I.

JUDUL PERCOBAAN
Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis

II. TUJUAN PERCOBAAN

Pada akhir percobaan mahasiswa harus mengerti mengenai:
a. Tekhnik-tekhnik dasar kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis
b. Prinsip dasar dari kromatografi
c. Prinsip dasar dasar pengaruh dari substituen terhadap substitusi elektrofil pada
senyawa aromatik.

III.

LATAR BELAKANG TEORI

Kromatografi adalah suatu tekhnik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan

pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam. Untuk memisahkan komponen
(berupa molekul) yang berada pada larutan molekul yang terlarut dalam fase gerak,
akan melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang
kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat disbanding molekul yang
berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam molekul dapat dipisahkan berdasarkan
pergerakan dalam molekul (Wikipedia, 2010).
Kromatografi adalah tekhnik untuk memisahkan campuran menjadi
komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-masing komponen. Alat
yang digunakan terdiri atas kolom yang didalamnya diisikan fasa stasioner (padatan
atau cairan). Campuran ditambahkan kekolom dari ujung yang satu dan campuran
akan bergerak dengan bantuan pengembang yang cocok (fasa mobil). Campuran atau
pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom
yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisisen partisi fase gerak dan fase
diam (Takeuchi, 2009).
Menurut Takeuchi, 2009, bhwa beberapa contoh kromatografi yang sering
digunakan dilaboratorium, antara lain:
a. Kromatografi partisi
b. Kromatografi kertas
c. Kromatografi kertas
d. HPLC
Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu
sampel yang ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel

berdasarkan perbedaan kepolaran. Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan

perbedaan kepolaran antara sampel dan pelarut yang digunakan. Tekhnik ini biasanya
menggunakan fase diam dari bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan
jenis sampel yang ingin dipisahkan. Larutan atau campuran yang digunakan
dinamakan eluen. Semakin dekat kepolaran antara sampel dan eluen, maka sampel
akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut (Wikipedia, 2010).
Nilai Rf juga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam,
sehingga nilai Rf juga disebut faktoor retensi. Nilai Rf dapat dihitung dengan rumus
berikut:
Rf = jarak yang ditempuh oleh substansi
Jarak yang ditempuh oleh pelarut
Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak
bergeraknya

senyawa

tersebut

pada

plat

kromatografi

lapis

tipis.

Saat

membandingkan dua sampel yang berbeda dibawah kondisi kromatografi yang sama
nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut kurang polar dan berinteraksi dengan
adsorbent polar dari kromatografi lapis tipis (Wikipedia, 2010).
Kromatografi kolom merupakan tekhnik kromatografi yang paling awal
dilakukan. Ditinjau dari mekanismenya kromatografi kolom merupakan kromatografi
partisi atau adsorpsi (soebagio, dkk, 2000).
Pada dasarnya kromatografi lapis tipis (KLT atau TLC = Thin Layer
Chromatography) sangat mirip dengan kromatografi kertas, terutama pada cara
melakukannya. Perbedaan nyata terlihat pada media pemisahnya, yakni digunakannya
lapisan tipis adsorben halus yang tersangga pada papan kaca, aluminium, atau plastic
sebagai pengganti kertas. Lapisan tipis adsorben ini pada proses pemisahan berlaku
sebagai fase diam (soebagio, dkk, 2000).
Kromatografi kolom-terbuka biasa dipakai secara luas karena caranya yang
sederhana. Jika kita memakai silika gel 30 mg cuplikan per gram penjerap 50-200 m
dapat dipisahkan (Versele dan Geeraert, 1980) tetapi beban yang tinggi ini hanya
mungkin jika Rf komponen yang akan dipisah berbeda jauh (K. Hostettman, dkk,
1995: 27).

Menurut Hostettman, dkk, 1995, pembatasan kromatografi kolom terbukaklasik ialah sebagai berikut:
a. Pemisahan lambat
b. Penyerapan linarut yang tidak bolak-balik
c. Tidak dapat dipakai jika partikel terlalu kecil
Salah satu metode pemisahan yang memerlukan pembiayaan paling murah
dan memakai peralatan paling dasar ialah kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP).
Walaupun KLTP dapat memisahkanbahan dalam jumlah gram, sebagian besar
pemakaian hanya dalam jumlah mg (milligram). KLTP bersama-sama dengan
kromatografi kolom terbuka, masih dijumpai dalam sebagian besar publikasi
mengenai isolasi bahan alam, terutama dilaboratorium yang tidak dilengkapi dengan
pemisahan modern. Akan tetapi, seperti yang akan diterangkan kemudian, terdapat
banyak masalah pada KLTP atau kromatografi lapis tipis preparatif (K. Hostettman,
dkk, 1995: 9).
Adsorbent dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai penunjang
fase diam. Fase bergerak akan merayap sepanjana fase diam dan terbentuklah
kromatogram (SM. Khopkar, 2008: 164).
Biasanya yang sering digunakan sebagai materi pelapisnya adalah silika gel,
tetapi kadangkala bubuk selulosa dan tanah diatome, kieselguhr, juga digunakan
untuk fase diam hidrofilik dapat digunakan pengikat seperti semen paris, kanji,
disperse koloid plastic, silika terhidrasi. Untuk meratakan pengikat dan zat pada
pengadsorpsi digunakan suatu aplikator (SM. Khopkar, 2008: 164).
Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas komponenkomponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi masing-masing komponen
diantara dua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak. Perbedaan kecepatan perpindahan
itersebut dapat dipisahkan oleh perbedaan kemampuan oleh masing-masing
komponen untuk diserap (adsorpsi) atau perbedaan distribusi diantara dua fasa yang
tidak saling bercampur (partisi) (Tim Dosen Kimia Organik, 2011: 39).
Pemisahan suatu campuran secara kromatografi dapat dilakukan dengan
mengikuti beberapa tekhnik kromatografi, yaitu kromatografi kolom, kromatografi

kertas, dan kromatografi lapis tipis (TLC). Kedua tekhnik terakhir dianggap sebagai
bentuk terbuka dari kromatografi kolom (Tim Dosen Kimia Organik, 2011: 39).

IV.ALAT DAN BAHAN

a. Alat
1. Termometer 300 0C
2. Erlenmeyer 50 mL
3. Penangas air
4. Kolom gelas
5. Botol elusi 1 buah
6. Botol uap iodium
7. Pipa kapiler
8. Kapas
9. Corong pisah 500 mL
10. Gelas kimia 50 mL
b. Bahan
1. Silika gel TLC
2. Kristal iod
3. Pelat KLT
4. Asam nitrat pekat (HNO3) 1,5 Ml
5. Fenol 1,5 gram (C5H6OH)
6. Kloroform (CCl4) 2,5 Ml
7. Natrium sulfat anhidrat (Na2SO4.H2O)
8. Benzene (C6H6)
9. tissue
10. air es
11. korek api

V. CARA KERJA
a. Nitrasi fenol
1. Memasukkan 1,5 mL HNO3 pekat kedalam 3,5 mL air, dinginkan sampai 5 0C.
2. Menambahkan campuran tersebut kedalam 1,5 gram fenol yang ditempatkan
dalam erlenmeyer 50 mL.
3. Mengaduk, mengatur suhu campuran antara 2-5 0C selam 15 menit, kemudian
antara 3-5 0C selama 15 menit dengan cara mendinginkannya dalam air.
4. Menambahkan 3,5 mL air es, lalu mengekstrak dua kali dengan 5 mL CCl4.
5. Mencuci lapisan-lapisan organik dua kali dengan air, kemudian mengeringkannya
dengan natrium sulfat anhidrat dan menguapkan pelarutnya diatas penangas air.
b. Pembuatan kromatografi kolom
1. Menyiapkan kolom gelas yang berisi penyumbat kapas dan selapis pasir bersih,
dan mengisi kedalamnya metilen klorida atau CCl4.

2. Menuangkan perlahan-lahan alumina kedalam kolom (jangan sampai ada

gelembung udara). Menambahkan pula selapis pasir bersih. Menurunkan
permukaan pelarut, hingga mencapai permukaan alumina dalam kolom.
3. Seluruh campuran nitrasi diatas yang dilarutkan dalam sedikit metilen klorida/
CCl4, kita menuangkannya diatas permukaan alumina/kolom.
4. Melakukan elusi dengan metilen klorida, atur pengeluaran metilen klorida secara
teratur.
5. Satu pita kuning akan terlihat dengan jelas bila campuran mulai menuruni kolom.
6. Menampung fraksi-fraksi eluen apabila tetes-tetes kuning sudah mulai keluar dari
kolom. Penampungan diganti setiap 10 mL, hingga 8-10 fraksi terkumpul.
c. Pemeriksaan lapis tipis
1. Masing-masing fraksi yang diperoleh diatas, diteteskan pada plat-plat lapis tipis
silika gel.
2. Setelah menetesi pelat lapis tipis dengan fraksi, pelat tersebut ditempatkan berdiri
dalam botol eluen yang berisi benzena setinggi kira-kira 1 cm, lalu mengelusi
dengan benzena.
3. Tetesan noda awal jangan sampai terendam.
4. Setelah selesai elusi, mengeringkan diudara dan kita dapat melihat bercak-bercak
noda hasil pemisahan setelah menyimpannya dalam botol uap iodium jenuh.
5. Menentukan harga Rf.

VI.HASIL PENGAMATAN
1. Nitrasi Fenol
1,5 mL HNO3 pekat (bening) + 3,5 mL air
(bening)
pekat dipisahkan

larutan bening + 1,5 gram fenol

larutan hitam pekat + 5 mL kloroform

larutan hitam pekat + natrium sulfat anhidrat (putih)

larutan hitam
larutan

hitam pekat (belum mengkristal)+ silika gel (putih) impregenasi serbuk abu-abu
2. Kromatografi Kolom
Kloroform (CCl4) bening + silika gel (putih) diaduk/dicampur + CCl 4 (bening) +
serbuk (hasil dari nitrasi fenol)

larutan hitam pekat dan kuning + CCl4 bening

dielusi
larutan hitam pekat dan kuning
warna kuning (ditampung)
3. Kromatografi Lapis Tipis
Meneteskan eluen diatas plat lapis tipis (silika gel), kemudian masukkan plat silika

gel kedalam chamber yang telah diisi benzena, kemudian plat di angkat dan di
keringkan. Lalu plat dimasukkan kedalam botol uap iodium jenuh yang telah

dipanaskan hingga terlihat bercak-bercak noda dan beri tanda. Kemudian ditentukan
harga Rf- masing-masing fraksi dapat dilihat pada table berikut:
Fraksi
1
2
3
4
5
6
7

Jarak noda
0,9 cm
0,9 cm
2,8 cm
0,9 cm
3,4 cm
3,4 cm
0,3 cm

Rf
0,225 cm
0,225 cm
0,7 cm
0,225 cm
0,85 cm
0,85 cm
0,075 cm

.
2

1 cm

4 cm

0,25 cm

.
1

0,3 cm

4 cm

0,075 cm

.
2

1 cm

4 cm

0,25 cm

.
1

0,3 cm

4 cm

0,075 cm

.
2

1 cm

4 cm

0,25 cm

VII.

jarak pelarut
4 cm
4 cm
4 cm
4 cm
4 cm
4 cm
4 cm

ANALISIS DATA

Diketahui: Jarak eluen= 4 cm

Jarak fraksi 1= 0,9 cm
Jarak raksi 2= 0,9 cm
Jarak raksi 3= 2,8 cm
Jarak raksi 4= 0,9 cm
Jarak raksi 5= 3,4 cm
Jarak raksi 6= 3,4 cm
Jarak raksi 7: I= 0,3 cm
II= 1 cm
Jarak raksi 8: I= 0,3 cm
II= 1 cm
Jarak raksi 9: I= 0,3 cm
II= 1 cm
Ditanyakan: Rf=..?
Penyelesaian: Rf= jarak noda/fraksi

Jarak eluen/benzena
0,9 cm = 0,225
4 cm
Rf (2)= 0,9 cm = 0,225
4 cm
Rf (3)= 2,8 cm = 0,7
4 cm
Rf (4)= 0,9 cm =0,225
4 cm
Rf (5)= 3,4 cm = 0,85
4 cm
Rf (6)= 3,4 cm = 0,85
4 cm
Rf (7) noda 1= 0,3 cm = 0,075
4 cm
noda 2= 1 cm = 0,25
4 cm
Rf (8) noda 1= 0,3 cm = 0,075
4 cm
noda 2= 1 cm = 0,25
4 cm
Rf (9) noda 1= 0,3 cm = 0,075
4 cm
noda 2= 1 cm = 0,25
4 cm
Rf (1)=

VIII. PEMBAHASAN
1. Nitrasi Fenol
Pada percobaan ini, larutan HNO3 pekat ditambahkan dengan beberapa mL air
menghasilkan larutan yang berwarna bening. Adapun fungsi dari HNO 3 pada
percobaan ini, yaitu sebagai penyedia ion nitrit (NO 2+) pada fenol, sedangkan air
berfungsi untuk mengencerkan atau mengubah larutan yang sangat pekat menjadi
kurang pekat atau tidak pekat, dalam hal ini yang diencerkan adalah HNO3 pekat.
Setelah itu, campuran tersebut ditambahkan kedalam fenol yang ditempatkan
dalam erlenmeyer, dan terjadi perubahan warna larutan menjadi hitam pekat. Hal ini
disebabkan adanya gugus OH dalam fenol yang mengaktifkan cincin benzena.
OH
OH
+ HNO3
NO2
Fenol

Asam nitrat

orto-Nitrofenol

Sebelum penambahan HNO3 kedalam fenol, campuran HNO 3 didinginkan

hingga suhu 5 0C. Karena reaksinya merupakan eksoterm, jadi apabila HNO 3
langsung ditambahkan kedalam fenol akan mengakibatkan kenaikan entalpi.
Setelah campuran HNO3 dan fenol didinginkan pada suhu 5 0C, campuran
diekstrak dengan klorofom (CCl4). Fungsi dari kloroform atau CCl4 pada percobaan
ini, yaitu untuk mengekstrak nitrofenol yang masih ada dalam campuran. Pada saat
diekstrak dengan CCl4 larutan tetap berwarna hitam pekat. Kemudian campuran
ditambahkan

dengan

Na2SO4.H2O

(Natrium

sulfat

anhidrat),

penambahan

Na2SO4.H2O ini bertujuan untuk mengeringkan larutan sehingga terbentuk endapan

karena Na2SO4.H2O berfungsi mengikat air yang tersisa dalam larutan. Setelah itu,
larutan dipanaskan dengan penangas air untuk menguapkan pelarutnya sehingga
diperoleh nitrofenol yang murni.
2. Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom fungsinya untuk memisahkan campuran atau senyawa
dari komponen-komponennya berdasarkan kecepatan migrasi komponen-komponen
tersebut. Dalam hal ini komponen-komponen yang akan dipisahkan ialah ortonitrifenol, para-nitrofenol, 2,4- dinitrofenol, dan 2,4,6- trinitrofenol dari campuran
HNO3 dan fenol.
Pada percobaan kromatografi kolom dilakukan dengan mencampurkan CCl4
(bening) dengan sampel dari hasil nitrasi fenol (nitrofenol) pada serbuk silika gel,
dimana setelah campuran diaduk campuran tersebut dimasukkan dalam kolom gelas
yang sebelumnya diisi dengan CCl4 yang berfungsi untuk menghasilkan atau
memisahkan pita kuning pada campuran HNO3 dan fenol karena pita kuning tersebut
yang merupakan komponen-komponen dari nitrofenol yang akan diidentifikasi pada
kromatografi lapis tipis.
Setelah itu, dalam kolom gelas akan tampak campuran hitam pekat dan
lapisan kuning (pita kuning) setelah itu larutan mulai dielusi dengan CCl4. Dibawah
ini gambar kolom pada saat elusi baru dimulai:

Apabila warna kuning mulai menetes

dari

kolom,

maka

proses

penampungan dimulai, hingga 8-10

fraksi terkumpul (pada percobaan ini dihasilkan 9 fraksi). Pada saat melakukan elusi,
pada kolom gelas akan nampak lapisan-lapisan zat, yaitu lapisan atas CCl 4, lapisan
bawah silika gel yang berwarna keruh dan ditengah-tengah kolom akan nampak pita
kuning yang perlahan-lahan akan terpisah pada saat melakukan elusi. Hal ini
disebabkan oleh prbedaan kepolaran zat dalam campuran tersebut sehingga zat
membentuk lapisan-lapisan dalam kolom.
Dibawah ini gambar kolom gelas pada saat pita kuning mulai menuruni kolom:

Pada saat nitrofenol mulai dielusi, sampel mengalami adsorpsi secara

berulang-ulang, dan menetes dengan kecepatan yang berbeda-beda untuk stiap zat
penyusun sampel. Hal ini disebabkan oleh adanya dorongan dari senyawa polar pada
nonpolar menuruni kolom.
3. Kromatografi Lapis Tipis
Pada percobaan ini, masing-masing fraksi yang diperoleh dari kromatografi
kolom ditotolkan pada plat silika gel, kemudian dimasukkan kedalam botol (chamber)
yang berisi benzena setinggi 1 cm. pada percobaan ini benzena digunakan sebagai
fase geraknya dan plat silika gel sebagai fase diam. Fase gerak benzena akan
merambat melalui lempeng atau plat silika gel, kemudian komponen-komponen yang
berbeda akan bergerak dengan kecepatan berbeda dari masing-masing fraksi. Ini
disebabkan oleh perbedaan kepolaran zat yang terpisah, dimana semakin besar harga
Rf suatu zat maka besar pula kepolarannya.
Harga Rf dihitung dari jarak noda yang tampak pada plat silika gel yang telah
diuapkan dalam botol uap iodium jenuh. Dari hasil perhitungan Rf dengan
perbandingan jarak noda dengan jarak eluen (benzena), diperoleh untuk fraksi 1 Rfnya = 0,225, fraksi 2 Rf-nya = 0,225, fraksi 3 Rf-nya = 0,7, fraksi 4 Rf-nya = 0,225,
fraksi 5 Rf-nya = 0,85, fraksi 6 Rf-nya = 0,85, dan untuk masing-masing noda
pertama dan kedua pada fraksi 7,8,9 adalah 0,075 dan 0,025.
Berdasarkan harga Rf yang diperoleh dari masing-masing fraksi dapat
diasumsikan bahwa fraksi 1, 2, dan 4 merupakan 2,4- dinitrofenol karena Rf-nya
mendekati 0,2. Fraksi 3, 5, dan 6 merupakan o-nitrifenol karena Rf-nya mendekati
0,9. Untuk masing-masing fraksi 7, 8, dan 9 pada noda pertama merupakan 2,4dinitrofenol dan noda kedua merupakan p-nitrofenol. Sedangkan untuk 2, 4, dan 6trinitrofenol tidak teridentifikasi pada kromatografi lapis tipis.
Dibawah ini struktur komponen-komponen yang diperoleh:
OH

OH
NO2

OH

OH
NO2 NO2

NO2

NO2
o-nitrofenol

p-nitrifenol

NO2
2,4-dinitrofenol

NO2
2,4,6-trinitrofenol

IX.KESIMPULAN DAN SARAN

a. Kesimpulan
1. Kromatografi merupakan tekhnik pemisahan suatu campuran senyawa atas
komponen-komponennya berdasarkan distribusi molekul-molekul diantara dua
fase, yaitu fase diam dan fase gerak.
2. Pada kromatografi kolom, fase geraknya kloroform atau CCl 4 dan fase diamnya
yaitu kolom gelas. Sedangkan pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya plat
silika gel dan fase geraknya ialah benzena.
3. Pada kromatografi kolom, campuran senyawa pada kolom gelas terpisah menjadi
beberapa lapisan tergantung dari kepolaran dan massa jenis atau berat jenis zat.
Sedangkan kromatografi lapis tipis yang ditentukan ialah harga Rf dari masingmasing fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, dimana semakin polar
suatu zat semakin besar pula harga Rf-nya.
4. Berdasarkan harga Rf yang diperoleh dari 9 fraksi, maka:
fraksi 1, 2, dan 4 merupakan 2,4- dinitrofenol. Fraksi 3, 5, dan 6 merupakan onitrifenol. Untuk fraksi 7, 8, dan 9 pada noda pertama merupakan 2,4dinitrofenol dan noda kedua merupakan p-nitrofenol. Sedangkan untuk 2, 4, dan
6- trinitrofenol tidak teridentifikasi.
b. Saran
1. Untuk para praktikan agar lebih teliti dalam melakukan percobaan, agar
percobaan berjalan lancar.
2. Agar sekiranya para pembimbing lebih meningkatkan perhatiannya pad para
praktikan, agar tidak terjadi kesalahan dalam melakukan praktikum.

DAFTAR PUSTAKA
Hosttetman. 1995. Cara Kromatografi Kolom Preparatif. Bandung: Institut Teknologi
Teknologi Bandung (ITB).
SM, Khopkar. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: VIP
Soebagio, dkk. 2003. Kimia Analitik II. Makassar: JICA
Takeuchi, Yoshito. 2009. Kromatografi. http://wikipedia. Diakses pada tanggal 18
April 2011.
Wikipedia. 2010. Kromatografi Lapis Tipis. http://id.wikipedia.org. diakses pada
tanggal 18 April 2010.

JAWABAN PERTANYAAN
1. Menurut teori semakin kurang kepolaran zat yang terdapat pada campuran maka
Rf-nya semakin besar, berdasarkan teori tersebu maka dapat disimpulkan bahwa
urutan kepolaran fraksi fenol adalah
2,4,6-trinitrofenol = 0,05

2,4-dinitrofenol = 0,2
p-nitrofenol = 0,4
o-nitrofenol = 0,9
2. Suatu tekhnik pendeteksian yang biasa dilakukan untuk senyawa-senyawa organic
adalah dengan penyemprotan H2SO4. Langkah ini kemudian diikuti dengan
pemanasan untuk mengarangkan dan mengembangkan noda-noda hitam untuk
keperluananalisa kualitatif yang diinginkan diperiksa secara instrumental dan
larutan hasil ekstraksi.