MAKALAH KIMIA ANALISIS II

ANALISIS OBAT MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI LAPIS

TIPIS (KLT)

OLEH:
ARI PUTRA UTAMA

(O1A1 14 007)

ASWAN SUDIMAN

(O1A1 14 007)

DEVITA SUBA MAIRI

(O1A1 14 009)

EKA ASTUTI JANNA

(F1F1 12 051)

FISMATULLAH

(F1F1 11 111)

ISRAWATI

(O1A1 14 018)

NABILA SARASWATI HENDRA

(O1A1 14 029)

PRADANATI DESMA AYUNDARI

(O1A1 14 037)

RIDHO FAJRIYAH JAMRI

((O1A1 14 040)

JURUSAN FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HALU OLEO
KENDARI
2016

KATA PENGANTAR

Dengan menyebut nama Allah SWT yang Maha Pengasih lagi Maha
Panyayang, Kami panjatkan puja dan puji syukur atas kehadirat-Nya, yang telah
melimpahkan rahmat, hidayah, dan inayah-Nya kepada kami, sehingga kami dapat
menyelesaikan makalah Kimia Analisis II dengan judul Analisis Obat
Menggunakan Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
Makalah ini telah kami susun dengan maksimal dan mendapatkan bantuan
dari berbagai pihak sehingga dapat memperlancar pembuatan makalah ini. Untuk
itu kami menyampaikan banyak terima kasih kepada semua pihak yang telah
berkontribusi dalam pembuatan makalah ini.
Terlepas dari semua itu, kami menyadari sepenuhnya bahwa masih ada
kekurangan baik dari segi susunan kalimat maupun tata bahasanya. Oleh karena
itu dengan tangan terbuka kami menerima segala saran dan kritik dari pembaca
agar kami dapat memperbaiki makalah ini.
Akhir kata kami berharap semoga makalah Kimia Analisis II dengan judul
Analisis Obat Menggunakan Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT). dapat
memberikan manfaat terhadap pembaca.

Kendari, Juni 2016

Penulis

BAB I
PENDAHULUAN
A.

Latar Belakang
Perkembangan

ilmu

pengetahuan

sejalan

dengan

perkembangan

tekhnologi. Berbagai alat dengan kecanggihan semakin meningkat. Hal ini juga
termasuk perkembangan dalam ilmu farmasi, tidak terkecuali bidang Analisis
farmasi. Dalam bidang ini, selama beberapa tahun terakhir terjadi perkembangan
yang pesat untuk teknik pemisahan. Penerapan metode seperti kromatografi
dianggap metode modern yang saat ini sering digunakan dalam berbagai riset dan
penelitian. Hal ini terbukti dengan banyaknya publikasi ilmiah yang berkaitan
dengan penggunaan metode tersebut, baik untuk tujuan analisis kualitatif maupun
kuantitatif.
Pada perkembangan metode Kromatografi saat ini pemakaian "Thin Layer
Chromato Scanner" yang lebih dikenal dengan nama densitometer makin banyak
dipakai secara luas oleh peneliti/ilmuwan. Densitometri adalah metode analisi
instrumental yang berdasarkan interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit
yang merupakan bercak atau noda pada lempeng KLT.Interaksi radiasi
elektromagnetik dengan noda pada lempeng KLT yang ditentukan adalah
adsorpsi, transmisi, pantulan (refleksi) pendar fluor atau pemadaman pendar fluor
dari radiasi semula. Adsorbent dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak
sebagai penunjang fase diam. Fase bergerak akan menyerap sepanjang fase diam
dan terbentuklah kromatogram.

Kromatografi Lapis Tipis ( KLT ) dikembangkan oleh Izmail off dan

Schraiber pada tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain
kromatografi kertas dan elektroforesis. Berbeda dengan kromatografi kolom yang
mana fase diamnya diisikan atau dikemas didalamnya, pada kromatografi lapis
tipis, fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan
bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelataluminium, atau pelat
plastic. Kromatografi banyak dipilih karena merupakan metode pemisahan yang
sederhana. Kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada
perbedaan distribusi dari penyusunan cuplikan antara dua fasa.Satu fasa tetap
tinggal pada sistem dan dinamakan fasa diam. Fasa lainnya dinamakan fasa gerak
menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan. Kromatografi juga
dapat digunakan, jika metode klasik tidak dapat dilakukan karena jumlah cuplikan
rendah, kompleksitas campuran yang hendak dipisahkan atau sifat berkerabat zat
yang sulit dipisah. Keunggulan lainnya adalah dititikberatkan untuk analisis
analit-analit dengan kadar sangat kecil yang perlu dilakukan pemisahan terlebih
dahulu dengan KLT. Metode ini yang banyak digunakan dalam analisis kualitatif
maupun kuantitatif di bidang farmasi terutama di bidang analisis obat bahan alam.
Kromatografi ada bermacam-macam diantaranya Kromatografi kertas,
kromatografi lapisan tipis ( Thin Layer Chromatography ), kromatografi gas ( Gas
Chromatography ), dan kromatografi cair kinerja tinggi ( High Performance
Liquid Chromatography ).. Namun dalam makalah ini hanya akan dibahas
mengenai teknik Kromatografi Lapis Tipis (KLT) (Gandjar dan Rohman, 2007).

B.

Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas maka rumusan masalah dalam makalah

ini yaitu :
1.
2.
3.
4.

Apa yang dimaksud Kromatografi Lapis Tipis (KLT)?

Apa kelebihan dan kekurangan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)?
Bagaimana prinsip kerja Kromatografi Lapis Tipis (KLT)?
Apa fase diam dan fase gerak yang sering digunakan pada Kromatografi Lapis

Tipis (KLT)?
5. Bagaimana prosedur kerja pemisahan sampel dengan Kromatografi Lapis
Tipis (KLT)?
6. Bagaimana cara deteksi bercak dalam Kromatografi Lapis Tipis (KLT)?
7. Bagaimana penggunaaan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) untuk analisis obatobatan?
C. Tujuan
Tujuan makalah ini yaitu :
1. Untuk mengetahui definisi Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
2. Untuk mengetahui kelebihan dan kekurangan Kromatografi Lapis Tipis
(KLT).
3. Untuk mengetahui prinsip kerja Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
4. Untuk mengetahui fase diam dan fase gerak yang sering digunakan pada
Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
5. Untuk mengetahui prosedur kerja pemisahan sampel dengan Kromatografi
Lapis Tipis (KLT).
6. Untuk mengetahui cara deteksi bercak dalam Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
7. Untuk mengetahui cara penggunaaan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dalam
analisis obat-obatan
C. Manfaat
Manfaat makalah ini yaitu :
1. Agar mahasiswa mengetahui definisi Kromatografi Lapis Tipis (KLT).

2. Agar mahasiswa mengetahui kelebihan dan kekurangan Kromatografi Lapis

Tipis (KLT).
3. Agar mahasiswa mengetahui prinsip kerja Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
4. Agar mahasiswa mengetahui fase diam dan fase gerak yang sering digunakan
pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
5. Agar mahasiswa mengetahui prosedur kerja pemisahan sampel dengan
Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
6. Agar mahasiswa mengetahui cara deteksi bercak dalam Kromatografi Lapis
Tipis (KLT).
7. Agar mahasiswa mengetahui cara penggunaaan Kromatografi Lapis Tipis
(KLT) dalam analisis obat-obatan?

BAB II
PEMBAHASAN

A. DEFENISI KROMATOGRAFI
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) pertama kali dikembangkan oleh
Izmailoff dan Schraiber pada tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatografi
planar , yang fase diamnya berupa lapisan seragam (uniform) pada permukaan
bidng datar yang didukung oleh lempeng kaca, plat aluminium, atau plat plastik.

Kromatografi

adalah

teknik

pemisahan

campuran

berdasarkan

perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada

kromatografi, komponen komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase
yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen
campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran.
Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan
komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.
Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau
kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak
mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang
terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada
laju yang berbeda.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran
senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitas yang digunakan
dengan fase geraknya adalah berupa zat cair dan fase diamnya adalah berupa zat
padat. Fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan
bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium, atau pelat
plastik. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak
sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik
(ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun
(descending). KLT merupakan salah satu metode isolasi yang terjadi berdasarkan
perbedaan daya serap (adsorpsi) dan daya partisi serta kelarutan dari komponenkomponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen. Oleh karena

daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen
bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan
pemisahan.
Pada proses adsorpsi senyawa kimia dapat terpisah-pisah disebabkan oleh
daya serap adsorban terhadap tiap-tiap komponen kimia tidak sama. Sedangkan
partisi adalah kelarutan tiap-tiap komponen kimia dalam cairan pengelusi (eluen)
tidak sama dimana arah gerakan eluen disebabkan oleh gaya sentrifugal sehingga
komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda.
Kromatografi lapis tipis merupakan jenis kromatografi yang dapat
digunakan untuk menganalisis senyawa secara kualitatif maupun kuantitatif.
Lapisan yang memisahkan terdiri atas bahan berbutir (fase diam) ditempatkan
pada penyangga berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran
yang akan dipisah berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita, setelah
pelat/lapisan ditaruh dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang
yang cocok (fase gerak). Pemisahan terjadi setelah perambatan kapiler
(pengembangan),

selanjutnya

senyawa

yang

tidak

berwarna

harus

ditampakkan/dideteksi. Deteksi dilakukan dengan menggunakan sinar UV.

Biasanya yang sering digunakan sebagai materi pelapisnya adalah silika
gel, tetapi kadang kala bubuk selulosa dan tanah diatome juga dapat digunakan.
Untuk fase diam hidrofilik dapat digunakan pengikat seperti semen Paris, kanji,
disperse koloid plastic, silica terhidrasi. Untuk meratakan pengikat dan zat pada
pengadsorbsi digunakan suatu aplikator. Sekarang inin telah banyak tersedia
kromatografi lapisan tipis siap pakai yang dapat berupa gelas kaca yang telah

terlapisi, kromatotube, dan sebagainya. Kadar air dalam lapisan ini harus
terkendali agar didapat hasil analisis yang reprodusibel.
Pemilihan sistem pelarut dan komposisi lapisan tipis ditentukan oleh
prinsip kromatografi yang akan digunakan. Untuk meneteskan sampel yang akan
dipisahkan digunakan suatu mikro-syringe (penyuntik berukuran mikro). Sample
diteteskan pada salah satu bagian tepi pelat kromatografi. Pelarut harus nonpolar
dan mudah menguap. Kolom-kolom dalam pelat dapat diciptakan dengan
mengerok lapisan vertical searahgerakan pelarut. Teknik ascending digunakan
untuk melaksanakan pemisahan yang dilakukan pada temperature kamar, sampai
permukaan pelarut mencapai tinggi 15-18 cm. waktu yag diperlukan antara 20-40
menit. Semua teknik yang digunakan untuk kromatografi kertas dapat di pakai
juga untuk kromatografi lapis tipis. Resolusi KLT juah lebih tinggi daripada
kromatografi kertas karena laju difusi yang luar biasa kecilnya pada lapisan
pengadsorpsi. RRPC dapat juga dilakukan pada kromatografi lapisan ini, dengan
menggunakan lapisan yang sudah dicelupkan lebih dahulu pada perafin, minyak
silikon, dan lain-lain. Pelarut yang digunakan adalah CH 3COOH atau asetonitril.
Kadangkala untuk RPPC, waktu yang diperlukan cukup lama.
Zat-zat warna dapat terlihat langsung, tetapi dapat juga digunakan reagent
penyemprot untuk melihat bercak suatu zat. Asam kromat sering digunakan untuk
zat organic. Demikian juga penandaan secara radiokomia juga dapat digunakan.
Untuk menempatkan posisi suatu zat, reagent dapat juga disemprotkan pada
bagian tepi saja. Bagian yang lainnya dapat diperoleh kembali tanpa pengotoran
dari reagent dengan pengerokan setelah pemisahan selesai.

Untuk analisis kuatitatif dapat digunakan plot fotodensitometri. Analisisnya

dapat dilakukan dengan spektrofotometer UV, sinar tampak, IR atau flourosens
atau dengan reaksi kolorimeter dengan reagent kromogenik.
Aplikasi KLT sangatlah luas. Senyawa-senyawa yang tidak mudah
menguap serta terlalu labil untuk kromatografi cair dapat dianalisis dengan KLT.
Ia dapat pula untuk memeriksa adanya zat pengotor dalam pelarut. Ahli kimia
foresik menggunakan KLT untuk bermacam pemisahan. Pemisahan berguna dari
plasticizer, antioksidan, tinta dan formulasi zat pewarna dapat ditentukan dengan
KLT. Pemakaiannya juga meluas dalam pemisahan anorganik.

B.

KELEBIHAN DAN KEKURANGAN KLT

Beberapa kelebihan KLT yaitu:
1. KLT lebih banyak digunakan untuk tujuan analisis.
2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi
warna, fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
3. Dapat dilakukan elusi secara mekanik (ascending), menurun
(descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.
4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan
5.
6.
7.
8.
9.

ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.

Hanya membutuhkan sedikit pelarut.
Biaya yang dibutuhkan terjangkau.
Jumlah perlengkapan sedikit.
Preparasi sample yang mudah
Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon)
yang dengan metode kertas tidak bisa.
Adapun kekurangan KLT yaitu:

1. Butuh ketekunan dan kesabaran yang ekstra untuk mendapatkan

bercak/noda yang diharapkan.
2. Butuh sistem trial and eror untuk menentukan sistem eluen yang cocok.
3. Memerlukan waktu yang cukup lama jika dilakukan secara tidak tekun
4. Hanya merupakan langkah awal untuk menentukan pelarut yang cocok
dengan pada kromatografi kolom.
5. Noda yang terbentuk belum tentu senyawa murni

C. PRINSIP KERJA KLT

Prinsip Kerja dari Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah memisahkan
sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang
digunakan. Prinsipnya didasarkan atas adsorpsi dan partisi. Teknik ini biasanya
menggunakan fase diam dari bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan
dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan. Larutan atau campuran larutan yang
digunakan dinamakan eluen. Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan
eluen maka sampel akan terbawa oleh fase gerak tersebut. Pelarut yang dipilih
untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis
Pada dasarnya KLT digunakan untuk memisahkan komponen-komponen
berdasarkan perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan
pelarut pengembang. KLT sangat mirip dengan kromatografi kertas, terutama
pada cara pelaksanaannya. Perbedaan nyata terlihat pada fase diamnya atau media
pemisahnya, yakni digunakan lapisan tipis adsorben sebagai pengganti kertas.
Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan

kesetimbangan antara fase diam dan fasa gerak, dimana ada interaksi antara
permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan
diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Kesetimbangan ini
dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak, serta
kepolaran dan ukuran molekul. Berikut merupakan gambar KLT dengan
menggunakan pereaksi H2SO4.

D. FASE DIAM DAN FASE GERAK

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran
kecil dengan diameter partikel antara 10-30 m. Semakin kecil ukuran rata-rata
partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin
baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya. Silika gel salah satu contoh
fase diam yang terbentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan
oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan
silika gel, atom silikon berlekatan pada gugus -OH. Jadi, pada permukaan jel

silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini menunjukkan bagian
kecil dari permukaan silika.

Permukaan silika gel sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat
membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya,
sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol.
Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina dari aluminium
oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Pada
dasarnya sifat serta penggunaannya mirip silika gel.
Bahan padat pada penyangga : pelat elas/logam atau plastik dengan
ketebalan 0,25 mm. Fase diam yang banyak dipakai : silika gel yang dicampur
CaSO4 ; adsorben lain yang juga banyak dipakai : alumnia, kieselguhr, celite,
serbuk selulose, serbuk poliamida, kanji dan sephadex .Jenis fase diam : sama
seperti pada KCKT dikenal beberapa macam sifat polaritas. Silikal gel dikenal
sebagai fase diam polar, yang dapat dibuat menjadi non polar (RP = Reversed
Phase) setelah dilakukan pengikatan hidroksilnya dengan : C2, C8, atau C18.
Mekanisme pemisahan adalah : adsorpsi,partisi, penukar ion atau fase terbalik
(adsorpsi-partisi).

Apabila

sampel

bersifat

non

polar

maka

pelarut

pengembangnya non polar. Sedangkan bila sample bersifat polar, maka pelarut
pengembangnya bersifat polar. Ukuran fase diam 1-25 million dalam keadaan
uniform/seragam, akan menghasilkan pemisahan baik dan aliran fase gerak cepat
dan

merata.

Pada prinsipnya pemisahan KLT diusahakan dilakukan dalam keadaan netral.

Image 1 : KLT

Tabel Fase diam yang sering digunakan pada KLT (Kealey dan Haines, 2002)
Fasa Diam
Mekanisme Sorpsi
Penggunaan
Silika gel
Adsorpsi
Asam amino, hidrokarbon,
vitamin, alkaloid
Serbuk selulosa
Partisi
Asam amino, nukleotida,
karbohidrat
Selulosa penukar Pertukaran ion
Asam nukleat, nukleotida, halida
ion
dan ion-ion logam
Gel sephadex
Eksklusi
Polimer, protein, kompleks logam
-siklodekstrin
Interaksi adsorpsi
Campuran enansiomer

stereospesifik
Adsorben yang sering digunakan antara lain :
a. Silika gel
Yang paling banyak digunakan dalam pengujian, bersifat asam lemah,
sering ditambah CaSO4 (gibs) sebagai pengikat agar melekat kuat pada
penyangga. Penambahan ini juga mempercepat mengeringnya lapis tipis. Juga
dapat ditambahkan indicator fluoresensi yang akan berfluoresensi di bawah sinar
UV pada 254 nm, hingga noda yang mengabsorpsi pada frekuensi ini menjadi
sangat kontras terhadap latar belakang yang berfluoresensi hijau kuning. Silica gel
sangat higroskopis, pada humaditas relative 45 75% akan menarik air sampai 7
20%. Derajat diaktivasinya ditentukan oleh kelembaban ruangan dimana
pemisahan akan dilakukan atau tempat penyimpanan lapis tipisnya. Kemurnian
juga penting karena dapat mempengaruhi watak kromatografi beberapa senyawa
tertentu. Pencemar dalam adsorben ini dapat juga menyebabkan dekomposisi
senyawa yang hendak dianalisa.
b.

Alumina
Bersifat basa lemah. Tidak sebaik silica gel dan lebih relative secara kimia

hingga untuk senyawa yang sensitive dapat terdegrasi. Juga dapat ditambah
Ca2SO4 dan indicator fluoresensi.
c.

Kieselguhr (tanah diatome)

Merupakan adsorben netral dengan aktivitas rendah. Daya resolusinya juga

kecil. Dapat ditambahkan sebagai campuran pada silikagel yang akan memberikan
adsorben campur yang kurang aktif. Juga dapat ditambah Ca2SO4.

d.

Selulosa
Dengan menggunakan selulosa sebagai adsorben akan didapat lapis tipis

yang sifatnya analog dengan kromatografi kertas. Memberikan lapis tipis yang
baik tanpa pengikat. Adsorben ini dapat ditambah indicator fluoresensi atau Ca
asetat. Kerugian penggunaan selulosa ini ialah tidak dapat digunakannya pereaksi
yang korosif seperti asam sulfat atau pereaksi destruktif lainnya.
e.

Poliamida
Merupakan magnesium silikat. Daya melekatnya tidak sebaik adsorben

lainnya. Biasanya ditambahkan pengikat seperti selulosa atau amilum.

Mempunyai kapasitas yang besar dan banyak digunakan untuk pemisahan fenol.
Selain fasa diam, dalam KLT juga diperlukan fasa gerak/eluent yang
berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fasa
diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan
terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu pemisahan komponen secara
kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah umpan. Eluent dapat
digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran
pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah
jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Suatu pelarut yang bersifat
larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang tak polar dari ikatannya dengan
alumina (gel silika). Semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan eluen maka
senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut. Hal ini berdasarkan
prinsip like dissolved like.

Dalam kromatografi, eluent adalah fasa gerak yang berperan penting

pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fasa diam
(adsorbent). Fasa gerak atau larutan pengembang biasanya digunakan pelarut
campuran organik atau bisa juga campuran pelarut organik - anorganik.Interaksi
antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan
komponen. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi
fase gerak (1) Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena
KLT merupakan teknik yang sensitif. (2) Daya elusi fase gerak harus diatur
sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan
pemisahan. (3) Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti
silica gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solute yang
berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar
seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzene akan
meningkatkan harga Rf secara signifikan. (4) Solut-solut ionik dan solute-solut
polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai fase geraknya, seperti
campuran air dan methanol dengan perbandingan tertentu. Penambahan sedikit
asam etanoat atau ammonia masing-masing akan meningkatkan solute-solute yang
bersifat basa dan asam

E.

PROSEDUR KERJA DENGAN KLT

Pada KLT, fasa diam berupa plat yang biasanya disi dengan silica gel.
Sebuah garis pensil digambar dekat bagian bawah fasa diam dan setetes larutan
sampel ditempatkan di atasnya. Sampel ditotol dengan bantuan pipa kapiler. Garis
pada fasa diam berguna untuk menunjukkan posisi asli sampel. Pembuatan garis
harus menggunakan pensil karena jika semua ini dilakukan dengan tinta, pewarna
dari tinta juga akan bergerak sebagai kromatogram berkembang. Ketika titik
campuran kering, fasa diam diletakkan berdiri dalam gelas tertutup yang telah
berisi fasa gerak dengan posisi fasa gerak di bawah garis. Digunakan gelas
tertutup untuk memastikan bahwa suasana dalam gelas jenuh dengan uap pelarut.
Pelarut (fasa gerak) perlahan-lahan bergerak naik. Komponen-komponen yang
berbeda dari campuran berjalanan pada tingkat yang berbeda dan campuran
dipisahkan memiliki warna yang berbeda. Diagram menunjukkan plat setelah
pelarut telah bergerak sekitar setengah jalan. Pelarut diperbolehkan untuk naik

hingga hampir mencapai bagian atas plat yang akan memberikan pemisahan
maksimal dari komponen-komponen pewarna untuk kombinasi tertentu dari
pelarut dan fase diam. Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada
lapisan tipis lebih baik dikerjakan dengan pereaksi kimia dan reaksi-reaksi warna.

Gambar Rangkaian Alat KLT

Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh
hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit
mungkin. Untuk memperoleh roprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan
paling sedikit 0,5 l. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10 l,
maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan
antar totolan. Penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak yang
menyebar dan puncak ganda. Jika sampel yang digunakan terlalu banyak akan
menurunkan resolus. Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah
mengembangkan sampel dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah
dijenuhi dengan uap fase gerak. Tepi bagian bawah lempeng tipis yang telah
ditotoli sampel dicelupkan kedalam fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase

gerak dalam bejana harus dibawah lempeng yang telah berisi totolan sampel.
Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase gerak
sedikit mungkin (akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian
lempeng yang telah ditentukan. Untuk melakukan penjenuhan fase gerak,
biasanya bejana dilapisi dengan kertas saring . Jika fase gerak telah mencapai
ujung dari kertas saring, maka dapat dikatakan bahwa fase gerak telah jenuh.
Gambar berikut ini menunjukkan posisi dari totolan sampel, posisi
lempeng dalam bejana serta ketinggian eluen dalam bejana :

( Lempeng dalam beaker(chamber) dengan garis pembatas

penotolan sampel dan batas eluen.)

Sebuah garis menggunakan pensil digambar dekat bagian bawah lempengan

dan setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan
penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan.
Jika ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak
selayaknya kromatogram dibentuk. Ketika bercak dari campuran itu mengering,
lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam
jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada
di bawah garis dimana posisi bercak berada. Alasan untuk menutup gelas kimia
adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap

dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia ditempatkan
beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas
kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut. Karena pelarut bergerak lambat
pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna
akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan
bercak warna.

(Lempeng dengan penunjukan kenaikan bercak dan batas atas pengelusian.)

Gambar menunjukkan lempengan setalah pelarut bergerak setengah dari

lempengan. Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini
akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna
untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam. Hal-hal yang harus
diperhatikan dalam KLT (1) Lempeng yang akan digunakan harus diaktifkan
terlebih dahulu agar pada proses elusi lempeng silica gel dapat menyerap dan
berikatan dengan sampel. Pengaktifan lempeng dilakukan dalam oven pada suhu
1100C selama 30 menit. (2) Chamber harus dijenuhkan untuk menghilangkan uap
air atau gas lain yang mengisi fase penjerap yang akan menghalangi laju eluen. (3)
Pada saat penotolan, hendaknya sampel jangan terlalu pekat sebab pemisahannya

akan sulit sehingga didapat noda berekor. (4) Penotolan harus tepat sehingga
didapatkan jumlah noda yang baik. (5) Eluen yang digunakan harus murni
sehingga tidak menghasilkan noda lain. Noda-noda yang diperoleh biasanya
berekor disebabkan karena Penotolan yang berulang-ulang dan letaknya tidak
tepat, kandungan senyawa yang terlalu asam atau basa dan Lempeng yang tidak
rata
Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih
baik dikerjakan dengan pereaksi kimia dan reaksi-reaksi warna. Untuk identifikasi
menggunakan harga Rf meskipun harga-harga Rf dalam lapisan tipis kurang tepat
bila dibandingkan pada kertas. Harga-harga Rf untuk senyawa-senyawa murni
dapat dibandingkan dengan harga-harga standard. Perlu diperhatikan bahwa
harga-harga Rf yang diperoleh berlaku untuk campuran tertentu dari pelarut dan
penyerap yang digunakan, meskipun daftar dari harga-harga Rf untuk berbagai
campuran dari pelarut dan penyerap dapat diperoleh.
F.

DETEKSI BERCAK
Ada dua cara untuk menyelesaikan analisis sampel yang tidak berwarna,

yaitu:
1. Menggunakan pendarflour
Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi
yang ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika
diberikan sinar ultraviolet (UV). Itu berarti jika sinar UV disinarkan, maka sampel
akan berpendar. Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada
kromatogram berada, meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika

dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa jika disinarkan sinar UV pada lempengan,
akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak.
Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.

Gambar Deteksi Bercak dengan UV

Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan,, kita harus menandai
posisi-posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan pensil dan melingkari
daerah bercak-bercak itu. Karena jika kita mematikan sinar UV tersebut, bercakbercaknya tidak tampak kembali.

2. Penunjukkan bercak secara kimia

Deteksi bercak pada KLT dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara
kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu
pereaksi melalui cara penyemproton pada fase diam sehingga bercak menjadi jelas
seperti asam sulfat untuk semua golongan senyawa, serium sulfat digunakan
umumnya untuk golongan senyawa alkaloid, steroid sapogenin, terpenoid, serta
penampak bercak spesifik yakni dragendorff yang akan menampakkan warna
bercak jingga.
Berikut adalah cara-cara kimiawi untuk mendeteksi bercak :
a) Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan bereaksi
secara kimia dengan solute yang mengandung gugus fungsional tertentu
sehingga bercak menjadi berwarna. Kadang-kadang dipanaskan terlebih
dahulu untuk mempercepat reaksi pembentukan warna dan intensitas
warna bercak.
b) Mengamati lempeng dibawah lampu ultraviolet yang dipasang panjang
gelombang emisi 254 atau 366 untuk menampakkan solute sebagai bercak
yang gelap atau bercak yang berfluorosensi terang pada dasar yang
berfluorosensi seragam. Lempeng yag diperdagangkan dapat dibeli dalam
bentuk lempeng yang sudah diberi dengan senyawa fliorosen yang tidak
larut yang dimasukkan ke dalam fase diam untuk memberikan dasar
fluorosensi atau dapat pula dengan menyemprot lempeng dengan reagen
fluorosensi setelah dilakukan pengembangan.
c) Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat lalu
dipanaskan untuk mengoksidasi solute-solut organic yang akan Nampak
sebagai bercak hitam sampai kecoklat-coklatan.
d) Memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam chamber tertutup.

e) Melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan densitometer,

suatu

instrument

yang

dapat

mengukur

intensitas

radiasi

yang

direfleksikan dari permukaan lempeng ketika disinari dengan lampu UV

atau lampu sinar tampak. Solut-solut yang mampu menyerap sinar akan
dicatat sebagai puncak (peak) dalam pencatatan (recorder).
Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak
menjadi tampak dengan cara mereaksikannya dengan zat kimia sehingga
menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah
kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino. Kromatogram dapat
dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi
dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat
atau ungu.

G. PENERAPAN KLT
KLT bisanya merupakan metode pilihan pertama jika sesorang ingin
memisahkan suatu campuran. Hal ini disebabkan karena KLT merupakan metode

yang sederhana dan cepat. KLT digunakan secara luas untk analisis obat. Berikut
adalah penggunaan KLT untuk analisis beberapa sediaan farmasi:
Tabel Penerapan KLT untuk analisis obat (gandjar dan Rohman, 2007)
Obat (sediaan)
Fase diam
Fase gerak
Deteksi
Asetaminofen
Silika gel
Heksan:aseton (75:25)
UV
(serbuk)
UV panjang
Albendazol
Metilen klorid-asam
Silika
gelombang
(serbuk)
aseat- eter (6:1:1)
pendek
Amoksisilin
Metanol-piridin(tablet, kapsul,
suspensi)
Ampisilin (kapsul,
suspensi oral)
Vitamin C
(serbuk)

Silika

Silika
silika

kloroform-air
(90:10:80:10)
Aseton-toluen-air-asam
asetat (650:100:10025)
Metanol-aseton-air
(20:40:3)

Ninhidrin

Ninhidrin
UV

Silika
Dosisiklin

disemprot

Metilen klorid-metanol-

EDTA 10%,

air (59:35:6)

UV 280 nm

pH 9,0
Benzen-metanolKetamin (serbuk)

Silika

amonium hidroksida

Dragendorff

(80:20:1)
Dikembangkan dengan
Morfin
(penyalahgunaan
obat)

Nifedipin (serbuk)
Nitrofurantoin
(serbuk)
Nistatin (salep
dengan kliquinol)

Silika

cara 2 dimensi:

(dijenuhkan

sikloheksan-toluen-

dengan NaOH

dietilamin (75:15:10)

0,1 N)

lalu kloroform-metanol

Silika

(9:1)
Diisopropill eter
Nitrometan-metanol

UV 254
Dipanaskan,

(9:1)

UV 254

Benzen-metanol (9:1)

UV 254 nm

Silika
Silika

UV 279 nm

Silika (yang
Progesteron
(serbuk)

telah
diaktifkan
pada suhu

Kloroform-etil asetat
(2:1)

UV 241 nm

105oC)
Prostaglandin
(serbuk)

Etil asetat-isooktanSilika

etanol-asam format
(35:0,5;0,1)

Asam
fosfomolibdat

Teofilin (kapsul
dengan
guuaifensin)
Vinblastin
(serbuk)
Vinkristin
(injeksi)

Selulosa

Silika
Silika

Metanol-air

UV 254 nm

Benzen-kloroform-

UV 254 nm
dietilamin (40:20:3)
Eter-metanol-metilamin Amonium
40% (40:20:3)

sulfat

BAB III
PENUTUP
A.

Kesimpulan
Berdasarkan uraian di atas dapat disimpulkan:
1) KLT merupakan bentuk kromatografi planar , yang fase diamnya berupa
lapisan seragam (uniform) pada permukaan bidng datar yang didukung
oleh lempeng kaca, plat aluminium, atau plat plastik.
2) Keuntungan KLT yaitu ketepatan penentuan kadar baik karena komponen
yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak. Kerugiannya
memerlukan waktu untuk menentuan sistem eluen yang cocok.

3) Prinsip

KLT

yaitu

pemisahan

komponen-komponen

berdasarkan

perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam dibawah gerakan pelarut
pengembang.
4) Fase diam yang sering digunakan pada KLT yaitu silika gel sedangkan
fase gerak (eluen) merupakan campuran dari dua pelarut atau lebih.
5) Kerja dengan KLT dimulai dari (1) penyiapan plat, eluen dan sampel, (2)
penotolan, (3) elusi, (4) deteksi bercak/noda.
6) Cara mendeteksi bercak ada 2 yaitu menggunakan UV dan campuran zat
kimia tertentu.
7) KLT bisa digunakan untuk analisis obat seperti Asetaminofen, Albendazol,
Amoksisilin, Ampisilin, dan lain-lain.

DAFTAR PUSTAKA

Day, R.A., & Underwood, L.A., 2002, Analisa Kimia Kuantitatif, Erlangga,
Jakarta.
Gandjar, IG dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar.
Yogyakarta.
Gritter RJ, Bobbit JM, Arthur SE. 1991. Pengantar Kromatografi. Penerbit ITB.
Bandung
Hostettmann K, Hostettmann M, Marston A. 1995. Cara Kromatografi Preparatif.
Penerbit ITB. Bandung.
Khopkar, S.M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI-Press, Jakarta.
Sastroharmidjojo H. 1985. Kromatografi. Penerbit Liberty. Yogyakarta.
Sudjadi.1988. Metode Pemisahan. Penerbit Kanisius.Yogyakarta.
Watson, DG. 2010. Analisis Farmasi. Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta.

Khopkar, S.M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI-Press, Jakarta.

.