Anda di halaman 1dari 12

LAPORAN MAGANG

BALAI UJI STANDAR KARANTINA IKAN PENGENDALI MUTU

KULTUR SEL

SEKAR AYU CHAIRUNNISA

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT., atas segala limpahan nikmat yang
telah diberikan, sehingga penulis dapat menyelesaikan Laporan Magang di Balai Uji Strandar
Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan (BUSKI-PM), Cipayung.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ir. Asep Dadang Koswara, MSi., selaku kepala Balai
Uji Strandar Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan (BUSKI-PM)
Cipayung yang sudah memberikan ijin kepada penulis untuk melakukan kegiatan magang, dan
Seluruh staf, khususnya kepada staf Laboraturium Kultur Sel (Ir. Rini Widayati, MP., Dra.
Trisniaty, dan drh. Insariani) yang telah banyak membimbing dalam proses kegiatan magang.
Penulis menyadari bahwa laporan ini tidak luput dari kekurangan dan masih jauh dari
kesempurnaan. Oleh karena itu, kritik dan saran yang membangun sangat bermanfaat bagi
penulis.
Jakarta,

September 2015

Sekar Ayu Chairunnisa

DAFTAR ISI

DAFTAR ISI

iii

DAFTAR GAMBAR

iv

PENDAHULUAN

MATERI

METODE
Pembuatan Media L15
Pasase
Panen dan Penyimpanan Sel
Preparasi Virus
Infeksi Virus
Panen dan Penyimpanan Virus

2
2
3
3
3
4
4

HASIL
Pasase
Infeksi Virus KHV

5
6

DAFTAR PUSTAKA

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Tipe Kultur


Gambar 2. Hasil Pasase Hari Ke-1
Gambar 3. Hasil Pasase Hari Ke-2
Gambar 4. Hasil Pasase Hari Ke-3
Gambar 5. Penampakan Sel Normal Sebelum Infeksi
Gambar 6. Penampakan Sel 72 Jam Pasca Infeksi (Cytopathic Effect (CPE) pada Sel )

1
5
5
6
7
7

PENDAHULUAN
Pengembangan kultur jaringan digunakan dalam investigasi virus penyebab penyakit
karena metode tersebut memungkinkan diproduksinya virus dalam jumlah lebih banyak sebagai
sumber antigen (Malole, 1990). Kultur sel merupakan kumpulan sel yang berasal dari jaringan
atau organ yang telah dipilah dan diuraikan secara enzimatis ataupun mekanis menjadi suspense
sel yang dibiakkan dan berkembang dalam lingkungan buatan yang sesuai dan mejadi satu
lapisan jaringan (monolayer) di atas permukaan flask. Jaringan tersebut dapat dapat diperbaharui
lagi melalui subkultur (pasase) sehingga diperoleh sel yang lestari (cell line) (Freshney, 1994;
invitrogen.com/cellculturebasics).

Pembuatan kultur sel dari ikan pertama kali dilaporkan oleh Wolf and Quimby (1962) dan
terus berkembang. Hingga saat ini lebih dari 150 kultur sel dari ikan telah dibuat dan dilaporkan
(Fryer and Lanan, 1994). Kultur sel dari ikan yang tersedia diperbanyak secara in vitro dengan
menggunakan teknik serta reagen yang telah dikembangkan. Tidak seperti sel-sel pada burung
atau mamalia, sel pada ikan membutuhkan perawatan yang tidak begitu sulit dan mampu
mereplikasi dalam berbagai suhu inkubasi, sehingga memungkinkan jadwal kultur yang
fleksibel. Umumnya, kultur sel dari ikan ini digunakan untuk studi tentang virus sehingga dapat
mendeteksi dan mendiagnosis penyakit yang disebebkan oleh agen penyakit tersebut (Lannan,
1994). Virus merupakan agen penyakit yang sangat berbahaya dan dapat menimbulkan kerugian
ekonomi yang sangat tinggi. Hal ini terjadi pada populasi ikan mas dan ikan koi yang terinfeksi

virus herpes (koi herpesvirus) sehingga menyebabkan kematian masal yang mencapai 80-90%
dalam kurun waktu yang sinngkat (Parelberg et al, 2003).
Koi herpesvirus dikenal juga sebagai cyprinid herpes virus-3 (CyHV-3) dan digolongkan
sebagai virus DNA utas ganda dalam keluarga Herpesviridae (Waltzek et al. 2005). Koi
herpesvirus menyerang bagian dalam sel ikan sehingga tidak dapat ditembus oleh antibiotik yang
pada umumnya hanya bekerja pada permukaan sel. Usaha pengendalian wabah KHV lebih
difokuskan pada proses pencegahan, salah satunya melalui diagnose yang akurat. Virus
merupakan organisme yang hanya dapat hidup dan berkembang pada sel hidup, oleh karena itu
ketersediaan kultur sel penting dalam usaha penegakan diagnose penyakit viral (Malole, 1990;
Freshney, 1994).
MATERI
Bahan yang digunakan dalam proses kultur sel dan infeksi virus pada sel kultur, yaitu Sel
KF-1, Organ Positif KHV, media L15, Fetal Bovine Serum (2%; 5%), Trypsin 0,25%, PBS (pH
7.4), DMSO 10%, HBSS, Pasir Steril, Aquabidest, dan Alkohol 70%.
Alat yang digunakan dalam proses kultur sel dan infeksi virus pada sel kultur, yaitu Flask
25 ml, Flask 50 ml, Pipet 1 ml, Pipet 2 ml, Pipet 10 ml, Pipet 25 ml, Corning tube 50 ml, Tube 2
ml, Syringe 10 ml, Parafilm, Milipore 0.45 m, Mortar, Sentrifuge, Laminar Air Flow, Stirer,
Disecting kit, Autoclave, Inkubator 200C, Inkubator 280C dan Freezer -800C.
METODE
a.

Pembuatan Media L15


Aquabidest disiapkan sebanyak 1 L yang kemudian diautoclave untuk proses sterilisasi.

Setelah diautoclave, tambahkan media L15 serbuk dan homogenkan dengan menggunakan
hotplate stirrer (tanpa penggunaan suhu). Setelah homogen, media dapat langsung digunakan
atau dapat disimapan didalam kulkas hingga akan digunakan.

b.

Pasase

Pasase dilakukan pada sel yang memiliki konfluensi berkisar antara 70-80%. Seluruh
media pada kultur sel sebelumnya dibuang kemudian ditambahkan dengan PBS pH 7.4 steril
sebannyak 5 mL dan sel dicuci sebanyak 2 kali dengan cara dibilas pada dinding flask. Setelah
PBS dibuang, Trypsin 0.025% ditambahkan ke dalam lapisan monolayer dan diamkan selama 12 menit. Setelah 1-2 menit trypsin dibuang dan sel diamati dengan menggunakan mikroskop
sampai sebagian besar sel melepaskan diri dari flask dan secara hati hati flask di ketuk hingga sel
terlepas membentuk sel tunggal. Media L15+2% serum ditambahkan kedalam flask tersebut
sebanyak 6 ml, kemudian homogenkan dengan pipetting. Selanjutnya suspense tersebut
dimasukkan kedalam flask baru ukuran 25 cm 2 sebanyak 2 ml/flask, kemudian masing-masing
flask di tambahkan dengan 5 ml media L15+2%. Kultur sel hasil pasase diinkubasi dalam
incubator pada suhu 200C. Pengamatan sel dilakukan setiap hari hingga kultur sel akan dipanen
atau digunakan untuk dipasase dan isolasi virus (1-5 hari pasca pasase)
c.

Panen dan penyimpanan Sel


Pemanenan kultur sel dilakukan setelah mencapai umur 3-5 hari. Seluruh media pada kultur

sel sebelumnya dibuang kemudian ditambahkan dengan PBS pH 7.4 steril sebannyak 5 mL dan
sel dicuci sebanyak 2 kali dengan cara dibilas pada dinding flask. Setelah PBS dibuang, Trypsin
0.025% ditambahkan ke dalam lapisan monolayer dan diamkan selama 1-2 menit. Setelah 1-2
menit trypsin dibuang dan sel diamati dengan menggunakan mikroskop sampai sebagian besar
sel melepaskan diri dari flask dan secara hati hati flask di ketuk hingga sel terlepas membentuk
sel tunggal. Media L15+2% serum ditambahkan sebanyak 3x volume trypsin. Suspesi sel
tersebut dipindahkan kedalam tabung steril dan di sentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan
100-150 g. Supernatant yang terbentuk dibuang dan sel yang tertinggal didasar tabung dilarutkan
dengan 1 mL media L15+20% serum yang telah ditambahkan dengan anti-freezing agent 10%
(DMSO). Sel disimpan pada suhu -800C.
d.

Preparasi Virus
Virus koiherpes diisolasi dari organ ikan mas atau ikan koi yang terifeksi virus KHV, misal

Insang. Insang yang terinfeksi virus KHV ditimbang dengan berat maksimal 1 gram. Setelah
ditimbang, organ dipindahkan ke dalam mortar yang telah diberi sedikit pasir steril dan di
hancurkan hinggal halus. Larutan HBSS+2% serum ditambahkan sebanyak 9 kali volume
kedalam suspense jaringan dan diaduk secara perlahan. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan
1500 rpm selama 15 menit pada suhu 4 0C. Supernatant yang di dapat sebanyak 5 ml

dipindahakan kedalam tabung baru dan dilakukan pengenceran dengan perbandingan 1:5 dengan
larutan HBSS + 2% serum. Larutan tersebut kemudian difilter untuk menghilangkan kontaminan
(bakteri dan jamur) dengan menggunakan miliopore filter 0.45m kedalam tabung baru steril.
Filtrate homogenate tersebut dapat langsung digunakan untuk menginfeksi virus atau disimpan
pada suhu -800C.
e.

Infeksi/inokulasi Virus
Sel KF1 hasil pasase diamatai untuk melihat konfluensi dari sel tersebut (konfluensi hasil

pasase harus berkisar antara 70-80%). Kultur sel diinfeksi dengan filtrate homogenate virus
dilakukan secara duplo dengan satu kontrol. Seluruh media pada kultur sel sebelumnya dibuang
kemudian ditambahkan dengan PBS pH 7.4 steril sebannyak 5 mL dan sel dicuci sebanyak 2 kali
dengan cara dibilas pada dinding flask. Setelah PBS dibuang, virus hasil isolasi dimasukkan
kedalam masing-masing flask tersebut sebanyak 1 ml/flask, kecuali pada kontrol (tambahkan
HBSS). Setelah periode absorbsi selama 45 menit, 5 ml media L15 + 2% serum ditambahkan
kedalam masing-masing flask sebanyak 5 ml. sel hasil infeksi di inkubasi pada suhu 28 0C.
Pengamatan Cytophatic Effect (CPE) dilakukan setiap hari hingga virus siap untuk dipanen (CPE
mencapai 50%).
f.

Panen dan penyimpanan Virus


Pemanenan virus dilakukan setelah CPE mencapai 50%. Media kultur yang sebelumnya

telah di infeksi dengan virus di ambil dan di pisahkan kedalam masing-masing tube 2 mL,
kemudian virus disimpan pada suhu -800C.

HASIL
a.

Pasase
Perkembangan kultur sel hasil pasase dapat tumbuh dengan baik dalam media Leibovitzs

L-15 dengan penambahan 5% Fetal Bovine Serum (FBS) dan diinkubasi pada suhu 20 0C. sel
hasil pasase menunjukkan pertumbuhan sel (sel tumbuh dan berkembang dengan cara membelah
diri) setelah diinkubasi selama 24 jam (Gambar 2). Kumpulan sel mulai banyak terbentuk pada
Phasase hari ke-1

Phasase hari ke-1


Phasase hari ke-1

hari kedua yang selanjutnya mulai terlihat pembentukan sel selapis (monolayer) pada hari ke-3
dengan konfluensi sekitar 70% (Gambar 3 dan 4).

Gambar 2. Hasil Pasase Hari ke-1 (

proses pembelahan sel)

Gambar 3. Hasil Pasase Hari ke-2 (

proses pembelahan sel)

Gambar 4. Hasil Pasase Hari ke-3


Pertumbuhan sel secara in vitro membutuhkan sejumlah media untuk pertumbuhannya
(Sugiri, 1992). Untuk mempertahankan kehidupan sel sehingga bisa dilakukan subkultur, kultur
sel perlu ditambah bahan nutrien dengan penggantian media lama dengan yang baru secara
keseluruhan atau hanya sebagian (Paul, 1972 dan Malole, 1990). Penggantian media jangan
dilakuakan terlalu cepat dan sering karena dapat menyebabkan kematian sel. Hal tersebut
diakibatkan karena sel belum menempel (attach) pada permukaan flask dengan sempurna dan
membentuk monolayer yang lebih stabil sehingga mengakibatkan sel tidak tumbuh sempurna
dan akhirnya mati sebelum waktu pasase.
b.

Infeksi Virus KHV


Virus diisolasi dari berbagai jaringan ikan yang menunjukan gejala klinis terserang virus

KHV, diataranya adalah insang, ginjal, limpa, usus dan hati. Sel yang belum diinfeksi dengan
virus KHV masih akan terlihat normal (Gambar 5). Perkembangan virus hasil infeksi akan
menunjukkan cytopathic effect (CPE) pada sitoplasma sel yang dapat dilihat 72 jam pasca infeksi
(Gambar 6). CPE akan semakin terlihat jelas pada hari-hari selanjutnya, dimana jumlah sel KF-1
akan berkurang akibat kembang biak dari virus yang terus menggerogoti sel inang tersebut.
Hedrick et al (2005) menyatakan bahwa virus diinduksi oleh sel fusi dan cytoplasmic
vacuolation pada sel KF-1 dalam waktu 5 hari setelah inokulasi pada suhu 200C. CPE atau sel
yang lisis semakin jelas terlihat pada hari ke 7 10, dimana virus tersebut semakin berkembang
(memakan semua sel) setelah mencapai 14 hari.

Keterangan :
K : Kontrol (Sel Normal)
A : Sel Normal
B : Sel Normal

Gambar 5. Penampakan Sel Normal Sebelum Infeksi

Keterangan :
K : Kontrol (tanpa infeksi virus)
A : Infeksi Virus KHV (
Cytopathic Effect (CPE) )
B : Infeksi Virus KHV (
Cytopathic Effect (CPE) )
Gambar 6. Penampakan Sel 72 Jam Pasca Infeksi (Cytopathic Effect (CPE) pada Sel)
DAFTAR PUSTAKA
Fernandez, R.D., M.Yoshimizu, Y. Ezura and T. Kimura. 1993. Comparative growth response of
fish cell lines in diffrent media, temperatures, and sodium chloride concentrations. Fish
Pathol. 28: 27- 34.
Freshney, R. I. 1994. Culture of animal cells: A manual of basic technique. 3rd ed. Wiley-Liss.
Inc. USA.
Fryer JL and Lannan CN. 1994. Three decades of fish cell culture: A current listing of cell lines
derived from fishes. Journal of tissue culture methods 16:87-94.
Kumar, G.S., I.S.B.Singh and R.Philip. 2001. Development of cell culture system from the
ovarian tissue of African catfish (Clarias gariepinus). Aquaculture, 194: 51-62.
Lannan CN. 1994. Fish cell culture: A protocol for quality control. Journal of tissue culture
methods 16: 95-98.
Malole, M. B. 1990. Kultur sel dan jaringan hewan. Pusat Antar Universitas, IPB. Bogor.
Paul, J. 1972. Cell and tissue culture. 4th ed. Edinburgh, Churchill Livingstone.

Perelberg A, Smirnov M, Hutoran M, Diaman A, Bejerano Y, Kotler M. 2003. Epidemiological


description of a new viral disease afflicting cultured Cyprinus carpio in Israel. IJABamidgeh 55(1): 5-12
Sugiri, N. 1992. Biologi sel vol 1. Pusat Antar Universitas. IPB. Bogor 203 hlm.
Waltzek T.B., Kelly G.O., Stone D.M., Way K., Hanson L., Fukuda H., Hirono I., Aoki T.,
Davison A.J, and Hedrick R.P. 2005. Koi herpesvirus represent a third cyprinid
herpesvirus (CyHV-3) in the family Herpesviridae. Jornal of General Virolog 86:16591667.
Wolf, K. and M.C. Quimby. 1962. Established eurythermic line of fish cells in vitro. Science.
135: 1065-1066
www. Invitrogen. Com. Cell Culture Basics. Cell Culture Basics Companion Handbook
(Diunduh pada 26 Agustus 2015)