Anda di halaman 1dari 24

I.

Tujuan
I.1 Dapat memahami cara kerja instrumen HPLC
I.2 Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat mengikuti manual
pengoperasian HPLC.
I.3 Dapat menentukan/menghitung kadar akrilamid.
II. Prinsip Dasar HPLC
HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah
campuran komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiaap komponen
dalam sampel berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan HPLC dengan
kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa
gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah
RMe2SiCl, dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C8. Sementara fasa geraknya berupa
larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi), misalnya : air:asetonitril (80:20), hal ini
bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah
berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada
spektrum yang punsak-puncaknya terpisah.
Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi karena
perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Keunggulan
menggunakan HPLC dibandingkan kromatografi gas yaitu terletak pada kemampuannya
untuk menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil pada suhu tinggi. HPLC tidak
terbatas pada senyawa organik tapi mampu menganalisis senyawa anorganik, mampu
menganalisis cuplikan yang mempunyai molekul tinggi (beratnya), mampu menganalisis
cuplik yang mempunyai titik didih yang sangat tinggi seperti polimer.
III.Dasar Teori
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan tipe kromatografi
elusi yang paling serbaguna dan digunakan secara luas. Teknik ini digunakan oleh para
kimiawan untuk memisahkan dan menentukan spesi-spesi dalam berbagai bahan atau
senyawa seperti senyawa organik, anorganik, maupun material biologis. Pada
kromatografi cair, fasa gerak merupakan pelarut cair berisi sampel yang berupa campuran
dari bahan-bahan terlarut. Jenis-jenis kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) biasanya

dikelompokkan

oleh

mekanisme

pemisahannya

ataupun

jenis

fasa

diamnya.

Pengelompokkan tersebut diantaranya:


a)
b)
c)
d)
e)
f)

Partisi atau Kromatografi Cair-Cair


Adsorpsi atau kromatografi Padat-Cair
Penukar Ion atau Kromatografi Ion
Size-Exclusion Chromatography (Kromatografi Eksklusi Ukuran)
Kromatografi Afinitas
Kromatografi Kiral
Ada dua cara pengelusian dalam kromatografi cair kinerja tinggi, yaitu elusi

isokratis dan elusi gradien. Elusi yang menggunakan pelarut tunggal dengan komposisi
tetap atau campuran beberapa pelarut ynag komposisinya dibuat tetap disebut elusi
isokratik. Sedangkan pada elusi gradien, digunakan dua (atau kadang lebih) pelarut dalam
suatu sistem yang memiliki perbedaan kepolaran yang besar/signifikan. Perbandingan dari
kedua atau lebih pelarut ini divariasikan melalui cara yang telah ditentukan dengan
program saat pemisahan berlangsung. Pengubahan perbandingan ini kadang dilakukan
secara terus-menerus dan kadang secara bertahap. Elusi gradien seringkali meningkatkan
efisiensi pemisahan, seperti halnya pemrograman suhu pada GC. Instrumen HPLC
modern biasanya dilengkapi dengan katup yan berpotongan sehingga dapat memasukkan
cairan dari dua atau lebih reservoir dengan perbandingan yang dapat divariasikan secara
terus menerus. (Skoog, 2004: 973-977)
Berdasarkan kepolaran fasa geraknya, HPLC dibagi menjadi 2 macam yaitu :
a.

Fase Normal HPLC


HPLC jenis ini secara esensial sama dengan kromatografi kolom. Meskipun

disebut normal, ini bukan bentuk biasa dari HPLC. Kolom ini diisi dengan partikel silika
yang sangat kecil dan pelarut nonpolar seperti heksan sebuah kolom sederhana memiliki
diameter internal 4,6 mm (dan kemungkinan kurang dari nilai ini) dengan panjang 120
nm-250 nm. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih
lama pada silika yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena
itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. Apabila
pasangan fasa diam lebih polar daripada fasa geraknya maka sistem ini disebut HPLC fase
normal.
b. Fase Balik HPLC

Pada HPLC jenis ini, ukuran kolomnya sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi
non polar melalui pelekatan hidrokarbon dengna rantai panjang pada permukaannya
secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Dalam kasus ini, akan terdapat
interaksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui
kolom. Interaksi yang terjadi tidak sekuat interaksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang
berlekatan pada silika (fasa diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena
itu molekul-molekul polar akan lebih cepat bergerak melalui kolom. Sedangkan molekulmolekul non polar akan bergerak lambat karena interaksi dengan gugus hidrokarbon.
Fasa gerak
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah satu
dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada
solven yang digunakan untuk KCKT/HPLC, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat
disukai, yaitu rasa gerak harus:
1) Murni, tidak terdapat kontaminan.
2) Tidak bereaksi dengan wadah (packing)
3) Sesuai dengan defektor
4) Melarutkan sampel
5) Memiliki visikositas rendah
6) Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7) Diperdagangan dapat diperoleh denganharga murah (reasonable price)
Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena
prosedur pemumiannya kembali sangat membosankandan mahal biayanya. Dari semua
persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.
Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk KCKT/HPLC
yang menggunakan pompa bolak balik (reciprocating pump) sangat diperlukan terutama
bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang tidak
dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor sehingga data
yang diperoleh tidak dapat digunakan (the data may be useless). Menghilangkan gas
(degassing) juga sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitif terhadap udara
(contoh: kolom berikatan dengan NH2). (Effendy De Lux Putra, 2004: 7-8)
Komponen-komponen alat dalam HPLC diantaranya ialah:

Reservoir (wadah pelarut / cairan)


Pompa
Sistem injeksi sampel
Kolom, terdiri dari:
1. Kolom Analitik / Kolom Utama
2. Kolom Guard
3. Termostat
Detektor
Komputer (Pengolah data)

Reservoir merupakan wadah yang menampung cairan-cairan yang akan digunakan


dalam pemisahan. Cairan-cairan tersebut berupa pelarut. Masing-masing reservoir
dihubungkan kepada katup berpotongan, dimana katup ini berfungsi untuk mengatur
cairan-cairan yang masuk/dipompa kedalam kolom.
Pelarut dimasukkan ke kolom melalui pipa atau selang menggunakan pompa.
Pelarut dipompa dari reservoir sehingga dapat membawa sampel menuju kolom. Pompa
yang digunkan dalam HPLC hatus memenuhi kriteria sebagai berikut:
1) Harus memiliki aliran terkontrol yang reproducible
2) Harus menghasilkan aliran yang pulse-free (bebas pulsa, tidak menghasilkan
gelembung)
3) Hold-up volume (volume tampungan) kecil (R.P. Budhiraja, 2004: 172)
Karena HPLC menggunakan tekanan yang cukup tinggi, mustahil sampel dapat
diinjeksikan dengan cara yang sama seperti pada kromatografi gas. Maka dari itu, sampel
dimasukkan melalui loop injector. Sampling loop dapat diganti dan tersedia pada volume

0,5 mikroliter sampai 2 mililiter. Pada posisi terisi, sampling loop terisolasi dari fasa gerak
dan terbuka terhadap atmosfer. Sebuah syringe dengan kapasitas beberapa kali dari loop
sampling digunakan untuk menempatkan sampel kedalam loop.
Kolom yang paling umum digunakan untuk HPLC dibuat dari stainless steel
dengan diameter internal antara 2,1 mm dan 4,6 mm dengan panjang mulai dari sekitar 30
mm sampai 300 mm. kolom-kolom ini dipak dengan 3-10 mikrometer partikel-partikel
silika berpori yang dapat berbentuk irregular atau spherical. Kolom ini berfungsi sebagai
tempat pemisahan berlangsung.
Terdapat dua masalah yang menyebabkan kolom analitik berkurang masa
hidupnya. Pertama, zat terlarut yang mengikat fasa diam secara irreversibel menurunkan
performa kolom karena fasa diam yang tersedia menjadi berkurang. Kedua, material
partikulat yang diinjeksikan bersama sampel dapat menyumbat kolom analitik. Maka dari
itu, kolom guard ditempatkan sebelum kolom analitik untuk meminimalisasi masalahmasalah tersebut. Kolom guard biasanya berisi material partikulat packing dan fasa diam
yang sama dengan kolom analitik, namun jauh lebih pendek dan murah. Panjangnya 7,5
mm dan harganya satu persepuluh dari kolom analitik. Hal ini dikarenakan kolom guard
digunakan sebagai tumbal dan diganti secara berkala.
Selanjutnya sampel yang telah terpisahkan dibawa menuju detektor. Detektor ini
berfungsi untuk memberikan sinyal sehingga data dapat diolah dan ditampilkan. Detektordetektor yang dapat digunakan dalam HPLC diantaranya:

Detektor Spektroskopi (adsorpsi sinar UV)


Detektor elektrokimia
Selain itu, ada juga detektor yang menggunakan pengukuran pada perubahan

index refraksi dari fasa gerak, namun kurang berguna untuk elusi gradien kecuali
komponen-komponen fasa gerak memiliki index refraksi yang mirip. (Harvey David,
2000: 578-585).
Keuntungan KCKT/HPLC
KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam
banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang
sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat
yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau

tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT
menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih besar bagi para analis
laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada KCKT karena teknik ini dapat
digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya digunakan.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik,
antara lain:
1) Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated),
waktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai.
2) Resolusi: Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana
interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi
dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.
Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa gerak
pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang
diinginkan.
3) Sensitivitas detektor: Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT
dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacammacam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi
jumlah sampai picogram(10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer
Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT.
4) Kolom yang dapat digunakan kembali: Berbeda dengan kolom kromatografi
klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang
bisa dilakukan dengan kolom yang sma sebelum darijenis sampel yang diinjeksi,
kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan Ideal untuk zat
bermolekul besar dan berionik :zat zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG
karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisi spsesies
ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis
zat zat tersebut.
5) Mudah rekoveri sampel: Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak
menyebabkan destruktif(kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh
karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah

melewati detector.Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali


untuk kromatografi penukarion memerlukan prosedur khusus.
(Effendy De Lux Putra, 2004: 8)
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan
baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan
teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit dalam kromatogram,
dibandingkan dengan luas/area standar. Pada prakteknya, pembandingan

kurang

menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar. Oleh karena itu, maka
pembandingaan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.
Komponen-komponen instrumentasi HPLC
a. Fasa Gerak
Fasa gerak dari HPLC merupakan zat cair yang disebut eluen atau pelarut. Dalam
HPLC fasa gerak selain berfungsi untuk membawa komponen-komponen campuran
menuju ke detektor, selain itu juga dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu,
fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penetu keberhasilan proses
pemisahan. Persyaratan zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak sebagai berikut:
1) Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan
dianalisis.
2) Zat cair harus murni, untuk menghindari masuknya kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatogram.
3) Zat cair harus jernih, untuk meghindari penyumbatan pada kolom.
4) Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun.
5) Zat cair tidak kental dan harus sesuai dengan detektor
Fasa gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari
partikel-partikel kecil. Selain itu adanya gas dalam fasa gerak juga harus dihilangkan,
sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama do pompa dan detektor
sehingga akan mengacaukan analisis.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fasa gerak tetap selama
elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang
analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien diguakan

untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai
kisaran polaritas yang luas.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik
adalah campuran larutan buffer dengan metanol atua campuran air dengan asetonitril.
Untuk pemisahan dengan fase normal, fasa gerak yang paling sering digunakan adalah
campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan
pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding
fase terbalik.
b. Kolom
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stailess steel, akan tetapi ada juga yang terbuat
dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tepat terjadinya pemisahan
campuran menjadi komponen-komponen. Bergantung keperluannya kolom utama dapat
digunakan untuk analisis atau preparatif setiap komponen yang keluar kolom ditampung
pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colector
selain kolom utama dikenal pula kolom pengaman
Kolom utama berisi fasa dian dan jenisnya bervariasi bergantung pada keperluan,
misalnya dikenal kolom C8, C-18, cyanopropyl, dan penukar ion. Kolom utama untuk
HPLC biasanya berukuran panjang berkisar antara 5-30 cm dan diameter dalam berkisar
4,510 mm.
Kolom pengaman (guard coloumn) disebut juga pra-kolom karena letaknya
sebelum sistem pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek 5 cm dengan diameter
4,6 mm biasanya dipaking dengan partikel silika berukuran besar dari ukuran partikel
kolom utama. Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaitu: menyaring kotoran yang
terbawa oleh fasa gerak dan untuk menjenuhkan fasa gerak dalam rangka menghindarkan
terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut.
Kolom merupakan jantung kromatograf, keberhasilan atau kegagalan analisis
bergantung pada pilhan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi
dua kelompok:
1) Kolom analitik

Garis tengah dalam 2-6 mm, panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk
kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm, untuk kemasan mikropartikel
berpori biasanya 10-30 cm.
2) Kolom preparative
Umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar, dan panjang 25-100 cm.
c. Pompa
Pada HPLC, pompa ini berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui
kolom yang berisi serbuk halus. Digunakan pompa bertekanan tinggi dalam metode ini
sebagai akibat penggunaan fasa gerak yang berupa zat cair yang akan sukar mengalir
dalam kolom yang dipadatkan dengan serbuk halus. Oleh karena itu, agar zat cair dapat
melewati kolom secara tepat maka dibutuhkan bantuan pompa yang bertekana tinggi.
Pompa yang digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan sebagai berikut:

Menghasilkan tekanan sampai 5000 psi

Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit

Bahan tahan korosi

Keluaran bebas pulse

Dikenal 3 jenis pompa yang masing-masing memiliki keuntungan yaitu :


1) Pompa Reciprocatin
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan
cara gerakan piston maju mundur yang dijalankan oleh motor. Gerakan piston
memberikan aliran eluen yang konstan, memiliki volume internal kecil (35-400
mL) menghasilkan tekanan tinggi (sampai 10.000 psi). Piston berupa batang gelas
dan berkontak lengsung dengan pelarut.
2) Pompa Displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) tersiri dari tabung yang
dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Menghasilkan aliran yang
cenderung tidak tergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.
Memiliki keterbatasan kapasitas pelarut (250 mL) dan tidak mudah untuk
pergantian pelarut.
3) Pompa Pneumatic

Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi.Pompa jenis
ini murah, tetapi memiliki keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan
(<2000 psi) kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik
kolom.
d. Injector Sample
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara langsung ke dalam fase gerak
yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat
dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample
loop) internal atau eksternal.
Salah satu jenis penyuntik untuk memasukan sampel ke dalam sistem (kolom)
kromatografi adalah penyuntik loop. Dalam prakteknya, loop tidak perlu diisi penuh, tapi
bila tidak diisi penuh akan mengakibatkan lebih jeleknya presisi hasil eksperimen dan
ketergantungan presisi tersebut kepada bagaimana si-operator menggunakan penyuntik.
Perlu diingat, bahwa penyuntik tidak boleh dicabut sebelum pegangan (handle) penyuntik
diputar dari posisi load (pengisap) ke posisi inject (suntik). Karena sampel akan
mengalir ke saluran pembuangan. Hal yang terakhir ini tentunya tidak diinginkan,
pegangan penyuntik harus diputar cepat agar pemutusan aliran ke dalam diinginkan.
Pegangan penyuntik harus diputar cepat agar pemutusan aliran ke dalam kolom, antara
posisi pengisian (load) dan posisi penyuntikan (inject) berlangsung cepat.
Yang menjadi faktor ketidak tepatan pengukuran HPLC salah satunya terletak
pada keterulangan pemasukan cuplikan kedalam paking kolom. Masalahnya kebanyakan
memasukan cuplikan kedalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karen
itu cuplikan yang dimasukkan harus sekecil beberapa puluh mikroliter. Beberapa teknik
pemasukan cuplikan kedalam sistem dapat diuraikan sebagai berikut :
1) Injeksi Syringe
Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang
tahan tekanan sampai 1500 psi. Akan tetapi keterulangan injeksi stringe ini sedikit lebih
baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek.
2) Injeksi Stop Flow
Aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan
cuplikan disuntikan langsung kedalam ujung kolom. Setelah menyambung kembali kolom

maka pelarut dialirkan kembali. Untuk memasukkan cuplikan kedalam fasa gerak perlu
dua langkah : sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dan posisi load.
Cuplikan masih berada dalam loop ; kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi
posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan kedalam kolom (kran cuplikan).
3) Kran Cuplikan
Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan.
Untuk memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu 2 langkah, yaitu: sejumlah
volume cuplikan disuntikan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan masih berada
dalam loop; kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi injeksi dan fasa
gerak membawa cuplikan ke dalam kolom.
e. Detektor
Ada dua jenis detektor yaitu detektor selektif, adalah detektor yang peka terhadap
golongan senyawa tertentu saja. Dan detektor universal, yaitu detektor yang peka terhadap
golongan senyawa apapun kecuali pelarutnya. Diantara detektor yang digunakan dalam
KCKT adalah
1) Detektor Universal
Detektor Ultra Violet Visible (Sinar Tampak) Detektor
UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organik.
Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang, sehingga panjang
gelombang UV yang digunakan dapat dipilih sesuai dengan jenis cuplikan yang
diukur.
Detektor UV-Visible (uv-sinar tampak) paling banyak digunakan, karena
sensitivitasnya yang baik mudah menggunakannya, tidak merusak senyawa yang di
analisis, dan memungkinkan untuk melakukan elusi bergradien. Ada yang dipasang
pada panjang gelombang tetap yaitu pada panjang gelombang 254 nm, dan ada yang
panjang gelombangnya dapat dipilih sesuai dengan diinginkan antara 190-600 nm.
Detektor dengan panjang gelombang variabel ini ada yang dilengkapi alat untuk
memilih panjang gelombang secara otomatis dan dapat me-nol-kan sendiri (allto
zero). Detektor jenis ini juga ada yang menggunakan drode erray (sebagai pengganti
photo tube), sehingga dapat melakukan pembacaan absorban yang kontinyu pada
berbagai panjang gelombang.

Detektor Indeks Bias


Detektor indeks bias memberi respons terhadap senyawa yang dianalisis
apapun, termasuk pelarutnya sendiri. Prinsip dasar kerja detektor ini adalah perubahan
indeks bias karena adanya komponen sampel dalam pelarut. Detektor ini bersifat tidak
merusak (non-destruktif), sensitivitasnya cukup tinggi (minimum 10-6 g) dan
umumnya digunakan dalam pekerjaan preparatif. Dengan detektor ini tidak dapat
dilakukan elusi bergradien. Detektor ini digunakan dalam kromatografi eklusi dan
dalam analisis karbohidrat.
f. Rekorder
Rekorder adalah alat untuk mencetak hasil percobaan pada lembar berupa
kumpulan puncak (kromatogram) kromatogram HPLC yang didapat berguna untuk
analisis kualitatif dan kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam
campuran dan jumlah peak menyatakan jumlah komponen. Analisis kualitatif dapat
dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi (rt) analit atau sampel dengan
waktu retensi standar. Sedangkan analisis kuantitatif depat dilakukan dengan didasarkan
pada luas peak atau tinggi peak dengan metode standar kalibrasi.

(Struktur Akrilamid)

Akrilamida adalah suatu senyawa kimia yang secara alamiah terdapat dalam
produk makanan dan bukan merupakan zat aditif yang sengaja ditambahkan dalam produk
makanan. Senyawa ini terbentuk karena proses pengolahan tertentu misalnya dengan
adanya pemanasan pada suhu tinggi (Harahap, 2006). Akrilamida sering digunakan dalam
penjernihan air minum atau untuk analisa biomolekul di laboratorium. Sejak tahun 1950,
akrilamida diproduksi dengan cara hidrasi akrilonitril dalam bentuk monomer sedang
poliakrilamida ada dalam bentuk polimer dengan rumus kimia (CH 2CHCONH2).
Akrilamida merupakan senyawa kimia berwarna putih, tidak berbau, berbentuk kristal
padat yang sangat mudah larut dalam air dan mudah bereaksi melalui reaksi amida atau
ikatan rangkapnya. Monomernya cepat berpolimerisasi pada titik leburnya atau di bawah

sinar ultraviolet. Akrilamida dalam larutan bersifat stabil pada suhu kamar dan tidak
berpolimerisasi secara spontan (FDA, 2004).
Akrilamida merupakan senyawa intermediat yang dicurigai bersifat karsinogenik
pada manusia. Dalam bentuk murni, akliramida memiliki berat molekul 71,09, titik didih
dan titik leleh masing-masing 125 dan 87,5 Celcius. Akrilamida merupakan faktor yang
menyebabkan penyakit kanker pada sekitar 2% (100-700 dari 45.000) kasus tiap tahun di
dunia, dimana bentuk monomernya bersifat racun terhadap system saraf pusat, sedangkan
bentuk polimer diketahui tidak bersifat toksik (WHO, 2002).
Akrilamida

digunakan

secara

umum

pada

pembuatan

poliakrilamida.

Poliakrilamida komersial mengandung 0,05- 5,0% akrilamida (bergantung pada jumlah


penggunaan poliakrilamida tersebut) dan sekitar 1 mg/kg residu monomer akrilonitril.
Keberadaan akrilamida di dalam air minum sudah banyak diteliti. Namun, sedikit sekali
penelitian yang mengungkapkan bahayanya di dalam makanan sehari-hari (Harahap,
2006).
Hasil penelitian sejumlah pakar teknologi pangan dari Universitas Stockholm
Swedia menyebutkan beberapa jenis pangan olahan yang disukai masyarakat justru
mengandung senyawa yang bisa menyebabkan kanker (karsinogen) dalam kadar tinggi
(Swedish National Food Authority (SNFA). World Health Organization (WHO)
menyebutkan pengolahan makanan berbahan dasar pati (seperti kentang, singkong, beras
dan gandum) pada suhu yang sangat tinggi (di atas 120 oC), baik melalui pemanggangan
atau penggorengan dapat menyebabkan terbentuknya senyawa akrilamida. Hasil temuan
ini merupakan lembaran baru dalam penelitian di bidang pangan, terlebih mengenai
keberadaan akrilamida dalam makanan (WHO, 2002).
Hasil uji toksisitas terhadap hewan percobaan menunjukkan akrilamida terbukti
bersifat karsinogenik. Gangguan kesehatan yang disebabkan akrilamida terjadi karena
dampak genotoksik terutama pada jaringan sel syaraf dan pembuluh darah. Akrilamida
dicurigai lebih bersifat neurotoksik dibandingkan dengan glisidamida. Pada ginjal, hati
dan sistem reproduksi juga terjadi akumulasi. Berdasarkan percobaan pada hewan,
akrilamida diekskresikan dalam jumlah besar melalui urin dan empedu sebagai
metabolitnya (FDA, 2004; Yahdiana, 2006).

World Health Organization (WHO) menyatakan bahwa pada populasi umum, ratarata asupan akrilamida melalui makanan berada pada rentang 0,30,8 g/kg
BB/hari. Environmental Protection Agency (EPA) pada tahun 1992 dan WHO pada tahun
1985 telah membatasi kadar akrilamida dalam air minum sebesar 0,5 g/liter (ppb)
(WHO, 2002). Office of Environmental Health Hazard Assesment (OEAHHA), salah satu
divisi EPA yang berlokasi di California, Amerika Serikat telah menetapkan bahwa 0,2
g/hari akrilamida tidak bersifat sebagai agen pencetus kanker. Sebaliknya hasil
penelitian Badan Pengawas Makanan Swedia menyebutkan bahwa konsentrasi akrilamida
yang sangat besar ditemukan pada makanan yang digoreng (keripik kentang 1200 g/kg;
kentang goreng, 450 g/kg), dan makanan yang dipanggang (sereal dan roti, 100-200
g/kg) (OEAHHA, 2005; Simanjuntak, 2006).
Akrilamida terbentuk dari reaksi pada suhu tinggi antara karbohidrat, protein,
asam amino, serta komponen-komponen lain yang berada dalam jumlah kecil. Mekanisme
pembentukan akrilamida antara lain:
a) Terbentuk dari dekarboksilasi atau dehidrasi bebarapa asam organik tertentu yang
meliputi asam malat dan asam laktat.
b) Terbentuk dari akrolein atau asam akrilat hasil degradasi karbohidrat, lemak, atau
asam amino bebas seperti asparagin, alanin, metionin, dan glutamin yang memiliki
struktur mirip akrilamida.
c) Terbentuk langsung dari asam amino asparagin yang merupakan asam amino
dengan struktur mirip dengan akrilamida dan diduga senyawa tersebut yang paling
berperan dalam pembentukan akrilamida, karena dapat bereaksi dengan gula pada
suhu tinggi.
Mekanisme pembentukan akrilamida lainnya diduga berhubungan dengan reaksi
Maillard yang ditemukan pada tahun 1912 oleh Louis Carnille Maillard. Akrilamida
dianggap sebagai produk samping dari reaksi Maillard yang terjadi antara asam amino
dengan gula pereduksi (glukosa, fruktosa, ribosa, dan lain-lain) atau sumber karbonil
lainnya (WHO, 2002).
Dalam rangka meningkatkan kualitas kesehatan masyarakat, metode analisis kimia
memiliki peran yang amat penting dalam memberikan informasi tentang keamanan suatu
produk pangan. Berbagai metode analisis yang telah dikembangkan untuk penetapan

akrilamida antara lain kromatografi gas-spektrofotometri massa dan kromatografi cair


kinerja tinggi (Lubomir Karasek, 2008).

IV. Alat dan Bahan


Alat
Timbangan analitik
Labu ukur
Mikropipet
Erlenmeyer
Batang Pengaduk
Vial
Gelas Kimia

Bahan
Sampel
Akrilamida pro analisis
Asetonitril pro HPLC
Dinatrium Hidrogen Fosfat

V. PROSEDUR KERJA
1. Pembuatan Fase Gerak

Melarutkan 6,9 gram Na2HPO4


dengan aquadesbilata

Tambahkan H3PO4 hingga


pH mencapai 2,5, tepatkan
dengan aquadesbilata sampai
1000 ml

Dapar saring dengan filter


eluen, buat dengan mencampur
950 ml dapar fosfat PH 2,5 dan
50 ml asetonitril hingga
perbandingan 95:5

2. Pembuatan Larutan Induk Baku Pembanding Akrilami


a. Pembuatan Larutan Induk Pertama 1000 ppm

Ditimbang 50 mg akrilamid

Masukan kedalam labu ukur 50


ml

Tambahkan sedikit pelarut


(asetonitril : dapar fosfat)
kocok hingga larut, tambahkan
pelarut sampai garis tanda

b. Pembuatan Larutan Induk Pertama 100 ppm


Dipipet 5 ml larutan induk
baku pertama

Masukan kedalam labu ukur 50


ml

Tambahkan sedikit pelarut


(asetonitril : dapar fosfat) kocok
hingga larut, tambahkan pelarut
sampai garis tanda

c. Pembuatan Larutan Induk Pertama 1 ppm


Dipipet 0,1 ml larutan induk
baku pertama

Masukan kedalam labu ukur 50


ml

Tambahkan sedikit pelarut


(asetonitril : dapar fosfat)
kocok
hingga
larut,
tambahkan pelarut sampai
garis tanda

d. Pembuatan Larutan Induk 2 ppm

Dipipet 0,2 ml larutan induk


baku pertama

Masukan kedalam labu ukur


50ml

Tambahkan
sedikit
pelarut
(asetonitril : dapar fosfat) kocok
hingga larut, tambahkan pelarut
sampai garis tanda

e. Pembuatan Larutan Induk 3 ppm


Dipipet 0,3 ml larutan induk
baku pertama

Masukan kedalam labu ukur


50ml

Tambahkan
sedikit
pelarut
(asetonitril : dapar fosfat) kocok
hingga larut, tambahkan pelarut
sampai garis tanda

F. Pembuatan Larutan Induk 4 ppm


Dipipet 0,4 ml larutan induk
baku pertama

Masukan kedalam labu ukur


50ml

Tambahkan
sedikit
pelarut
(asetonitril : dapar fosfat) kocok
hingga larut, tambahkan pelarut
sampai garis tanda

g. Pembuatan Larutan Induk 5 ppm


Dipipet 0,5 ml larutan induk
baku pertama

Masukan kedalam labu ukur


50ml

Tambahkan
sedikit
pelarut
(asetonitril : dapar fosfat) kocok
hingga larut, tambahkan pelarut
sampai garis tanda

h. Pembuatan Larutan Induk 5 ppm


Dipipet 0,5 ml larutan induk
baku pertama

Masukan kedalam labu ukur


50ml

Tambahkan
sedikit
pelarut
(asetonitril : dapar fosfat) kocok
hingga larut, tambahkan pelarut
sampai garis tanda

i. Pembuatan Larutan Induk 6 ppm


Dipipet 0,6 ml larutan induk
baku pertama

Masukan kedalam labu ukur


50ml

Tambahkan
sedikit
pelarut
(asetonitril : dapar fosfat) kocok
hingga larut, tambahkan pelarut
sampai garis tanda

VI. Data Pengamatan


Konsentrasi
1 ppm
2 ppm
3 ppm
4 ppm
5 ppm
6 ppm

AUC
2849073
4661931
8329991
10452353
13756294
15427819

VII.

Pembahasan
Praktikum Kimia Analisis Bahan Makanan pada kesempatan kali ini dilakukan

analisis kuantitatif penetapan kadar Akrilamid dengan metode High Performance Liquid
Chromatography (HPLC).
Prinsip dari metode ini pada umumnya sama dengan metode kromatografi, yaitu
didasarkan pada perbedaan kecepatan migrasi solut yang dipengaruhi oleh perbedaan
afinitas solut terhadap fase gerak dan fase diam (Gandjar dan Rohman, 2007). Metode
HPLC ideal untuk analisis beragam obat dalam sediaan dan cairan biologi, karena
sederhana, dan kepekaannya tinggi (Munson, 1984).
Instrumen HPLC memiliki 2 jenis kolom berdasarkan jenis fase gerak dan fase
diam yang digunakan, yaitu kolom normal phase dan kolom reverse phase. Dalam
praktikum ini digunakan instrumen HPLC dengan jenis kolom reverse phase. Kolom
reverse phase kolom yang fase diamnya bersifat nonpolar sedangkan fase geraknya
bersifat polar, kebalikan dari fase normal. Fase diam nonpolar yang paling banyak
digunakan adalah jenis C18, C8, dan C2 (Mulja dan Suharman, 1995).
Fase diam yang digunakan pada kolom reverse phase HPLC pada praktikum ini
adalah C18. Penggunaan kolom reverse phase karena akrilamid merupakan senyawa polar
sehingga akrilamid mampu dipisahkan oleh kolom reverse phase karena kolom reverse
phase memiliki gugus oktadesil silika (ODS atau C18) yang mampu memisahkan senyawa-

senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi (Gandjar dan Rohman,
2007). Selain itu, kolom C18 memiliki jumlah C yang banyak sehingga mengakibat sifat
fase diam ini cenderung bersifat non polar, akibatnya pemisahan terhadap akrilamid akan
semakin baik. Selain itu dengan kolom reverse phase, fase gerak yang digunakan bersifat
polar. Fase gerak yang digunakan pada kolom reverse phase HPLC adalah buffer posfat :
asetonitril (95:5) yang memiliki drajat pro-analisis. Sehingga, dalam penggunaannya pada
metode HPLC harus disaring terlebih dahulu dengan pompa vakum yang berisi membran
filter untuk menyaring pengotor-pengotor bahkan yang berukuran mikro dari fase gerak.
Adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi.
Adanya partikel yang kecil dapat terkumpul dalam kolom atau dalam tabung yang sempit,
sehingga dapat menyebabkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut (Gandjar
dan Rohman, 2007). Pemilihan buffer posfat : asetonitril sebagai fase gerak karena Buffer
posfat : asetonitril merupakan pelarut universal yang dapat mengelusi senyawa-senyawa
yang bersifat polar.
Sebelum dilakukan proses analisis akrilamid dengan metode HPLC. Pertama-tama
dilakukan pengkondisian kolom. Pengkondisian kolom HPLC meliputi pengaturan
tekanan kolom, laju alir fase gerak, serta pencucian kolom dengan menggunakan buffer
posfat : asetonitril. Proses ini dilakukan untuk meningkatkan kepekaan kolom dan
menghindari pengotor atau sisa analit yang masih tertahan pada kolom pada analisis
sebelumnya agar tidak mengganggu analisis dan merusak kolom. Setelah dilakukan
pengkondisian kolom. Selanjutnya dilakukan analisis sampel.
Fase gerak maupun larutan yang dianalisis dialirkan dengan menggunakan sistem
pompa. Pompa dibutuhkan untuk mengalirkan fase gerak dengan tekanan sehingga dapat
mengalir secara terus menerus melalui kolom secara tepat, reprodusibel, konstan, dan
bebas dari gangguan. Proses elusi dilakukan dengan cara isokratik diamana elusi dengan
menggunakan komposisi fase gerak yang sama tanpa ada perubahan perbandingan fase
gerak yang digunakan.
Semua larutan sebelum dialirkan ke sistem harus disaring terlebih dahulu dengan
membran filter dengan tujuan yang sama seperti saat menyaring fase gerak yaitu untuk
menyaring pengotor-pengotor bahkan yang berukuran mikro dari pelarut. Adanya
pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi. Adanya

partikel yang kecil dapat terkumpul dalam kolom atau dalam tabung yang sempit,
sehingga dapat menyebabkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut (Gandjar
dan Rohman, 2007).
Injeksi larutan standar dan sampel ke dalam HPLC harus dilakukan dengan hatihati dan dijaga agar tidak ada gas yang terinjeksikan sebab adanya gas dapat
menimbulkan gelembung dan pengumpulan gas pada komponen lain terutama di pompa
dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Sehingga hasil analisisnya tidak baik.
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak
yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang
dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop). Pada saat pengisian sampel, sampel
digelontor melewati keluk sampel dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Sampel
yang melewati keluk ini adalah 20 L. Pada saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase
gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom (Gandjar dan
Rohman, 2007).
Pada saat praktikum larutan standar dan sampel-sampel cair disuntikan sebesar 40
L. Hal ini dilakukan untuk mengantisipasi cairan yang mungkin tertinggal saat
diinjeksikan, sehingga sampel yang masuk tidak kurang dari 20 L. Larutan standar yang
pertama dielusi adalah larutan standar dengan konsentrasi terkecil untuk mengantisipasi
jika ada larutan yang tertinggal saat elusi. Dimana bila kita mengukur dari konsentrasi
yang paling besar, kemungkinan adanya sisa konsentrasi dari larutan ini lebih besar.
Sehingga akan mempengaruhi konsentrasi larutan yang lebih kecil yang diukur
selanjutnya. Kemungkinan jika konsentrasi larutan yang tertinggal tadi ikut terbaca maka
AUC yang dihasilkan oleh larutan dengan konsentrasi yang lebih kecil, menjadi lebih
besar dibandingkan dengan AUC larutan dengan konsentrasi lebih tinggi.
Detektor yang digunakan pada HPLC ini adalah detektor photodiode array (PDA).
Detektor ini merupakan detektor UV-Vis dengan berbagai keistimewaan. Detektor ini
mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada panjang gelombang
yang berbeda dalam sekali proses (single run). Selama proses berjalan, suatu
kromatogram pada panjang gelombang yang diinginkan dapat ditampilkan. Dengan
detektor ini akan diperoleh spektrum UV tiap puncak yang terpisah sehingga dapat
dijadikan sebagai alat yang penting untuk memilih panjang gelombang maksimal untuk

sistem HPLC yang digunakan. Dengan detektor ini pula, dapat dilakukan uji kemurnian
puncak (similiarity factor) dengan membandingkan antara spektra analit dengan spektra
senyawa yang sudah diketahui atau berada dalam library HPLC (Gandjar dan Rohman,
2007).
Untuk analisis kuantitatif penetapan kadar akrilamid dengan metode High
Performance Liquid Chromatography (HPLC). Dibuat 6 konsentrasi. Kemudian
dilakukan penginjeksian larutan standar sampel akrilamid dengan kosentrasi 1 ppm ; 2
ppm ; 3 ppm ; 4 ppm ; 5 ppm ; 6 ppm. Berdasarkan hasil pengamatan terhadap nilai
AUC, diperoleh data yang menunjukan bahwa pada larutan standar akrilamid 1 ppm
diperoleh nilai AUC sebesar 2849073 dengan waktu retensi 8,147. Pada larutan standar
akrilamid 2 ppm diperoleh nilai AUC sebesar 4661931 dengan waktu retensi 8,143. Pada
larutan standar akrilamid 3 ppm diperoleh nilai AUC sebesar 8329991 dengan waktu
retensi 8,150. Pada larutan standar akrilamid 4 ppm diperoleh nilai AUC sebesar
10452353 dengan waktu retensi 8,180. Pada larutan standar akrilamid 5 ppm diperoleh
nilai AUC sebesar 13756294 dengan waktu retensi 8,150. Pada larutan standar akrilamid 6
ppm diperoleh nilai AUC sebesar 15427819 dengan waktu retensi 8,187. Dari semua
larutan standar akrilamid yang diukur diperoleh persamaan regresi dengan menggunakan
kelima larutan standar yaitu konsentrasi diperoleh nilai korelasi (R 2) yang cukup tinggi
yaitu sebesar 0,991. Berdasarkan perhitungan diperoleh persamaan regresi y=
2637119.4571x + 16325 dengan y = AUC dan x = kadar sampel (g/ml).