BAB 1.

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Protein merupakan suatu zat yang terdapat di semua bagian makhluk hidup
karena sebagai zat pembangun dan pengatur. Protein juga sunber asam amino
yang mengandung unsur C,H,O dan N yang tidak dimiliki oleh lemak dan
karbohidrat. Fungsi dari protein sebagai bahan structural seperti halnya polimer
lainnya. Protein memiliki rantai panjang dan dapat mengalami cross linking.
Sehingga protein juga berperan dalam biokatalis suatu reaksi-reaksi kimia dalam
makluk hidup.
Elektroforesis merupakan cara yang digunakan untuk memisahkan fraksifraksi dari campuran dengan menggunakan pergerakan partikel koloid yang
bermuatan dibawah pengaruh media listrik. Komponen molekul yang dapat
dipisahkan dengan cara elektroforesis yaitu DNA, RNA, maupun protein dari
pengotor lain. Salah satu cara analisa campuran protein secara kualitatif adalah
SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electroforesis). Prinsip
penggunaan metode ini adalah migrasi komponen akril amida dengan

N.N`

bisakrilamida. Kisi kisi tersebut berfungsi sebagai saringan molekul sehingga

konsentrasi atau rasio akrilamid dengan bisakrilamid dapat diatur untuk
mengoptimalkan kondisi migrasi komponen protein. Pada metode ini, digunakan
natrium dodecyl sulfat (SDS) dan merkaptoetanol. SDS merupakan deterjen
anionik yang bersama dengan dengan merkaptoetanol dan pemanasan
menyebabkan rusaknya struktur 3 dimensi protein menjadi konfigurasi acak. Hal
ini disebabkan oleh pecahnya ikatan disulfida yang selanjutnya tereduksi menjadi
gugus gugus sulfidril.
Penggunaan SDSPAGE bertujuan untuk memberikan muatan negatif pada
protein yang akan dianalisa. Protein yang terdenaturasi sempurna akan mengikat
SDS dalam jumlah yang setara dengan berat molekul protein tersebut. Denaturasi
protein dilakukan dengan merebus sampel dalam buffer yang mengandung
merkaptoetanol (berfungsi untuk mereduksi ikatan disulfide), gliserol dan SDS.
Muatan asli protein akan digantikan oleh muatan negatif dari anion yang teikat

sehingga kompleks proteinSDS memiliki rasio muatan per berat molekul yang
konstan. Sampelsampel enzim yang diinjeksikan ke dalam sumur gel diberi
warna dengan bromphenol biru yang dapat terionisasi.

Fungsi pewarna adalah

untuk membantu memonitor jalannya elektroforesis. Berat molekul protein dapat

diketahui dengan membandingkan Rf protein dengan protein standar yang berat
molekulnya telah diketahui.
1.2 Tujuan
Mengetahui pengukuran pola protein dengan metode SDS PAGE (Sodium
Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electroforesis)

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

Protein merupakan suatu zat yang terdapat di semua bagian makhluk hidup
karena sebagai zat pembangun dan pengatur. Protein juga sunber asam amino
yang mengandung unsur C,H,O dan N yang tidak dimiliki oleh lemak dan
karbohidrat. Fungsi dari protein sebagai bahan structural seperti halnya polimer
lainnya. Protein memiliki rantai panjang dan dapat mengalami cross linking.
Sehingga protein juga berperan dalam biokatalis suatu reaksi-reaksi kimia dalam
makluk hidup. Makromolekul itulah yang mengendalikan metabolism yang
kompleks dan menjaga kelangsungan hidup suatu orgenisme. Jika terjadi suatu
kelainan dalam biokatalis suatu makhluk hidup maka akan terlihat dengan jelas
dengan kelainan proteinnya. Sehingga diperlukan beberapa uji yang dibutuhkan
untuk mengetahuinya. Salah satunya adalah dengan uji SDS PAGE untuk
mengetahui jenis dan berat molekul suatu protein (Zilhadia et al., 2014)
Elektroforesis merupakan cara yang digunakan untuk memisahkan fraksifraksi dari campuran dengan menggunakan pergerakan partikel koloid yang
bermuatan dibawah pengaruh media listrik. Komponen molekul yang dapat
dipisahkan dengan cara elektroforesis yaitu DNA, RNA, maupun protein dari
pengotor lain. Elekroforesis menyediakan informasi mengenai ukuran, muatan,
dan jenis komponen yang dielektroforesiskan (Sudjadi, 2008). Teknik
elektroforesis merupakan metode yang baik untuk pemurnian protein dengan
bahan polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Gel poliakrilamid merupakan
larutan dari akrilamid dan bisakrilamid (Fatmawati dkk., 2007).
Salah satu cara analisa campuran protein secara kualitatif adalah SDSPAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electroforesis). Prinsip
penggunaan metode ini adalah migrasi komponen akril amida dengan

N.N`

bisakrilamida. Kisi kisi tersebut berfungsi sebagai saringan molekul sehingga

konsentrasi atau rasio akrilamid dengan bisakrilamid dapat diatur untuk
mengoptimalkan kondisi migrasi komponen protein. Metode ini sering digunakan
untuk menentukan berat molekul suatu protein

disamping untk memonitor

pemurnian protein. SDSPAGE dilakukan terhadap protein tak larut dengan

kekuatan ion rendah dan dapat menentukan apakah suatu protein termasuk
monomerik atau oligomerik, menetapkan berat molekul dan jumlah rantai
polipeptida sebagai subunit atau monomer (Wibowo dkk., 2012).
Selain itu SDS-PAGE merupakan salah satu teknik yang dapat digunakan
untuk mengidentifikasi pola pita protein tanaman. Teknik ini dinilai lebih
menguntungkan daripada elektroforesis kertas dan gel pati, karena media
penyangga yang digunakan dalam SDS-PAGE yaitu gel poli-akrilamid yang
bersifat transparan dan dapat dipindai pada daerah sinar tampak maupun UV, juga
dapat diperoleh resolusi yang lebih baik dan ukuran pori medium dapat diatur
berdasarkan perbandingan konsentrasi akrilamid yang digunakan. Pada medium
poliakrilamid pengaruh arus konveksi dapat dikurangi sehingga pemisahan
komponen menjadi sempurna dan pita-pita yang terbentuk menjadi lebih jelas.
Poliakrilamid merupakan medium yang bersifat inert sehingga tidak bereaksi
dengan sampel dan tidak terjadi ikatan antara sampel dan matrik (Kristina et al.,
2009).
SDS PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel
Electrophoresis) adalah teknik elektroforesis yang sering digunakan dalam
analisis protein di laboratorium. Sampel protein didenaturasi (dipanaskan) dan
dicampur dengan SDS (yang merupakan deterjen yang anionik) dengan akibat
kompleks protein deterjen bermuatan negatif dan protein yang lebih besar
mempunyai muatan negatif yang lebih besar. Kompleks protein deterjen itu akan
dibawa oleh medan listrik ke arah kutub positif (anoda). Gel akrilamide berfungsi
sebagai dasar atau alas dari atas gerakan sampel protein. Konsentrasi akrilamide
menentukan ukuran pori pori gel dan ukuran pori pori gel menentukan jarak
yang ditempuh oleh kompleks protein SDS. Jadi beberapa faktor yang dapat
ditentukan untuk memaksimalkan pemisahan protein protein melalui teknik
SDS PAGE, antara lain: kadar SDS, konsentrasi gel akrilamide dan ukuran gel
nya, kemurnian sampel protein dan jumlah sampel yang diletakkan pada gel,
voltage yang digunakan pada alat elektroforesis dan selama medan listrik
dihidupkan (Saini dan Renu., 2012). Coomasive biru berikatan dengan protein
berdasarkan interaksi ionik antara gugus sulfit pada Coomasive biru dengan asam

amino basa, dan interaksi hidrofobik cincin Coomasibe biru. Pewarna mampu
menghasilkan pita pada jumlah protein 10-100 ng. Protein kecil akan bergerak
cepat melewati gel, sedangkan protein besar bergerak lebih lambat. Mobilitas
kebanyanakan polipeptida di bawah kondisi seperti ini berbanding lurus terhadap
loh ukurannya. Beberapa protein yang banyak mengandung karbohidrok dan
protein membran tidak mengikuti aturan ini. Tetapi metode SDS-PAGE
merupakan metode yang sangat cepat, peka dan dapat menghasil pemisahan yang
baik (Sudjadi, 2008).

BAB 3. METODE PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum Bioteknologi dengan acara Pengukuran Pola Protein Metode
SDS-Page (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) yang
dilakukan pada hari Selasa, 20 Oktober 2015 bertempat di Laboratorium
Bioteknologi, Fakultas Pertanian, Universitas Jember pukul 16.30 WIB - selesai.
3.2 Bahan dan Alat
3.2.1 Bahan
1. Acrylamide (30%)
2. 1,5 M Tris-Cl pH 8,8
3. 0,5 M Tris-Cl pH 6,8
4. SDS Reducing Buffer
5. TEMED
6. Running buffer
7. Staining Dye
8. Destaining
3.2.2 Alat
1. Perangkat SDS-Page
2. Mikropipete
3.3 Cara Kerja
3.3.1 Persiapan bahan (Stok)
1. Membuat stok Acrylamide 30% : untuk volume 50 ml, menimbang 14,6 gram
Acrylamide dan 0,4 gram bisacrylamide, menambahkan 35 ml Aquadest
distirer hingga homogen dan menambahkan Aquadest hingga volume 50 ml,
menyimpan pada suhu 40C.

2. Membuat stok 1,5 M Tris-Cl, pH 8,8 : menimbang 18,2 gram Tris-base + 80 ml

Aquadest mengatur pH hingga 8,8 menambahkan HCl untuk mengatur pH dan
menambahkan Aquadest hingga volume 100 ml, menyimpan pada suhu 40C.
3. Membuat stok 0,5 M Tris-Cl, pH 6,8 : menimbang 6,1 gram Tris-base + 80 ml
Aquadest mengatur pH hingga 6,8 menambahkan HCl dan menambahkan
Aquadest hingga volume 100 ml, menyimpan pada suhu 40C.
4. SDS reducing buffer : 50 ul B-mercaptoetanol + 950 ul stok sampel buffer
dengan perbandingan (1:19).
5. Running buffer : menimbang 3 gram Tris base, 14 gram Glycine, 1 gram SDS
dengan Aquadest 1 liter, menstirer hingga homogen.
6. Destaining : 80 ml Methanol, 20 ml Acetic Acid dan menambahkan Aquadest
hingga volume 299 ml.
3.3.1 Persiapan Running Elektroforesis
1. Mempersiapkan alat : alat diset terlebih dahulu dan memastikan agar tidak
bocor, mempersiapkan stacking gel dengan komposisi lower dan upper gel
sesuai dengan tabel. Menuangkan lower gel pada cetakan gel, menunggu
hingga terbentuk gel, setelah itu memasukkan upper gel pada bagian atas dan
comb, jika sudah terbentuk gel comb mencabut dan memasukkan samoel.
2. Memasukkan larutan sampel sebanyak 12,5 ul, menambahkan buffer sampel
1:1, kemudian memanaskan pada suhu 850C selama 5 menit, memasukkan
sampel pada sumuran dengan menggunakan micropipete. Memasang elektroda
sesuai dengan kutubnya dan menjalankan elektroforesis pada tegangan 200 V,
15 mA/gel selama 60 menit. Setelah elektroforesis, mewarnai gel dengan
staining dye dan menshaker selama semalam, kemudian melakukan destaining
selama 30 menit dan membilas menggunakan Aquadest. Mengamati pola
protein yang terbentuk.

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

1 2

4 5 6

8 9 10

Gambar 4.1.1 Pola Protein Tanaman Sampel Berdasarkan Hasil Pengukuran SDSPage.
Keterangan :
1. Pola protein pada daun tanaman jagung.
2. Pola protein pada daun tanaman padi.
3. Pola protein pada daun tanaman pepaya.
4. Pola protein pada daun tanaman pisang.
5. Pola protein pada daun tanaman kunyit.
6. Pola protein pada daun tanaman melinjo.
7. Pola protein pada daun tanaman kopi.
8. Pola protein pada daun tanaman kakao.
9. Pola protein pada daun tanaman sirsak.
10. Pola protein pada daun tanaman nam - nam.

4.2 Pembahasan
Prinsip kerja yang digunakan dalam metode SDS-PAGE yaitu memisahkan
molekul-molekul protein berdasarkan ukuran dan bentuk partikelnya dengan
menghambat interaksi hidrofobik dan merusak ikatan hidrogen. Pemisahan
protein bertujuan untuk keperluan biokimia, genetika, forensik, dan biologi
molekuler. System kerjanya dimulai dengan mempersiapkan alat dan bahan yang
dibutuhkan dalam proses SDS-PAGE. Langkah berikutnya yaitu membuat
stacking gel dan resolving gel. Pembuatan stacking gel dan resolving gel dimulai
dengan memasukkan larutan resolving gel ke dalam celah antara short plate &
spacer plate hingga 2/3 bagian dari celah. Lalu menambahkan isopropanol/
akuades,

menunggu

selama

20

menit.

Terakhir

yaitu

membuang

isopropanol/akuades, serta memasukkan larutan stacking gel ke dalam celah short

plate & memasang spacer plate, comb, setelah itu menunggu selama 20 menit.
Setelah stacking gel dan resolving gel selesai dibuat, langkah berikutnya adalah
persiapan running SDS-PAGE. Kemudian loading sampel dan marker dimasukan
ke dalam well yang ada pada gel. Selanjutnya proses running SDS-PAGE,
elektroforensis dilakukan. Kemudian tahap removing gel, berikutnya proses
pewarnaan (staining). Hasil elektroforesis berupa pita protein total pada gel
didokumentasi dengan foto digital. Pola pita protein yang muncul pada gell
disusun menjadi data biner, yang didasarkan atas ada (1) dan tidak ada (0) pita
protein pada ukuran sama. Selanjutnya, data dianalisis dengan teknik ANOVA
satu arah yang hasilnya digunakan untuk menyusun dendrogram untuk
mengidentifikasi kemiripan pola pita protein pada objek yang di teliti

Gambar 1. Prinsip kerja SDS-PAGE

Hasil yang didapat yaitu data berupa gambar hasil elektroforesis berupa
pita protein total pada gel, sampel yang kami gunakan berjumlah 10 yang terdiri
dari daun tanaman monokotil dan dikotil dari gambar tersebut tampak bahwa
tanaman monokotil memliki pola pita-pita(bands) yang lebih jelas dan tidak
semearing (berbayang) jika di bandingkan dengan pola yang di tampakkan pada
tanaman dikotil. Hal ini di tunjukkan dari beberapa tanaman monokotil yang di
analisa sebagian besar memiliki pola pita-pita yang lebih jelas daripada pola pita
yang di tampakkan pada tanaman dikotil, perbedaan pola pita-pita tersebut di
sebabkan karena konsentrasi protein dari tanaman monokotil yang di identifikasi
lebih tinggi daripada konsentrasi protein dari tanaman dikotil oleh sebab itu pitapita pada tanaman monokotil terlihat lebih jelas dan tidak berbayang. Pada
tanaman pepaya, kakao, sirsak dan nam-nam hanya terlihat bayang-bayang saja.
karena protein yang di akumulasikan dalam kegiatan ini terlalu sedikit akibat
kesalahan yang kami lakukan sehingga hasil elektroforesis tidak menunjukkan
pola sama sekali (blank) oleh sebab itu dalam melakukan proses elektroforesis
kita harus berhati-hati agar dapat menampakkan hasil yang nyata.
Protein protein dapat dipisahkan berdasarkan berat molekul. SDS
PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electrophoresis) adalah
teknik elektroforesis yang sering digunakan dalam analisis protein di
laboratorium. Sampel protein didenaturasi (dipanaskan) dan dicampur dengan
SDS (yang merupakan deterjen yang anionik) dengan akibat kompleks protein

deterjen bermuatan negatif dan protein yang lebih besar mempunyai muatan
negatif yang lebih besar. Kompleks protein deterjen itu akan dibawa oleh medan
listrik ke arah kutub positif (anoda). Gel akrilamide berfungsi sebagai dasar atau
alas dari atas gerakan sampel protein. Konsentrasi akrilamide menentukan ukuran
pori pori gel dan ukuran pori pori gel menentukan jarak yang ditempuh oleh
kompleks protein SDS. Jadi beberapa faktor yang dapat ditentukan untuk
memaksimalkan pemisahan protein protein melalui teknik SDS PAGE, antara
lain: kadar SDS,
konsentrasi gel akrilamide dan ukuran gel nya, kemurnian sampel protein dan
jumlah sampel yang diletakkan pada gel, voltage yang digunakan pada alat
elektroforesis dan lama medan listrik dihidupkan

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan
1. Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu
medan listrik.
2. Prinsip kerja dari metode SDS-PAGE yaitu memisahkan molekul-molekul
protein berdasarkan ukuran dan bentuk partikelnya dengan menghambat
interaksi hidrofobik dan merusak ikatan hidrogen.
3. Pola setiap protein berbeda-beda, cara membedakannyadari pola pita protein
pada gel berbeda-beda, dapat dilihat dari ketebalan pola pita protein.
4. Hasil terbaik yaitu pada tanaman Padi sedangkan untuk jenis monokotil dan
dikotil hasil terbaik pada tanaman monokoti jika dibandingkan dengan tanaman
dikotil.
5. Faktor-faktor yang mempengaruhi hasil dari metode SDS-PAGE yaitu ukuran
dan bentuk molekul protein, konsentrasi larutan dan konsentrasi gel, pH, suhu
dan voltage.
6. Factor yang mempengaruhi perbedaan pola pita protein (ketebalan) yaitu
kandungan protein tanaman, jenis, serta bagian dan umur tanaman, konsentrasi
larutan (penambahan volume buffer).
5.2 Saran
Praktikum sudah berjalan dengan baik, hanya saja menurut saya ini bukan
praktikum karena praktikan hanya melihat tanpa mempraktekkan secara langsung
langkah-langkah yang sudah ditentukan. Jadi praktikan kurang begitu memahami
dengan baik. Untuk praktikum selanjutnya dimohon untuk melibatkan praktikan
dalam praktikum bukan hanya untuk tontonan saja dengan apa yang dilakukan
oleh asisten.

DAFTAR PUSTAKA
Fatmawati, Umi., Suranto., dan Sajidan. 2007. Ekspresi Protein pada
Mikroorganisme Resisten Logam Berat Cr dengan Metode Elektroforesis.
Biosains. 2(1): 29-38.
Kristina, Kusumah, dan Lailani. 2009. Analisis Fitokimia Dan Penampilan
Polapita Protein Tanaman Pegagan (Centella asiatica) Hasil Konservasi In
Vitro. Bul.Littro. 20 (1) : 11-20.
Saini, Depika, dan Ranu, S. 2012. SDS-PAGE Analysis of Leaf Galls of Alstonia
scholaris (L.) R. Br. Plant Pathol Microb. 3(2): 36-39.
Sudjadi, 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta. Kasinus.
Wibowo, Agus Danang., Maggy, T.S., dan Patuan L.P.S. 2012. Fraksionasi dan
Penentuan Profil Protein Bungkil Kelapa Dengan SDS-PAGE. Teknol.
23(1): 69-74.
Zilhadia, Ofa, S.B., dan Charisatul, U. 2014. Protein Profilesof Beef (Bos
indicus), Pork (Sus domesticus),and SausagesBy Using SDS-PAGE
(Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) Method.
Food Pharm Science. 2(6): 46-51.