, 0,293 gram NaHCO3, dan 0,02 gram NaN3, kemudian dilarutkan
dalam aquades steril. Diatur PH hingga mencapai 9,6 untuk kemudian ditandabataskan dengan
aquades steril dalam labu ukur 100 mL.
e. Persiapan Blocking Buffer
Untuk membuat larutan ini gunakan PBS sebanyak 10 mL ditambahhkan dengan 0,1 g BSA
f. Teknik ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
5. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan
Berdasarkan data dan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa ELISA bermanfaat
untuk mengukur kadar u-Par melalui prinsip ikatan antigen antibody yang diukur dengan besar
absorbansinya.

DAFTAR PUSTAKA

Jumat, 08 Juni 2012


PEMERIKSAAN ELISA

Sejarah
Sebelum pengembangan ELISA, satu-satunya pilihan untuk melaksanakan immunoassay
adalah radioimmunoassay , teknik menggunakan radioaktif antigen atau antibodi berlabel.
Dalam radioimmunoassay, radioaktivitas memberikan sinyal, yang menunjukkan apakah suatu
antigen tertentu atau antibodi hadir dalam sampel. Radioimmunoassay pertama kali dijelaskan
dalam kertas oleh Rosalyn Sussman Yalow dan Salomo Berson diterbitkan pada tahun 1960.
Sebuah mikrobiologi menggunakan enzim suatu Linked tes Assay (ELISA) immunosorbent, dalam
rangka untuk mengembangkan metode untuk deteksi cepat antigen p24 HIV dalam sampel
darah.
Karena radioaktivitas menimbulkan ancaman kesehatan potensial, alternatif yang lebih
aman itu dicari. Sebuah alternatif yang cocok untuk radioimmunoassay akan mengganti sinyal
non-radioaktif di tempat sinyal radioaktif. Ketika enzim (seperti peroksidase ) bereaksi dengan
substrat yang sesuai (seperti ABTS atau 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine ), perubahan warna
terjadi, yang digunakan sebagai sinyal. Namun, sinyal tersebut harus dikaitkan dengan
keberadaan antibodi atau antigen, yang mengapa enzim harus dihubungkan dengan antibodi
yang sesuai. Proses menghubungkan secara independen dikembangkan oleh Stratis Avrameas
dan GB Pierce. [6] Karena itu perlu untuk menghilangkan antibodi atau antigen terikat dengan
mencuci, antibodi atau antigen harus tetap ke permukaan wadah; yaitu immunosorbent telah
harus dipersiapkan. Sebuah teknik untuk mencapai hal ini diterbitkan oleh Wide dan Jerker
Porath pada tahun 1966. [7]
Pada tahun 1971, Petrus Perlmann dan Eva Engvall di Universitas Stockholm di Swedia,
dan Anton Schuurs dan Bauke van Weemen di Belanda mandiri makalah yang disintesis
pengetahuan ini ke dalam metode untuk melakukan EIA / ELISA.

ELISA (singkatan bahasa Inggris: Enzyme-linked immunosorbent assay)atau 'penetapan


kadar imunosorben taut-enzim' merupakan ujiserologisyangumum digunakan di berbagai
laboratoriumimunologi. Uji ini memiliki beberapakeunggulan seperti teknik pengerjaan
yang relatif sederhana, ekonomis, danmemiliki sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA
diperkenalkan pada tahun 1971oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya
interaksiantigen denganantibodidi dalam suatu sampel dengan menggunakanenzimsebagai
pelapor (reporter label) (Lequin, 2005).
Te k n i k
ELISA
merupakan
teknik
ku a n t i t at i f
yang
sangat
s e n s i t i f , penggunaannya sangay luas, memerlukan peralatan yang sedikit, reagen
yangdiperlukan sudah tersedia dan dijual secara komersial dan sangat mudah didapat.Tes
ELISA dapat digunakan untuk mendetek si antigen maupun antibodiPemeriksaan ELISA
dapat digunakan untuk mendeteksi antibodi dalam tubuhmanusia maupun hewan. Terdapat
berbagai teknik dalam pemeriksaan ELISA.

Metode ELISA (enzym-linked immunosorbent assay)

Metode dalam penelitian dengan Berdasarkan : Ikatan spesifik antara antigen (Ag)
antibody(Ab) terdiri dari :
1. Teknik Qualitatif : Tiap berikatan pada Ag spesifik
2. Teknik Quantitatif : Jumlah Ikatan Ag-Ab ditentukan dengan nilai absorbansi.
Macam sistem metode yang digunakan dalam elisa :
- Direct
- Indirect
- Sandwich
- Capture

METODE PEMERIKSAAN ELISA


ELISA diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk
menganalisis adanya interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan
menggunakan enzim sebagai pelapor. telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang
medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana,
sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi
spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya.
Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi
yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi,
saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks
antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan
berdasarkan besarnya fluoresensi.
Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen
tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu
permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik
(melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain
yang spesifik untuk antigen yang sama, disebut sandwich ELISA). Setelah antigen diimobilisasi,
antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen.
Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi secara
langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara
tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan
protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate
ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan
kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik,
meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih
sensitive.

Prinsip metode ELISA


mereaksikan antibodi dan antigen secara spesifik, perbedaannya ada pada substrat ( zat
yang digunakan untuk mendeteksi suatu hasil reaksi ) yang digunakan. Pada ELISA, hasil reaksi
akan memunculkan warna yang bisa diukur dengan alat yang disebut Colorimetri. Pada
Fluorescence, hasil reaksi berupa pendaran cahaya yang terbaca oleh fluoresensi, sedangkan
pada Chemiluminescence hasil reaksi berupa pendaran kimiawi yang terbaca oleh
Chemiluminescent.

Jenis Pemeriksaan ELISA


Langkah-langkah "tidak langsung" ELISA mengikuti mekanisme di bawah ini:

Sebuah solusi buffer dari antigen yang akan diuji untuk ditambahkan ke setiap sumur dari
lempeng mikro , di mana ia diberi waktu untuk mematuhi plastik melalui interaksi biaya.

Sebuah solusi non-protein bereaksi, seperti bovine serum albumin atau kasein ,
ditambahkan untuk memblokir setiap permukaan plastik di sumur yang masih dilapisi oleh
antigen.

Selanjutnya antibodi primer ditambahkan, yang mengikat secara khusus terhadap antigen
lapisan tes yang baik. Antibodi primer ini juga bisa dalam serum donor akan diuji untuk
reaktivitas terhadap antigen.

Setelah itu, sebuah antibodi sekunder yang ditambahkan, yang akan mengikat antibodi
primer.. Antibodi sekunder ini sering memiliki enzim yang melekat padanya, yang memiliki
efek yang dapat diabaikan pada sifat pengikatan antibodi.

Sebuah substrat untuk enzim ini kemudian ditambahkan. Seringkali, perubahan warna
substrat ini pada reaksi dengan enzim. Perubahan warna menunjukkan bahwa antibodi
sekunder telah terikat antibodi primer, yang sangat menyiratkan bahwa donor memiliki
reaksi kekebalan terhadap antigen uji. Hal ini dapat membantu dalam pengaturan klinis,
dan dalam R & D.

Semakin tinggi konsentrasi antibodi primer yang hadir dalam serum, semakin kuat
perubahan warna. Seringkali spektrometer digunakan untuk memberikan nilai kuantitatif
untuk kekuatan warna.

Enzim bertindak sebagai penguat, bahkan jika hanya sedikit enzyme-linked tetap terikat
antibodi, molekul enzim akan menghasilkan banyak molekul sinyal. Dalam keterbatasan akal
sehat, enzim dapat terus menghasilkan warna tanpa batas waktu, tetapi yang lebih utama
antibodi hadir dalam serum antibodi donor lebih sekunder + enzim akan mengikat, dan warna
lebih cepat akan berkembang.. Kelemahan utama dari ELISA tidak langsung adalah bahwa
metode imobilisasi antigen non-spesifik, ketika serum digunakan sebagai sumber antigen tes,
semua protein dalam sampel bisa tetap berpegang pada pelat mikro dengan baik, konsentrasi
begitu kecil analit dalam serum harus bersaing dengan protein serum lainnya ketika mengikat ke
permukaan baik. Sandwich atau langsung ELISA memberikan solusi untuk masalah ini, dengan
menggunakan "menangkap" antibodi spesifik untuk antigen tes untuk menariknya keluar dari
campuran molekul serum itu.
ELISA dapat dijalankan dalam format kualitatif atau kuantitatif. Hasil kualitatif memberikan
hasil positif atau negatif sederhana (ya atau tidak) untuk sampel. Cutoff antara positif dan
negatif ditentukan oleh analis dan mungkin statistik. Dua atau tiga kali standar deviasi
(kesalahan yang melekat dalam tes) sering digunakan untuk membedakan positif dari sampel
negatif. Dalam kuantitatif ELISA, densitas optik (OD) dari sampel dibandingkan dengan kurva
standar, yang biasanya pengenceran serial solusi dikenal-konsentrasi dari molekul target.
Sebagai contoh, jika sebuah sampel uji mengembalikan OD 1,0, titik pada kurva standar yang
memberi OD = 1,0 harus dari konsentrasi analit yang sama sebagai sampel Anda.
Gambar untuk hak tersebut termasuk penggunaan antibodi sekunder terkonjugasi untuk
enzim, meskipun, dalam arti teknis, hal ini tidak diperlukan jika antibodi primer adalah konjugasi
enzim. Namun, penggunaan konjugasi antibodi sekunder-menghindari proses yang mahal untuk
menciptakan enzim-linked antibodi untuk setiap antigen yang satu mungkin ingin mendeteksi.
Dengan menggunakan antibodi enzyme-linked yang mengikat wilayah Fc dari antibodi lain,

antibodi ini enzyme-linked yang sama dapat digunakan dalam berbagai situasi. Tanpa lapisan
pertama antibodi "menangkap", setiap protein dalam sampel (termasuk protein serum) dapat
menyerap kompetitif ke permukaan piring, menurunkan jumlah antigen amobil. Penggunaan
antibodi spesifik dimurnikan untuk melampirkan antigen ke plastik menghilangkan kebutuhan
untuk memurnikan antigen dari campuran yang rumit sebelum pengukuran, menyederhanakan
uji, dan meningkatkan spesifisitas dan sensitivitas pengujian tersebut.

DAFTAR PUSTAKA

http://moko31.wordpress.com/2011/06/28/tinjauan-tentang-elisa/
: http://id.shvoong.com/exact-sciences/bioengineering-and-biotechnology/2113282-metodeelisa-enzym-linked-immunosorbent/#ixzz1dla9xpCX
ELISA TEST
16.52 Pandu DinGin
No comments
Kirimkan Ini lewat Email BlogThis! Berbagi ke Twitter Berbagi ke Facebook

BAB I
PENDAHULUAN
1. Latar Belakang
HIV/AIDS termasuk jajaran penyakit yang mempunyai tingkat penularan yang sangat
tinggi. Hal ini terjadi karena seringkali seseorang tidak menyadari bahwa dirinya telah terinfeksi
HIV, sehingga menjadi sumber penularan bagi orang lain. Sampai saat ini diperkirakan terdapat
sekitar 28 juta orang lebih yang terinfeksi HIV di seluruh dunia. Untuk Indonesia sendiri
diperkirakan orang yang terinfeksi HIV mencapai 100.000 sampai 200.000 orang yang dari tahun
ke tahun akan terus bertambah.
Seseorang terkena HIV biasanya diketahui jika telah terjadi Sindrom Defisiensi Imun
Dapatan (AIDS) yang ditandai antara lain penurunan berat badan, diare berkepanjangan,
Sarkoma Kaposi, dan beberapa gejala lainnya. Berkembangnya teknologi pemeriksaan saat ini
mengijinkan kita untuk mendeteksi HIV lebih dini.
Pemeriksaan Laboratorium yang paling umum dilakukan sebagai skrining pertama kali
dalam melakukan pemeriksaan Anti HIV (merupakan pemeriksaan anti body) yaitu dengan
metode ELISA.
Enzim-Linked immune sorbent assay (ELISA) atau dalam bahasa indonesianya disebut
sebagai uji penentuan kadar immunosorben taut-enzim, merupakan teknik pengujian serologi
yang didasarkan pada prinsip interaksi antara antibody dan antigen. Pada awalnya, teknik ELISA
hanya digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi keberadaan antigen maupun
antibody dalam suatu sampel seperti dalam pendeteksian antibody IgM, IgG, dan IgA pada saat
terjadi infeksi (pada tubuh manusia khususnya, misalya pada saat terkena virus HIV). Namun
seiring dengan perkembangan ilmu pengetahuan,teknik ELISA juga diaplikasikan dalam bidang
patologi tumbuhan, kedokteran, dll.
2. Rumusan Masalah
2. 1. Bagaimana sejarah penemuan teknik ELISA?
2. 2. Bagaimana prinsip dasar teknik ELISA?

2.
2.
2.
2.

3.
4.
5.
6.

Apa saja alat dan bahan yang dibutuhkan dalam teknik ELISA?
Apa saja kelebihan dan kelemahan teknik ELISA?
Apa saja macam-macam teknik ELISA?
Bagaimana langakah kerja teknik ELISA?

BAB II
ISI
1.

Sejarah Penemuan
Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva
Engvall. Mereka menggunakan teknik ELISA ini dalam bidang imunologi (ELISA konvensional)
untuk menganalisis interaksi antara antigen dan antibodi di dalam suatu sampel, dimana
interaksi tersebut ditandai dengan menggunakan suatu enzim yang berfungsi sebagai pelopor/
reporter/ signal.
Dalam perkembangan selanjutnya, selain digunakan sebagai uji kualitatif untuk
mengetahui keberadaan suatu antibodi atau antigen dengan menggunakan antibodi atau
antigen spesifik, teknik ELISA juga dapat diaplikasikan dalam uji kuantitatif untuk mengukur
kada antibodi atau antigen yang diuji dengan menggunakan alat bantu erupa spektrofotometer
atau dengan cara menetukan jumlah penambahan atau kadar antibodi atau antigen, sehingga
dapat dibuat suatu kurva standard an kadar antibodi atau antigen yang tidak diketahui dapat
ditentukan.

2.

Prinsip Dasar Teknik ELISA


Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simple dapat dijabarkan sebagai berikut :
Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu permukaan yang
berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu penempelan
secara non spesifik dengan adsorbs ke permukaan microtiter, dan penempelan secara spesifik
dengan menggunakan antibody atau antigen lain yang bersifat spesifik dengan antigen atau
antibodi yang diuji (cara ini digunakan pada teknik ELISA sandwich). Selanjutnya antibodi atau
antigen spesifik yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal (disesuaikan dengan sampel
=> bila sampel berupa antigen, maka digunakan antibodi spesifik , sedangkan bila sampel
berupa antibodi, maka digunakan antigen spesifik) dicampurkan ke atas permukaan tersebut,
sehingga dapat terjadi interaksi antara antibodi dengan antigen yang bersesuaian. Kemudian ke
atas permukaan tersebut dicampurkan suatau substrat yang dapat bereaksi dengan enzim
signal. Pada saat substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim yang bertaut dengan
antibodi atau antigen spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau antigen sampel akan
bereaksi dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi. Pda ELISA
flourescense misalnya, enzim yang tertaut dengan antibodi atau antigen spesifik akan bereaksi
dengan substrat dan menimbulkan signal yang berupa pendaran flourescense.

3.

Kelebihan dn Kelemahan Teknik ELISA


Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain :
Teknik pengerjaan relatif sederhana
Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga
menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)
Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen tersebut
sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen yang bersifat
sangat spesifik)
Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.

Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain :

Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis antibodi
monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen)

Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga pengujian
teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal.

Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol negatif
yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan blocking sehingga
antibodi sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim signal
dan menimbulkan signal.

Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan harus
dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan
larutan untuk menghentikan reaksi).
4. Alat dan Bahan Yang Digunakan
Alat paling utama yang digunakan dalam teknik ELISA adalah microtiter. Microtiter ini
berupa suatu papan plastik dengan cekungan sebanyak 96 buah (8 cekungan ke arah bawah dan
12 cekungan ke samping). Microtiter ini terbuat dari bahan plistirena. Cekungan dari microtiter
memiliki tinggi sekitar 1 cm dan diameter 0,7 cm. Selain itu, alat dan bahan lain yang umum
digunakan dalam teknik ELISA antara lain :

Antigen yang dimurnikan (jika sampel yang akan dideteksi atau dikuantifikasikan berupa
antibodi).

Larutan standard (kontrol positif dan negatif).

Sampel yang ingin dites.

Cairan pencuci (buffer).

Antibodi atau antigen yang tertaut dengan enzim signal.

Substrat yang bersifat spesifik terhadap enzim signal.

ELISA reader (spektrofotometer) untuk pengukuran kuantitatif.


5.

Macam-macam Teknik ELISA


Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik ELISA kompetitif yang
menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim, dan teknik ELISA
nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada teknik ELISA
nonkompetitif, antibody kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi
sebagai signal. Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA sandwich.
Dewasa ini, teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagia macam jenis teknik.
Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan teknik ELISA tersebut
sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini adalah beberapa macam teknik ELISA
yang relatif sering digunakan, antara lain :
5. 1. ELISA Direct
Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini seringkali
digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel ELISA direct
menggunakan suatu antibody spesifik (monoklonal) untuk mendetaksi keberadaan antigen yang
diinginkan pada sampel yang diuji.
Pada ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan sampel yang mengandung antigen
yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel
pda dinding lubang microtiter. Lalu antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal
dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter sehingga dapat berinteraksi dengan antigen
yang diinginkan, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk membuang antibody
tertaut enzim signl yang tidak berinteraksi dengan antigen. Lalu, ke dalam lubang-lubang
microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, sehingga
enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan
akan berinteraksi dengan substrat dan menimbulkan signal dapat dideteksi. Pendeteksian

interaksi antara antibodi dengan antigen tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan
menggunakan kolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent end-point.
ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain :
Immunoreaktifitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan enzim.
Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal.
Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi pada percobaan
yang berbeda.
Amplifikasi signal hanya sedikit.
Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum digunakan
untuk uji ELISA direct.
Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain :
Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibody.
Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang dengan antibody lain
(antibody sekunder) dapat diminimalisasi.
5. 2. ELISA Indirect
Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling
sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya
merupakan antibody. ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal) serta
antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibody yang
diinginkan pada sampel yang diuji.
Pada ELISA indirect, pertama mocrotiter diisi dengan larutan yang mengandung antigen
spesifik, sehingga antigen spesifik tersebut dapal menempel pada bagian dinding lubang
microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pada
dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung antibody yang diinginkan
dimasukkan ke dalam lubang-lubnag microtiter, sehingga terjadi terjadi interaksi antara antigen
spesifik dengan antibody yang dinginkan. Selanjutnya microtiter kembali dibilas untuk
membuang antibodi yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik. Lalu ke dalam lubang
microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal,
sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antibody yang diinginkan
dengan antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal. Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk
membuang antibody sekunder tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antibody
spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal, lalu enzim yag tertaut dengan antibody sekunder speifik yang telah
berinteraksi dengan antibody yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan
signal yang dapat dideteksi.
ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain :
Membutuhkan waktu pengujian yang relative lebih lama daripada ELISA direct karena ELISA
indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen
spesifik dengan antibody yang dinginkan dan antara antibody yang diinginkan dengan antibody
sekunder tertaut enzim signal, sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu
inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibody
spesifik tertaut enzim signal.
Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain :
Terdapat berbagai macam variasi antibody sekunder yang terjual secar komersial di pasar.
Immunoreaktifitas dari antibody yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh penautan
enzim signal ke antibody sekunder karena penautan dilakuka pada wadah berbeda.
Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibody yag diinginkan memiliki beberapa epitop
yang bisa berinteraksi dengan antibody sekunder.
5. 3. ELISA Sandwich
Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer spesifik untuk menangkap antigen
yang diinginkan dan antibody sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan

antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA
direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi.
Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan antibody
primer spesifik dan antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka teknik ELISA
sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi
interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau
protein. Pada ELISA sandwich, antibody primer seringkali disebut sebagai antibody penangkap,
sedangkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody penangkap, sedagkan
antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody deteksi.
Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk mendeteksi
keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan
tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi
terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi
dengan kedua antibody.
Pada ELISA sandwich, pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandung antibody
penangkap, sehingga antibody penangkap tersebut dapat menempel pada bagian dinding
lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antibody penangkap yang
tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung
antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi
interaksi antara antibody penangkap dengan antigen yang diinginkan. Selanjutnya, microtiter
kembali dibilas untuk membuang antigen yang tidak bereaksi dengan antigen penangkap. Lalu,
kedalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibody detector sehingga pada
lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibody
detector. Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang antibody detector yang tidak
berinteraksi dengan antibody spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan
substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut pada antibody
detector yang telh berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat
dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi.
Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yng mempengaruhi tingkat sensitivitas
dari hasil pengujian, antara lain :
Banyak molekul antibody penangkap yang berhasil menempel pada dinding-dinding microtiter.
Avinitas dari antibody penangkap dan antibody detector terhadap antigen sebenarnya, teknik
ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct.
Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat sensitivitasnya yang
relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan dua jenis
antibody, yaitu antibody penangkap dan antibody detector. Namun demikian, teknik ELISA
sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk
medeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibody yang
dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus
berbeda).
5. 4. ELISA Biotin Sterptavidin (Jenis ELISA Modern)
Pada perkembangan selanjutnya, teknik ELISA sandwich ini juga dikembangkan untuk
mendeteksi antibody dengan tingkat sensitivitas relatif lebih tinggi. Teknik ini dikenal sebagai
teknik ELISA penangkap antibody, dimana prinsip kerjanya sama dengan ELISA sandwich, hanya
saja yang digunakan dalam teknik ini adalah antigen penangkap dan antigen detector (antigen
bertaut enzim signal, bersifat opsional apabila antibody yang diinginkan tidak bertaut dengan
enzim signal).
Contoh dari aplikasi teknik ini adalah teknik ELISA untuk mendeteksi vitamin biotin yang
bertaut dengan suatu antibody avidin dengan mengubah antibody avidin menjadi antibody
streptavidin, dimana satu molekul streptavidin dapat mengikat empat molekul biotin
(pengembangan dari ELISA indirect), sehingga signal yang teramplifikasi menjadi semakin kuat
akibat interaksi antara biotin dengan enzim yang menjadi semakin banyak.

5. 5. ELISA Kompetitif
Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA terdahulu.Prinsip dasar
dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke dalam lubang mikrotiter.Teknik
ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan antigen atau antibody.
Pada pendeteksian antigen, pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal,
sehingga antibody spesifiktersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
lubangmikrotiter. Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan dengan
enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke
dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antaraantigen spesifik bertaut enzim
signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan antibody spesifik yang
dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen spesifik tertaut enzim signal
atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik. Lalu kedalam lubang-lubang
mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut
pada antigen spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan antigen yang telah berinteraksi
dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat
dideteksi. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif ditandai oleh tidak adanya signak
yang ditimbulkan, yang berarti bahwa antigen yang diinginkan telah menang berkompetisi
dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antibody spesifik.
Sedangkan pada pendeteksian antibody, pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang
dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim
signal, sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
mikrotiter, kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak menempel
pada dinding-dinding mikrotiter. Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik yang telah
ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody yang diinginkan
dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter, sehingga terjadi kompetisi antara antibody
spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk dapatberinteraksi dengan
antigen spesifik, yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antibody
spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik. Lalu,
kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan
enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan antibody
yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif
juga ditandai oleh tidak adanya signal yang ditimbulkan, yang berarti antibody yang diinginkan
telah menang berkompetisi dengan antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi
dengan antigen spesifik.
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi terhadap
larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan, tapi hasil yang
diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody dan
antigen.
5. 6. ELISA Multiplex
Teknik ELISA merupakan pengembangan teknik ELISA yang ditujukan untuk pengujian
secara simultan,sedangkan prinsip dasarnya mirip dengan teknik ELISA terdahulu.
6. Contoh Langkah Kerja Teknik ELISA
Berikut ini adalah contoh langkah kerja beberapa macam teknik ELISA, yaitu:
Pendeteksian antibody dengan ELISA indirect:
1.
Melapisi mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan membiarkan
larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit.
2.
Membilas antigen yang tidak terikat dengan buffer.
3.
Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein
yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk)
4.
Membilas protein yang tidak melekat.

5.

Menambahkan sampel serum yang akan dideteksi antibodinya dan membiarkan antibody
spesifik untuk berikatan dengan antigen.
6.
Membilas antibody yang tidak terikat.
7.
Menambahkan anti-Ig yang akan berikatan pada daerah Fc pada antibody yang spesifik
(sebagai contoh, anti-rantai gamma manusia yang berikatan dengan IgG manusia). Daerah
Fc pada anti-Ig akan berikatan secara kovalen dengan enzim.
8.
Membilas kompleks antibody-enzim yang tidak terikat.
9.
Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim
akan dikonversi menjadi produk.
10.
Inkubasi sampai muncul warna, dan
11.
Ukur dengan spectrometer. Jka semakin pekat warna yang dideteksi, maka makin besar
kadar antibody spesifik dalam sampel.
Pendeteksian antigen dengan ELISA sandwich:
1.
Melapisi mikrotiter plate dengan antibodi yang sudah dimurnikandimurnikan dengan
membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit.
2.
Membilas antibodi yang tidak terikat dengan buffer
3.
Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein
yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk)
4.
Membilas protein yang tidak melekat.
5.
Menambahkan sampel yang akan dideteksi antigennya dan membiarkan antibodi untuk
berikatan dengan antigen spesifik dari sampel.
6.
Membilas antigen yang tidak terikat.
7.
Menambahkan antibody yang telah terlabeli dengan enzim dan bersifat spesifik untuk
epitope yang berbeda pada antigen sampel, sehingga terbentuk sandwich.
8.
Membilas antibody-enzim yang tidak terikat.
9.
Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim
akan dikonversi menjadi produk.
10. Inkubasi sampai muncul warna.
11. Ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang terdeteki, maka makin besar
kadarantigen spesifi dalam sampel.
7. Aplikasi Teknik ELISA
Berikut ini adalah beberapa ontoh aplikasi teknik ELISA, antara lain:
a. Pemeriksaan donor darah untuk pembuktian adanya kontaminasi virus:

HIV-1 dan HIV-2 (keberadaan antibody anti-HIV)

Hepatitis C (presence of antibodies)

Hepatitis B (test untuk keberadaan antibody dan antigen virus)

HTLV-1 dan -2 (keberadaan entibodi)


b. Pengukuran level hormone

hCG (sebagai tes kehamilan)

LH ( menentukan waktu ovulasi)

TSH, T3dan T4 (untuk fungsi thyroid)


c. Pendeteksian Infeksi

Agen penularan secara seksual, HIV, Syphilis dan Chlamydia

Hepatitis B dan C

Toxoplasma Gondii
d. Pendeteksian bahan allergen pada makanan dan debu rumah.
e. Pendeteksian keberadaan zat obat-obatab terlarabg, seperti

Cocain

Opium

-9-tetrahydrocannabiol, campuran aktif pada marijuana.


8. Contoh Aplikasi ELISA: Tes Kehamilan Menggunakan Hormon hCG

Pada hari kesepuluh setelah sel telur dibuahi oleh sperma pada saluran Tuba fallopi, sel
telur akan bergerak menuju Rahim dan melekat pada dinding Rahim tersebut. Sejak saat itulah
plasenta akan mengalami perkembangan dan hCG mulai diproduksi. Human Chorionic
gonadotropin (hCG) pada dasarnya merupakan hormone glikoprotein yang diproduksi oleh sel
normal trofoblat pada plasenta selama kehamilan yang dapat ditemukan dalam darah dan air
seni.
hCG terdiri dari 2 subunit polipeptida yang terikat secara nonkovalen dengan berat molekul
total 39 kD. Subunit rantai identic dengan subunit rantai dari hLH (human Luteinizing
Hormone), hFSH (human Follicle Stimulating Hormone) dan hTSH (human Thyreoidea Stimulating
Hormone). Subunit bertanggung jawab pada efek hormonal molekul hCG. Pengukuran hCG yang
sempurna dan keberadaan subunit memberi hasil yang sama pada darah dan urin, tapi tidak
pada subunit . Produksi hormone hCG akan bertambah banyak selama trimester pertama,
dimana level hCG yang sempurna mempunyai rentang dari 20000 mIU/ml sampai 50000 mIU/ml
(1 ng = 15 mIU).
Keberadaan hCG sudah dapat dideteksi dalam darah sejak hari pertama keterlambatan
haid, yaitu kira-kira hari keenam sejak pelekatan janin pada dinding Rahim. Kadar hormone
tersebut akan terus-menerus bertambah hingga minggu ke 14-16 kehamilan, terhitung sejak hari
terakhir menstruasi. Sebagian besar ibu hamil akan mengalami penambahan kadar hormone
hCG sebanyak dua kali lipat setiap 3 hari.
Peningkatan kadar hormone ini biasanya
ditandai dengan mual dan pusing yang sering dialami oleh para ibu hamil. Selanjutnya kadar
hCG akan menurun terus secara perlahan, dan hamper mencapai kadar normal beberapa saat
setelah persalinan. Pengetesan dapat dilakukan pada saat wanita mengalami keterlambatan
siklus haid atau kira-kira 7 hari setalah berhubungan.Sampel yang sigunakan pada umumnya
adalah urin. Biasanya dianjurkan menggunkan air seni yang keluar pertama kali setelah bangun
pagi, karena pada saat tersebut konsentrasi hormone hCG relatif tinggi. Sebenarnya uji darah
pada tes kehamilan yang dilakukan di laboratorium juga memiliki prinsip kerja yang relatif sama,
yait mendekati kadar hCG. Namun, tes darah mempunyai kelebihan berupa kemampuan untuk
mendeteksi usia janin bertumbuh di dalam Rahim seorang ibu.
Perkiraan Kadar hCG dalam Darah Kehamilan Trimester kedua

Perempuan yang tidak hamil dan laki-laki


24-28 hari setelah haid terakhir
4-5 minggu (1 bulan) setelah haid
terakhir
IIb
5-6 minggu setelah haid terakhir
u hamil:
14-16 minggu (4 bulan) setelah haid
terakhir
kehamilan trimester ketiga
Perempuan pasca menopause

Kurang dari 5 IU/L


(international units
per liter)
5-100 IU/L
50-500 IU/L
100-10.000 IU/L
12.000-270.000 IU/L
1.000-50.000 IU/L
Kurang dari 10 IU/L

Keuntungan test kehamilan dengan menggunakan uji kadar hormone hCG antara lain:

Analisa yang hemat dan efektif dengan kualitas tinggi dan harganya memadai.

Efisien dan fleksibel: sampel yang berbeda dapat dianalisa secara stimulant dengan
jumlah cekungan uji yang fleksibel.

Spesifik: sepasang antibody mempunyai selektivitas tinggi secara spesifik berikatan


dengan -hCG.

Prosedur yang sederhana.


Dalam pengaplikasian teknik ELISA, serum hCG selain dapat digunakan sebagaitest
kehamilan untuk mengetahui keberadaan janin dalam Rahim,juga dapat digunakan untuk
berbagai uji kehamilan lainnya, antara lain:


Prediksi kehamilan yang multiple/ lebih dari 1.

Diagnosis kehamilan yang abnormal.

Penentuan fase kehamilan/ masa kehamilan.

Diagnosis diferensial pada infertilitas/ ketidaksuburan pada wanita atau pria.

Invertigasi lanjut setelah terapi untuk tumor trofoblastik.


Alat tes hCG yang menggunakan teknik ELISA tersedia dalam 2 bentuk di pasaran, yaitu:

Berupa alat yang digunakan dengan cara memaparkannya pada aliran urin saat pertama
berkemih di pagi hari selama beberapa saat. Jenis alat ini sangat umum digunakan, karena
dijual bebas di apotek, dan penggunaannya mudah. Berikutini adalah cara kerjanya:
1.
Pada saat alat tes mulai bekerja, akan muncul garis pada jedela berbentuk lingkaran
(Jendela control).Dimana garis tersebut merupakan garis konttrol yang menunjukkan bahwa
tes bekerja secara benar.
2.
Jendela berbentuk persegi akan menunjukkan hasil tes. Apabila garis muncul pada jendela
berbentuk persegi (jendela hasil) maka alat tes telah mendeteksi adanya hormone hCG dan
mununjukkan adanya kehamilan.
Hasil negatif: Munculnya satu garis pada jendela konttrol (berbentuk lingkaran) menandakan
bahwa anda tidak hamil dan tes telah dilakukan dengan benar.
Hasil positif: Muncul 2 garis pada jendela control (berbentuk lingkaran) dan jendela hasil
(berbentuk persegi) menandakan anda hamil
Hasil Tidak Valid: Apabila garis pada jendela control tidak muncul berarti tes tidak dilakukan
dengan benar.

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Berupa alat digunakan dengan cara membubuhi beberapa tetes serum pada mikrotiter.
Berikut ini adalah cara kerjanya:
Mengandalkan antibody -hCG yang terimbolisasi pada media padat yang berikatan dengan
-hCG yang bebas dari sampel (urin)
Antibodi kelinci anti- -hCG berkonjungsi dengan horseladish peroxidase (HRP) sebagai
larutan konjugasi antibody-enzim.
Sampel tes dibiarkan untuk bereaksi simultan dengan antibody, menghasilkan -hCG antara
fase padat denga antibody-enzim.
Setelah inkubasi, cekungan dibilas untuk membilas antibody-enzim yang tidak terikat.
Kemudian substrat HRP, TMB, ditambahkan untuk menghasilkan warna biru.
Perkembangan warna dihentikan dengan penambahan stop solution yang akan mengubah
warna kuning.
Konsentrasi -hCG secara langsung proporsional terhadap intensitas warna yang dihasilkan
dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer.

BAB III
PENUTUP
1. Kesimpulan
ELISA (Enzym-Linked Immunosorbent Assay), tes ini mendeteksi antibodi yang dibuat
tubuh terhadap virus HIV. Antibodi tersebut biasanya diproduksi mulai minggu ke 2, atau bahkan
setelah minggu ke 12 setelah terpapar virus HIV. Kerena alasan inilah maka para ahli
menganjurkan pemeriksaan ELISA dilakukan setelah minggu ke 12 sesudah melakukan aktivitas
seksual berisiko tinggi atau tertusuk jarum suntik yang terkontaminasi. Tes ELISA dapat
dilakukan dengan sampel darah vena, air liur, atau air kencing.
Hasil positif pada ELISA belum memastikan bahwa orang yang diperiksa telah terinfeksi
HIV. Masih diperlukan pemeriksaan lain, yaitu Western Blot atau IFA, untuk mengkonfirmasi hasil
pemeriksaan ELISA ini. Jadi walaupun ELISA menunjukkan hasil positif, masih ada dua
kemungkinan, orang tersebut sebenarnya tidak terinfeksi HIV atau betul-betul telah terinfeksi
HIV.

DAFTAR PUSTAKA

http://nusaindah.tripod.com/hiv.html diunduh pada 23 Januari 2012 pukul 13.10 WIB


http://my.opera.com/marunting/blog/show.dml/14205592 diunduh pada 24 Januari 2012 pukul
15.30 WIB
http://www.catatandokter.com/2008/06/jenis-jenis-pemeriksaan-hivaids.html
diunduh pada
23 Januari 2012 pukul 12.30 WIB
http://www.scribd.com/doc/39010855/ELISA diunduh pada 23 Januari 2012 pukul 14.00 WIB
http://www.scribd.com/doc/7963861/45/Tes-ELISA diunduh pada 25 Januari 2012 pukul 16.30
WIB