Pembahasan

Praktikum ini bertujuan untuk menyiapkan pasien untuk pemeriksaan kolesterol

dalam darah dan menginterpretasikan hasil laboratorium yang diperoleh. Kolesterol
merupakan steroid alkohol tidak jenuh yang termasuk golongan lipid, yaitu senyawa organik
yang tidak larut dalam air tetapi larut dalam pelarut organik. Pengukuran kadar kolesterol
dilakukan menggunakan metode CHOD-PAP.
Prosedur pertama yang dilakukan adalah menyiapkan tabung reaksi yang akan
digunakan pada saat spektrofotometri UV-Vis. Larutan sampel terdiri dari 10 L serum dan
1000 L reagen. Serum merupakan darah yang telah dipisahkan dari sel-sel darah merah
dan zat-zat koagulan serta biasanya berwarna kuning pucat. Larutan reagen merupakan
campuran dari beberapa enzim yang dapat mengubah kolesterol menjadi suatu senyawa
berwarna sehingga dapat dideteksi oleh spektrofotometri UV-Vis.
Pada proses pengambilan larutan, yaitu aquadest, reagen, dan sampel dilakukan
dengan menggunakan mikropipet (pipet piston). Hal ini disebabkan jumlah larutan yang
diambil sangat sedikit (10 L). Sebelum pipet piston digunakan, bagian atas pipet yang
disebut thumb knob sebaiknya ditekan berkali-kali untuk memastikan lancarnya mikropipet.
Setelah itu tip bersih dimasukkan ke dalam nozzle / ujung pipet piston sampai pas (tidak
jatuh). Thumb knob ditekan sampai hambatan pertama / first stop, jangan ditekan lebih ke
dalam lagi karena cairan yang terambil akan lebih besar daripada jumlah yang sebenarnya.
Setelah itu, tip dimasukkan ke dalam cairan sedalam 3-4 mm karena jika kurang dari nilai
tersebut dikhawatirkan cairan tidak terambil sempurna (ada gelembung udara yang
terambil), sedangkan jika lebih dari nilai tersebut dikhawatirkan terdapat kontaminan dari
tip pipet. Selanjutnya pipet ditahan dalam posisi vertikal kemudian tekanan dari thumb
knob dilepaskan sehingga cairan masuk ke tip. Ujung tip dipindahkan ke dalam kuvet.
Untuk mengeluarkan cairannya, thumb knob ditekan sampai hambatan kedua / second stop
atau ditekan semaksimal mungkin sehingga semua cairan keluar dari ujung tip. Pipet piston
digunakan dalam percobaan ini karena memiliki ketelitian, sensitivitas, dan spesifisitas yang
tinggi bila dibandingkan dengan pipet gelas.
Setelah

dimasukkan

aquadest

dan

larutan

reagent,

larutan

dicampurkan

o
menggunakan vortex. Setelah itu campuran larutan tersebut diinkubasikan pada suhu 37 C
selama 10 menit. Proses inkubasi ini bertujuan memberikan waktu untuk terjadinya reaksi
antara kedua larutan dalam campuran tersebut. Saat proses inkubasi, terjadi reaksi antara

reagen dengan kolesterol yang terdapat pada larutan standar dan sampel. Setelah diinkubasi,
kedua larutan yang tadinya berwarna bening dalam masing-masing tabung reaksi berubah
menjadi warna merah muda. Warna merah muda tersebut menandakan telah terjadinya
reaksi antara enzim dengan kolesterol yang berasal dari senyawa quinoneimine, yang
merupakan hasil reaksi antara reagen dan kolesterol.
Reaksi yang terjadi yaitu sebagai berikut :
Cholesterol ester + H 2 O
Cholesterol+O2

CHO

CHE

>Cholesterol + Fatty acid

>Cholesterol3one + H 2 O2

2 H 2 O2+ 4 Aminoantipyrine+ Phenol

POD

>Quinonimine+ 4 H 2 O

Perubahan warna diperlukan agar campuran larutan dapat diukur absorbansinya

dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis, khususnya dengan sinar visibel.
Quinoeimine akan terukur absorbansinya pada panjang gelombang 546 nm dan nilai
absorbansi tersebut sebanding dengan kadar kolesterol dalam darah. Setelah inkubasi
selesai, larutan sampel diukur absorbansinya dengan spektrofotometer. Pengukuran
dilakukan pada panjang gelombang 546 nm yang merupakan panjang gelombang
maksimum untuk quinoeimine.
Absorbansi yang diperoleh pada saat pengukuran larutan sampel adalah 0,310.
Larutan blanko memberikan absorbansi yaitu 0,096 dan larutan standar memberikan
absorbansi 0,334. Nilai dari kedua absorbansi tersebut dapat digunakan untuk menghitung
kadar kolesterol dalam sampel dengan menggunakan rumus :

Cholesterol

[ ]

|Sample||Blanko|
mg
=
x Nilai Standard
dL |Standard||Blanko|

Nilai standard = 200 mg/dl.

Penghitungan hasil kadar kolesterol menurut percobaan :

Cholesterol

[ ]

mg 0,3100,096
=
x 200
dL
0,3340,096
179,83 mg/dL

Nilai Referensi
No
1
2
3

Klasifikasi
Kadar yang diinginkan
Borderline
Resiko tinggi

Konsentrasi
200 mg/dL
240 mg/dL
> 240 mg/dL

Menurut tabel nilai referensi diatas, hasil pengukuran kadar kolesterol dari
perhitungan sebelumnya yaitu 179,83 mg/dL 200 mg/dL sehingga masih dalam
batas normal atau kadar yang diinginkan.