Anda di halaman 1dari 11

LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI DASAR
Pewarnan Gram dan Pengujian KOH Bakteri
NAMA : MUSLIMIN
STAMBUK : D1C14016
KELAS : Teknologi Pangan A
PROGRAM STUDI TEKONOLOGI PANGAN
JURUSAN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS HALU OLEO
2014I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri
merupakan mikrorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik,
bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras dengan air.
Sehinga melihat dan mengamati bakteri dalam kedan hidup sangat sulit. Untuk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnan sel bakteri.
Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitan-penelitan
mikrobiologi. Hal itu untuk mempernudah proses identifikasi bakteri.
Banyak metode atau tahapan standar yang dilakukan dalammengidentifikasi
mikroba, salah satunya berdasarkan sifat kimiawinya. Sel terdiridari berbagai
bahan kimia. Bila sel mikroba diberi perlakuan kimiawi, maka selini
memperlihatkan susunan kimiawi yang spesifik. Sebagai contoh disini adalah
bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air,
dimanasel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati
bentuk sel bakteri sehinga mudah untuk didentifikasi ialah dengan metode

pengecatan atau pewarnan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat
fisiologisnya yaitumengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian
pengecatan.
Dalam taksonomi mikroba alat yang paling ampuh digunakan yaitu
pewarnan Gram (Gram Stain), yang dapat digunakan untuk memisahkan
angota- angota dominan bakteria ke dalam dua kelompok berdasarkan
perbedan dinding selnya. Bakteri gram positf memilki dinding sel yang
lebihsederhana,dengan jumlah peptidoglikan yang relatif banyak. Dinding sel
bakteri
gram-negatif memilki peptidoglikan yang lebih sedikit dan secara struktural ebih
kompleks. Membran bagian luar pada dinding sel gram-negatif mengandung
lipopolisakarida, yaitu karbohidrat yang terikat dengan lipid. Diantara bakteri
patogen,yang menyebabkan penyakit,spesies gram-negatif umumnya lebih
berbahaya dibandingkan dengan spesies gram-positf
Melihat dari berbagai devinisi yang telah disebutkan diatas maka kami
sangat tertarik untuk melakukan pengujian guna untuk mengidentifikasi dan
mengetahui morfologi dari bakteri utamanya pada bakteri yang ber gram positf
dan gram negatif serta dapat mengetahui morfologi bakteri aerob dan anaerob
dengan cara pewarnan gram, uji KOH dan uji fisiologis mikroba.
B. Tujuan dan Kegunan
Tujuan dari praktikum ini adalah untuk melihat bentuk bakteri dan
mempelajari cara pewarnan.
Kegunan dari praktikum ini adalah untuk melihat bentuk bakteri dan
mempelajari cara pewarnanI. TINJAUAN PUSTAKA
Mikrorganisme sulit dilhat dengan mikroskop cahaya, karena tidak
mengadsorbsi atau pun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat
warna digunakan untuk mewarnai mikrorganisme karena zat warna

mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehinga kontras mikrorganisme dengan


lingkunganya ditngkatkan.
Karakterisasi merupakan salah satu kegiatan yang dilakukan untuk
mengobservasi bakteri maupun kapang hasil isolasi (isolat). Kegiatan karakterisasi
dapat dilakukan berdasarkan sifat sitologi (bentuk sel, gerak atau motiltas, sifat
Gram dan endospora), sifat morfologi, dan sifat fisiologi. Uji sifat morfologi
mencakup sifat-sifat koloni, seperti ukuran, bentuk, warna dan tepian, sedangkan
uji sifat fisiologi diantaranya uji hidrolisis pati, hidrolisis lemak, hidrolisis protein
dan uji katalase (Subandi, 209).
Pewarnan Gram dan spora dapat dilakukan dalam uji sifat sitologi suatu
bakteri. Prinsip pewarnan Gram adalah kemampuan dinding sel terhadap zat
warna dasar (Kristal violet) setelah pencucian alkohol 96%. Bakteri Gram positf
terlihat berwarna ungu karena dinding selnya mengikat Kristal violet lebih kuat,
sedangkan sel Gram negatif mengandung lebih banyak lipid sehinga pori-pori
mudah membesar dan Kristal violet mudah larut sat pencucian alkohol.
Pewarnan spora dilakukan untuk mengetahui ada atau tidaknya spora pada
bakteri. Spora dapat terbentuk sat kondisi tidak memungkinkan pertumbuhan
bakteri. Spora juga mampu mengikat warna lebih cepat dan sukar melepaskanya
(Fardiaz, 207).Pewarnan gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu
untuk
membedakan bakteri apakah gram positf atau gram negatif, bakteri dicampur
dengan tetesan air steril pada gelas objek, kemudian disebarkan ditengah gelas
obyek sehinga membentuk lapisan tipis dan difiksasi. Dengan kristal violet
olesan bakteri digenangi selama dua menit, lalu dicuci dengan air mengalir, dan
dikering anginkan. Diberi yodium selama dua menit, dicuci dengan air mengalir
dan dikeringanginkan. Selanjutnya diberi larutan pemucat yaitu alkohol 95%, tetes
demi tetes sampai zat warna ungu tidak terlihat lagi, lalu dicuci pada air mengalir

dan dikeringanginkan. Kemudian dogenangi lagi dengna safranin selama 30 detik,


lalu dicuci dan dibiarkan kering diudara. Warna merah pada olesan bakteri
menujukan bakteri gram negatif dan jika warna ungu menunjukan bakteri gram
positf (Michael, 208).
Bakteri memilki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokos, dan spirilum.
Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam.
Pada bentuk basil pembagianya yaitu basil tungal, diplobasil, dan tripobasil.
Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak),
diplokokus, sampai sthapylococus (bentuknya mirip buah angur). Khusus pada
spiral hanya di bagi dua yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung.
Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnan gram. Teknik pewarnan
gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negative
ditandai dengan pewarnan ungu sedangkan yang positf berwarna merah
(textbok, 208). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada
akhirnya dapat di identifikasi dengan mudah, selain itu, ada endospora
adalahorganism yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang
memilki kemungkinan untuk tetap berlanjut dilngkungan sampai kondisi
menjadi baik (ncbi, 208).
Teknik pewarnan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat
mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positf atau gram negative
sehinga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalanya
mekanisme pewarnan gram. Pewarnan Gram atau metode Gram adalah salah
satu teknik pewarnan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk
mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi
dikenai larutan-larutan berikut :zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan
alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandinganya berupa zat warna
safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya,

ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan


teknik ini pada tahun 184 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri
Klebsiela pneumonia. Dengan metode pewarnan Gram, bakteri dapat
dikelompokan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positf (berwarna ungu/biru) dan
bakteri Gram negatif (berwarna merah).
Perbedan dua kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel
menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi
oleh alkohol. Bakteri gram positf tidak mengalami dekolorisasi karena tetap
mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir pengecatan tidak
terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol dan
pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin.Menurut Pelzar
et al (205), macam-macam pewarnan antara lain
pewarnan sederhana yaitu dengan mengunakan larutan tungal suatu pewarna
pada lapisan tipis yang sudah di fiksasi. Pewarnan diferentsial yaitu prosedur
pewarnan yang menampilkan perbedan diantara sel-sel mikroba atau bagianbagian sel mikroba dari pewarnan gram adalah teknik pewarnan diferensial
digunakan untuk bakteri.
Menurut Pratiwi (209), selain merupakan gram-gram yang tersusun atas
ion positf dan negative, yang salah satunya berwarna dan disebut kromofor
(chromofor). Pewarnan pada dasarnya adalah prosdur mewarnai mikrorganisme
dengan mengunakan zat warna yang dapat menonjolkan strktur tertentu dari
mikrorganisme yang ingin kita amati. Bakteri gram positf akan
mempertahankan zat warna krisktal violet dan karenanya akan tampak bewarna
ungu tua dibawah mikroskop. Adapun bakteri gram negates akan kehilangan zat
Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna
tandinganya yaitu dengan zat warna air tochsin atau safranin akan tampak merah.
Perbedan warna ini disebabkan olh perbedan struktur kimiawi dinding selnya.

(wapedia, 2010). Adakala suatu perlu diwarnai dua kali setelah zat warna yang
pertama
(ungu) terserap, maka sedian dicuci dengan alkohol, kemudian ditumpangi
dengan zat warna yang berlainan, yaitu dngan zat warna merah. Jika sedian itu
kemudian kita cuci dengan air lau dengan alkohol maka dua kemungkinan dapat
terjadi. Pertama, zat tambahan terhapus, sehinga yang tampak ialah zat warna
asli (ungu). Dalam hal ini sedian (bakteri) kita sebut gram positf. Kedua zatwarna
tambahan (merah) bertahan hinga zat warna asli tidak tampak. Dalam hal
ini sedian (bakteri) jika kita katakana gram negatif (Dwioseputro, 205). Bakteri
dapat diklasifikasikan menjadi aerob dan anaerob. Perbedan utama
antara kedua adalah kenyatan bahwa bakteri aerobik membutuhkan oksigen
untuk tetap hidup, sementara bakteri anaerob tidak bergantung pada oksigen untuk
proses metabolisme dan kelangsungan hidup. Sedangkan aerob dapat berkembang
di habitat yang memilki oksigen berlimpah, anaerob dapat mati dalam dengan
adanya oksigen. Jenis bakteri memang memilki keungulan pertumbuhan area
tubuh tidak terpapar oksigen, dan mereka bisa menjadi patogen virulen. Perbedan
kapasitas untuk memanfatkan oksigen antara aerob dan anaerob penting dalam
pengobatan infeksi tubuh (Lay, 206).
Identifikasi dan determinasi suatu biakan murni bakteri yang diperoleh dari
hasil isolasi dapat dilakukan dengan cara pengamatan sifat morfologi koloni,
morfologi sel bakteri, pengujian sifat-sifat fisiologi dan biokimianya. Selain itu,
identifikasi juga dapat dilakukan dengan penguraian sifat patogenitas dan
serologinya. Pertumbuhan bakteri di alam dipengaruhi oleh beberapa faktor luar
seperti susbtrat, pertumbuhan , pH, temperatur, dan bahan kimia. Bakteri yang
nampak dapat memilki morfologi yang sama, namun keperluan nutrisi dan
persyaratan ekologinya berbeda. Untuk pengamatan morfologi bakteri dengan
jelas ,tubuhnya perlu disi dengan cat warna, pewarnan ini disebut pengecatan

ekteri (Ratna, 207).II. METODE PRAKTIKUM


A. Tempat dan Waktu
Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Agroteknologi Unit
Bioteknologi Fakulatas Pertanian Universitas Halu Oleo Hari Jumat, 31 Oktober
2014 pukul 10:0 1:30 WITA.
B. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah jarum ose, lampu spritus
(lampu Bunsen), pipet mikro, dan kaca benda. Bahan yang digunakan pada
praktikum ini adalah biakan murni, st21e, agt a
2014, ralstonia, alcohol, larutan KOH 3% dan zat warna. C. Prosedur Praktikum
Pewarnan sederhana
1. Membuat olesan bakteri pada kaca benda.
2. Difiksasi.
3. Member zat warna utama yaitu amonium oksalat Kristal violet (beripa larutan)
selama 1 2 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir.
4. Memberi mordan yaitu larutan iodium selama 1 2 menit, dicuci dengan air
mengalir.
5. Meneteskan larutan alkohol aseton sedikit sedikit demi sedikit, sehinga
larutan yang mengalir tadi berwarna menjadi tidak berwarna.6. Meneteskan zat
pewarna penutup yaitu larutan berwarna merah atau karbon
selama 2 3 menit.
7. Mencuci dengan air mengalir, dikeringkan.
8. Mengamati di bawah mikroskop dengan minyak inersi.
9. Mengambar bentuk bakteri dan warnanya.
Uji KOH
1. Mengambil satu ose biakan bakteri bacilus dan campurkan 2 tetes larutan
KOH 3%, di atas gelas objek.

2. Mengaduk secara merata dengan jarum ose, tarik jarum ose ke atas gelas objek
dan amati pembentukan lendir. Jika terbentuk lendir mengindikasikan bakteri
gram negatif (-), jika tidak berlendir mengindikasikan bakteri gram positf (+).
3. Lakukan hal yang sama (prosedur 1 dan 2) untuk isolat-isolat bakteri lainya.IV.
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
Hasil pengamatan dapat dilhat Tabel berikut:
Tabel 1. Pengamatan pada pengujian KOH 3%
No Kode isolat
Hasil pengamatan
Uji KOH 3% keterangan
Reaksi gram Bakteri gram
1. ST21E Positf Negatif Berlendir
2. RALSTONIA Negatif Positf Tidak berlendir
3. AGT A2014 Positf Negatif Berlendir
B. Pembahasan
Pewarnan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positf dan
gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram
(18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 184 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiela pneumoniae.
Dengan metode pewarnan Gram, bakteri dapat dikelompokan menjadi
dua, yaitu bakteri Gram positf dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat
bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh
komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan
pada mikrorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp

Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus
Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia.
Bakteribakteridari kedua genus ini diketahui memilki sejumlah besar zat lipodial
(berlemak) di
dalam dinding selnya sehinga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak
permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehinga sel bakteri tersebut tidak
terwarnai oleh metode pewarnan biasa, seperti pewarnan sederhana atau Gram.
Dalam pewarnan gram diperlukan empat reagen yaitu :
1. Zat warna utama (C.Gention Violet).
2. Lugol(zat Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna
utama memperkuat reaksi.
3. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang
digunakan untuk melunturkan zat warna utama.
4. Zat warna kedua /cat penutup (air fuksin) digunakan untuk mewarnai kembali
sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alcohol.
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnan Gram. Bakteri gram-positf akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,
sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnan Gram, suatu pewarna
penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua
bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini
berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedan
struktur dinding sel mereka.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu:
1. Pemberian cat warna utama (C.Gention Violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan Lugo.3. Pencucian
(dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna air fuksin


Perbedan dasar antara bakteri gram positf dan negatif adalah pada
komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel
dan membran sitoplasma organisme gram positf, sedangkan penyingkiran zat
lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol
memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positf memilki membran tungal
yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative
lapisan peptidoglikogenya tipis (1-3 nm).
Sifat bakteri terhadap pewarnan Gram merupakan sifat penting untuk
membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedan sifat yang dapat
dijumpai antara bakteri Gram positf dan bakteri Gram negatif yaitu:
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu: Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15
mm, berlapis tiga atau multilayer. Dinding selnya mengandung lemak lebih
banyak (1-2%), peptidoglikan
terdapat d idalam. lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari
berat kering,
tidak mengandung asam tekoat. Kurang rentan terhadap senyawa penisiln.
Pertumbuhanya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal
violet. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana. Tidak resisten
terhadap ganguan fisik. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat Peka
terhadap streptomisin
Toksin yang dibentuk Endotoksin
Ciri-ciri bakteri gram positf yaitu: Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm,
berlapis tungal atau
monolayer. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%),
peptidoglikan ada
yang sebagai lapisan tungal. Komponen utama merupakan lebih dari 50%
berat ringan. Mengandung asam tekoat. Bersifat lebih rentan terhadap penisiln.
Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. Lebih resisten terhadap ganguan

fisik. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut. Tidak peka terhadap
streptomisin
Toksin yang dibentuk Eksotoksin EndotoksinV. PENUTUP
A. Kesimpulan
Gram memilki dinding sel yang tebal dan lemak yang tipis sedangkan
gram berlemak tebal dan berdinding sel tipis yang berada di ruang periplasma.
penentuan sifat gram dengan KOH 3% (disebutKOH string test) memilki hasil
yang sama dengan pewarnan gram.
Semua bakteri memilki enzim proteinase tapi tidak semuanya memilki
enzim proteinase ekstraseluler, aktivitas enzim ini juga dapat dibuktikan dengan
adanya zona bening di sekeling koloni. Jenis bakteri yang dapat menghidrolisis
protein adalah bakteri yang memproduksi enzim proteinase ekstraseluler
B. Saran
pada praktikum ini banyak prosedur yang harus dilakukan secara telit dan
tepat, sehinga disarankan agar setiap perlakuan dilakukan sesuai rosedur dan
aturan- aturan agar hasil pengamatan sesuai dengan yang diharapkan.DARTAR
PUSTAKA
Dwioseputo. 205. Dasar- dasar Mikrobiologi. Jakarta: PT Penerbit Djambatan.
Fardiaz. 207. Mikrobiologi Dasar Jild I. Jakarta :Erlanga. Lay.206. Mikrobiologi Dasar,
diterjemahkan oleh: Markham, M.sc.Jakarta:
Erlanga.
Michael. 208. Microbiology 2nd Editon USA : WMC Brown Publisher.
Ncbi. 208 .Dasar- dasar Mikrobiologi Jild 1 Jakarta: UI Pres.
Ratna. 207. Teknik Pewarnan Bakteri. Gramedia. Jakarta.
Subandi,U.209. Mikrobiologi dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.
Wapedia. 2010. Mikrobiologi Dasar. Jatinangor: Fmipa Unpad.