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PROCESSO FERMENTATIVO GENRICO

Preparo
do
Inculo

Fase de
Laboratrio
Fase
Industrial

Ar/Esterilizao

Preparo do meio
de cultura/
Esterilizao

Fermentao

Controle

Processos de
Separao,
Purificao e
Tratamento

Resduos

Produtos

Sub-produtos

CINTICA DE CRESCIMENTO CELULAR


Calor

Substratos
(Si)

Clula

Produtos
(Pi)

Clulas
Substratos

Clulas

Produtos extracelulares + Mais clulas

CINTICA DO CULTIVO CELULAR


clulas
viveis
meio de cultura,condies
favorveis de T e pH

Crescimento Celular (X)


Liberao de Produtos e Metablitos (P)
Consumo de Substrato (S)

Anlise da evoluo da concentrao de um ou mais


componentes do sistema de cultivo em funo do tempo de
fermentao
X= X(t); P=P(t); S=S(t)

CINTICA DO CULTIVO CELULAR


clulas
viveis
meio de cultura,condies
favorveis de T e pH

Crescimento Celular
Liberao de Produtos e Metablitos
Consumo de Substrato

Modo de Operao
Tipos de
processos
fermentativos

descontnuos
contnuos

CINTICA DO CULTIVO CELULAR


Relao entre efeitos do ambiente de cultivo e
velocidades de formao de clulas e produtos
Determinao de condies favorveis para se
conduzir e controlar o processo

CARACTERSTICAS DO CULTIVO CELULAR


A reproduo das clulas conduz ao aumento da
concentrao de enzimas com o tempo
A obteno do produto resulta de um conjunto de
transformaes complexas (manuteno da atividade vital)

Requisitos para anlise :

Estabelecer o substrato limitante (fonte de C, N, O2 em geral)


Estabelecer os compostos a serem monitorados
Estabelecer tcnicas confiveis de medida das concentraes
de clulas, nutrientes e produtos

PREPARO DO INCULO
Inculo: suspenso celular com concentrao
adequada para garantir a fermentao de um
dado volume de mosto, em condies
econmicas
Volume do inculo:
til do fermentador

0,5 a 50% da capacidade

Representao Esquemtica: Preparo do Inculo

Incubao
Cultura
pura

Volume de
meio = V1

Incubao
Volume de
meio = V2> V1

Volume de
meio = V3> V2

Fase de Laboratrio
Fase Industrial

Dornas

Incubao

Volume de
meio = V4> V3

Volume de
meio = V5> V4

A taxa de crescimento
varia de acordo com a
fase do crescimento

Curvas de X, S e P em funo de t

DETERMINAO DE VELOCIDADES ESPECFICAS


Crescimento celular:
X = (1/X)(dX/dt)

Consumo de substrato:
S = (1/X)(dS/dt)

Formao de produto:
P = (1/X)(dP/dt)
Razo do uso das velocidades especficas:
A concentrao de clulas pode sofrer variao considervel em um pequeno
intervalo de tempo. Aumento da concentrao do complexo enzimtico
responsvel pela transformao do substrato S no produto P

Log (concentrao clulas viveis / mL)

Curva Tpica de Crescimento Celular em Batelada


A B

E
=0

= MAX

=0

F
< MAX

< MAX

< MAX

Tempo de Cultivo
- taxa especfica de crescimento celular:
A: fase de latncia ou lag
B: fase de acelerao
C: fase log ou exponencial
D: fase de desacelerao
= (1/X) dX/dt
E: fase estacionria
F: fase de declnio ou morte celular

CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA: FASE LAG


Adaptao ao novo ambiente: reorganizao dos constituintes moleculares
das clulas
Fatores que aumentam a durao da fase lag:
inculo com concentrao celular reduzida;
baixa concentrao de nutrientes e de fatores de crescimento no meio de cultura;
inculo com idade avanada.
Crescimento diuxico:
alteraes metablicas.
A fonte de carbono de mais
fcil utilizao (C1) reprime a
sntese de enzimas requeridas
para o metabolismo da fonte
(C2).

log (no de
clulas)
utilizao
da fonte C2
utilizao
da fonte C1

tempo

CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA: FASE LOG


A massa celular e o nmero de clulas aumentam
exponencialmente com o tempo

Perodo de crescimento balanceado:


A composio mdia das clulas permanece aproximadamente constante;
Formao de metablitos primrios;

Crescimento celular independe da concentrao de substratos.

Crescimento exponencial :

dX/dt = X

X: concentrao celular
t: tempo de cultivo
= max

Tempo de duplicao da biomassa (td):

td = (ln 2)/max

Reaes Anablicas Sntese


Anabolismo: Conjunto de fenmenos bioqumicos
que se processam no organismo vivo,
destinados a regenerar, a partir de substncias
simples, a matria viva que se gasta durante
a fase catablica do metabolismo, atravs das
queimas respiratrias intracelulares. por
intermdio destas ltimas que o organismo obtm
a energia necessria ao seu funcionamento.

Reaes Catablicas Degradao


Catabolismo: Processo metablico destrutivo,

por meio do qual clulas do organismo transformam


substncias complexas em outras mais simples.

Metablito: Qualquer substncia, produzida por


metabolismo.

Metablito primrio: Substncia produzida por


metabolismo primrio.

Metablito secundrio: Substncia produzida por


metabolismo secundrio

Metablitos Primrios

Metablitos Secundrios:

Produtos gerados
na fase de crescimento
exponencial

No associados ao crescimento;
Muitos metablitos apresentam
maior produo na fase
estacionria

ln X

tempo

CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA:


FASE DE DESACELERAO
CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA:
FASE DE DESACELERAO
Perodo de crescimento desbalanceado.

O stress induzido pela exausto de um nutriente ou pelo


acmulo de resduos.

Reestruturao microbiana para


sobrevivncia em ambiente hostil.

aumentar

CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA:


FASE ESTACIONRIA
No h crescimento celular lquido

Ocorre catabolismo de reservas celulares:


Produo de energia e novos blocos construtores

Fenmenos que podem ocorrer durante a fase estacionria:


A massa celular mantm-se constante, com reduo no nmero de
clulas viveis.
Lise celular, com reduo no nmero de clulas viveis. Produtos
da lise celular: nutrientes para as clulas viveis remanescentes.
Clulas metabolicamente ativas produzem metablitos
secundrios.

CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA:


FASE DE DECLNIO OU MORTE CELULAR
A morte celular resulta da diminuio da concentrao de
nutrientes e do acmulo de produtos txicos:

dN/dt = -k N
Forma integrada:

N = Ns e-kt
onde: N: concentrao de clulas viveis
Ns: concentrao de clulas viveis no final da
fase estacionria

k: constante da taxa de morte

PARMETROS DO CRESCIMENTO CELULAR


Fatores de Rendimento Aparente ou Global
Variam de acordo com a fase do cultivo celular;
Definidos com base no consumo de um material:

YX/S = - X/S

YP/X = P/X

YP/S = - P/S

Rendimento Aparente ou Observado (Y)


As condies de cultivo
podem alterar o padro de
utilizao de um substrato

Os coeficientes de
rendimento aparentes no
so constantes verdadeiras

Para uma dada fonte de carbono:

Substrato

Biomassa
Produto extracelular

Clula
Energia para crescimento
Energia manuteno

ST =

Sbiomassa + Sproduto extracelular + Screscimento + Smanuteno

Rendimento Terico (Y)


Baseado na estequiometria da reao
Substrato Produto

X
=

TERICO

X
=
( + )

OBSERVADO

X : Variao de Biomassa

ST: Variao de total substrato

SG: Variao de substrato

SR: Variao de substrato

direcionado para a produo do

direcionado para outras atividades

material de interesse

(manuteno)

Rendimento mximo Representa o rendimento sem competio de


outras reaes

EXERCCIO:
Rendimento Terico (Y) X Aparente (Y)
A reao para a produo aerbica do cido actico a partir
do etanol :
C2H5OH + O2 CH3CO2H + H2O
(etanol)
(cido actico)
A bactria Acetobacter aceti adicionada em um meio
vigorosamente aerado contendo etanol a uma concetrao
inicial de 10 g/l. Aps algum tempo, a concentrao de etanol 2
g/l e a Concentrao de cido actico produzido 7,5 g/l.
Compare o rendimento aparente com o terico.
Explique a razo das diferenas ou semelhanas dos valores
encontrados.

PADRES CINTICOS DE CRESCIMENTO E


DE FORMAO DE PRODUTOS EM BATELADA
Produtos associados ao
crescimento
Produtos no associados ao
crescimento
Produtos parcialmente associados
ao crescimento

PADRES CINTICOS DE CRESCIMENTO E


DE FORMAO DE PRODUTOS EM BATELADA
Produtos associados ao crescimento:
As taxas especficas de formao do produto e de
crescimento celular so proporcionais

qP = (1/X)(dP/dt) = Yp/x

Ex: metablito primrio:


etanol

X
ou
P

tempo

PADRES CINTICOS DE CRESCIMENTO E


DE FORMAO DE PRODUTOS EM BATELADA
Produtos parcialmente associados ao
crescimento
A formao do produto ocorre
durante as fases de crescimento
lento e estacionria.
X
Equao de Luedeking-Piret

ou
P

qP = X +
Exemplo:
cido ltico
tempo

Se = 0 O produto no associado ao crescimento


Se = 0 O produto ser somente associado ao crescimento e = YP/X

PADRES CINTICOS DE CRESCIMENTO E


DE FORMAO DE PRODUTOS EM BATELADA
Produtos no associados ao crescimento:
A formao do produto ocorre durante a fase estacionria,
quando a taxa de crescimento celular nula.

qP = = constante
X
ou
P

Ex: metablitos secundrios:


antibiticos, vitaminas

tempo

DETERMINAO DA CONCENTRAO CELULAR


Mtodos Diretos:
Determinao da
populao total e/ou do
nmero de clulas viveis

Mtodo de plaqueamento;
Medida da massa seca

DETERMINAO DA
CONCENTRAO DE CLULAS
MTODOS
Diretos: determinao da populao total e/ou do
nmero de clulas viveis (sujeitos a interferentes)
Indiretos : baseados na medida de consumo de
substrato e/ou na formao de produtos

MTODOS DIRETOS
1. Mtodo do Hemocitmetro de Fluxo
O mecanismo envolve a passagem de clulas
individuais transversalmente ao feixe de luz laser.
Aplicvel a meios de
cultura sem outras
partculas suspensas
Pode-se usar corantes
para se distinguir entre
clulas vivas e mortas
(clulas totais e clulas
viveis)

MTODOS DIRETOS
2. Mtodo de Plaqueamento
Placas de Petri com meio de cultura gelificado so usadas para
a contagem de clulas viveis (capazes de se reproduzir)

~ 25 geraes colnia visvel a olho nu

Clulas metabolicamente ativas podem no formar colnias


se o meio e as condies de cultura no forem adequados
Mtodo adequado para bactrias e leveduras

MTODOS DIRETOS
3. Medida da Massa Seca
Aplicvel a meios de cultura sem outras partculas
suspensas.
Centrifugao
Determinao
rpida:
volume empacotado

Filtrao

Secagem
80oC, 24 h

Massa
seca
celular

MTODOS INDIRETOS
Mtodos Indiretos:
Baseados na medida de consumo de
substrato e/ou na formao de
produtos
Monitoramento de componentes intracelulares:
DNA, protenas, RNA, ATP, NADH E outros
Quantificao de substratos:
Oxignio, fontes de carbono, fontes de nitrognio
Quantificao de produtos:
Etanol e cido ltico (processos anaerbios);
CO2 (processos aerbicos);
H+ (queda no pH resultante do uso de amnio)
Monitoramento da viscosidade:
Aumento: Crescimento de miclios
Formao de polissacardeo extracelular
Reduo: substrato = polmero biodegradvel

Bibliografia recomendada
- DORAN, P. M. - Bioprocess Engineering Principles, 2a edio,
Editora Academic Press Ltd., London, 1997. cap. 11
- SHULER, M. L.; KARGI, F. - Bioprocess Engineering Basic
Concepts, Editora Prentice- Hall International Inc., Englewood Cliffs,
1992. 2a. Edio cap. 6