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Cintica dos Processos Fermentativos

Cultivo de Microrganismos
Na natureza os microrganismos existem como cultura mistas

Colnia: crescimento visvel

Meios de Cultura

Preparaes contendo os nutrientes apropriados para o


cultivo de microrganismos

Pode ser preparado no laboratrio ou ser adquirido comercialmente


A composio do meio de cultivo depende das necessidades nutricionais
de cada tipo de microrganismo

Meio de cultura material nutriente


Inculo amostra de microrganismo
Incubao
Multiplicao celular

Clulas individuais formam grande nmero de


clulas = colnia

Cultura pura: colnia formada a partir de um ancestral de um nico tipo


de microrganismo

Preparao do meio de cultura


Nutrientes necessrios
Ajuste de pH
gua
O meio de cultura deve ser estril para proliferao
somente do microrganismo inoculado

Exigncias nutricionais: grande variedade


gua
Elementos qumicos fundamentais: C, N, H, O, P, S, K, Na, Mg, Fe

NUTRIENTES
Classificao quanto a concentrao mnima

Requerida para o crescimento timo


Macronutrientes
C, N, O, H, S, P,
Mg2+ e K+

Micronutrientes
Mo2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+,
Fe2+, Ca2+, Na2+, vitaminas
e hormnios de
crescimento

Custos relevantes
C, N e O

NUTRIENTES

Os oito elementos macronutrientes e funes fisiolgicas


Elemento
Funes fisiolgicas e frao da massa seca de Concentrao
Escherichia coli
requerida (M)

Carbono

Constituinte de material orgnico celular.


Freqentemente fonte de energia 50%

Nitrognio

Constituinte de protenas, cidos nuclicos e


coenzimas 14%

Hidrognio

Material orgnico celular e gua 8%

Oxignio

Material orgnico celular e gua. Requerida para


respirao aerbia 20%

Enxofre

Principal on inorgnico na clula e cofator 1%

Fsforo

Constituinte de cidos nuclicos, fosfolipdeos,


nucleotdeos e certas enzimas 3%

10-4 10-3

Potssio

Principal ction inorgnico na clula e cofator para


algumas enzimas 1%

10-4 10-3

Magnsio

Cofator para diversas enzimas presente em


paredes celulares e membranas 0,5%

10-4 10-3

10-2
10-3

10-4

Preparo do Meio
Slido em placa
Tubo (1)
horizontal e (2)
inclinado

http://www.youtube.com/watch?v=
0heifCiMbfY

MEIOS DE CULTURA
Composio dos Meios de Cultura

Meios sintticos
Composio qumica exata
qualitativa
e quantitativamente
conhecida

Meios complexos
Meios contendo um ou mais
produtos cuja composio
qumica no
perfeitamente definida

NUTRIENTES
Fontes de Carbono e Nitrognio para meios industriais
Carbono

Forma

Nitrognio

Glicose

Glicose pura
Cevada
Monoidratada
Carboidratos hidrolisados

1,5-2,0

Lactose

Lactose pura e soro de


leite em p

Melao de
beterraba

1,5-2,0

Polissacardeos

Cevada, farinha de
amendoim, farinha de
aveia, farinha de soja

Farinha de
amendoim,
de soja

8,0

Sacarose

Melao de beterraba,
melao de cana, acar
bruto, acar refinado

Farinha de
aveia, de
centeio

1,5-2,0

gua de
macerao
de milho

%N

PROCESSO FERMENTATIVO GENRICO


Preparo
do
Inculo

Fase de
Laboratrio
Fase
Industrial

Ar/Esterilizao

Preparo do meio
de cultura/
Esterilizao

Fermentao

Controle

Processos de
Separao,
Purificao e
Tratamento

Resduos

Produtos

Sub-produtos

CINTICA DE CRESCIMENTO CELULAR


Calor

Substratos
(Si)

Clula

Produtos
(Pi)

Clulas
Substratos

Clulas

Produtos extracelulares + Mais clulas

CINTICA DO CULTIVO CELULAR


clulas
viveis
meio de cultura,condies
favorveis de T e pH

Crescimento Celular (X)


Liberao de Produtos e Metablitos (P)
Consumo de Substrato (S)

Anlise da evoluo da concentrao de um ou mais


componentes do sistema de cultivo em funo do tempo de
fermentao
X= X(t); P=P(t); S=S(t)

CINTICA DO CULTIVO CELULAR


clulas
viveis
meio de cultura,condies
favorveis de T e pH

Crescimento Celular
Liberao de Produtos e Metablitos
Consumo de Substrato

Modo de Operao
Tipos de
processos
fermentativos

descontnuos
contnuos

CINTICA DO CULTIVO CELULAR


Relao entre efeitos do ambiente de cultivo e
velocidades de formao de clulas e produtos
Determinao de condies favorveis para se
conduzir e controlar o processo

CARACTERSTICAS DO CULTIVO CELULAR


A reproduo das clulas conduz ao aumento da
concentrao de enzimas com o tempo
A obteno do produto resulta de um conjunto de
transformaes complexas (manuteno da atividade vital)

Requisitos para anlise :

Estabelecer o substrato limitante (fonte de C, N, O2 em geral)


Estabelecer os compostos a serem monitorados
Estabelecer tcnicas confiveis de medida das concentraes
de clulas, nutrientes e produtos

PROCESSO FERMENTATIVO GENRICO


Preparo
do
Inculo

Fase de
Laboratrio
Fase
Industrial

Ar/Esterilizao

Preparo do meio
de cultura/
Esterilizao

Fermentao

Controle

Processos de
Separao,
Purificao e
Tratamento

Resduos

Produtos

Sub-produtos

CINTICA DE CRESCIMENTO CELULAR


Calor

Substratos
(Si)

Clula

Produtos
(Pi)

Clulas
Substratos

Clulas

Produtos extracelulares + Mais clulas

PREPARO DO INCULO
Inculo: suspenso celular com concentrao
adequada para garantir a fermentao de um
dado volume de mosto, em condies
econmicas
Volume do inculo:
til do fermentador

0,5 a 50% da capacidade

Representao Esquemtica: Preparo do Inculo

Incubao
Cultura
pura

Volume de
meio = V1

Incubao
Volume de
meio = V2> V1

Volume de
meio = V3> V2

Fase de Laboratrio
Fase Industrial

Dornas

Incubao

Volume de
meio = V4> V3

Volume de
meio = V5> V4

A taxa de crescimento
varia de acordo com a
fase do crescimento

Curvas de X, S e P em funo de t

S
Concentrao

dS
dt

dX
dt

X
dP
dt

Tempo

DETERMINAO DE VELOCIDADES ESPECFICAS


P

S
Concentrao

dS
dt

Consumo de substrato:
S = (1/X)(dS/dt)

dX
dt

X
dP
dt
t

Crescimento celular:
X = (1/X)(dX/dt)

Formao de produto:
P = (1/X)(dP/dt)

Tempo

Razo do uso das velocidades especficas:


A concentrao de clulas pode sofrer variao considervel em um pequeno
intervalo de tempo. Aumento da concentrao do complexo enzimtico
responsvel pela transformao do substrato S no produto P

Log (concentrao clulas viveis / mL)

Curva Tpica de Crescimento Celular em Batelada


A B

E
=0

= MAX

=0

F
< MAX

< MAX

< MAX

Tempo de cultivo
A: fase de latncia ou lag
B: fase de acelerao
C: fase log ou exponencial
D: fase de desacelerao
E: fase estacionria
F: fase de declnio ou morte celular

- taxa especfica de
crescimento celular:

= (1/X) dX/dt

CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA: FASE LAG


Adaptao ao novo ambiente: reorganizao dos constituintes moleculares
das clulas

Fatores que aumentam a durao da fase lag:


inculo com concentrao celular reduzida;
baixa concentrao de nutrientes e de fatores de crescimento no meio de cultura;
inculo com idade avanada.

A fonte de carbono de mais


fcil utilizao (C1) reprime a
sntese de enzimas requeridas
para o metabolismo da fonte
(C2).

log (no de clulas)

Crescimento diuxico:
alteraes metablicas.
utilizao
da fonte C2
utilizao
da fonte C1
tempo

CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA: FASE LOG


A massa celular e o nmero de clulas aumentam
exponencialmente com o tempo

Perodo de crescimento balanceado:


A composio mdia das clulas permanece aproximadamente constante;
Formao de metablitos primrios;

Crescimento celular independe da concentrao de substratos.

Crescimento exponencial :

dX/dt = X

X: concentrao celular
t: tempo de cultivo
= max

Tempo de duplicao da biomassa (td):

td = (ln 2)/max

Reaes Anablicas Sntese


Anabolismo: Conjunto de fenmenos bioqumicos
que se processam no organismo vivo,
destinados a regenerar, a partir de substncias
simples, a matria viva que se gasta durante
a fase catablica do metabolismo, atravs das
queimas respiratrias intracelulares. por
intermdio destas ltimas que o organismo obtm
a energia necessria ao seu funcionamento.

Reaes Catablicas Degradao


Catabolismo: Processo metablico destrutivo,

por meio do qual clulas do organismo transformam


substncias complexas em outras mais simples.

Metablito: Qualquer substncia, produzida por


metabolismo.

Metablito primrio: Substncia produzida por


metabolismo primrio (produzidos na fase de
crescimento exponencial da clula).

Metablito secundrio: Substncia produzida por


metabolismo secundrio (no associados ao
crescimento celular).

Metablitos Primrios

Metablitos Secundrios:

Produtos gerados
na fase de crescimento
exponencial

No associados ao crescimento;
Muitos metablitos apresentam
maior produo na fase
estacionria

ln X

tempo

CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA:


FASE DE DESACELERAO
CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA:
FASE DE DESACELERAO
Perodo de crescimento desbalanceado.

O stress induzido pela exausto de um nutriente ou pelo


acmulo de resduos.

Reestruturao microbiana para


sobrevivncia em ambiente hostil.

aumentar

CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA:


FASE ESTACIONRIA
No h crescimento celular lquido

Ocorre catabolismo de reservas celulares:


Produo de energia e novos blocos construtores

Fenmenos que podem ocorrer durante a fase estacionria:


A massa celular mantm-se constante, com reduo no nmero de
clulas viveis.
Lise celular, com reduo no nmero de clulas viveis. Produtos
da lise celular: nutrientes para as clulas viveis remanescentes.
Clulas metabolicamente ativas produzem metablitos
secundrios.

CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA:


FASE DE DECLNIO OU MORTE CELULAR
A morte celular resulta da diminuio da concentrao de
nutrientes e do acmulo de produtos txicos:

dN/dt = -k N
Forma integrada:

N = Ns e-kt
onde: N: concentrao de clulas viveis
Ns: concentrao de clulas viveis no final da
fase estacionria
k: constante da taxa de morte

PARMETROS DO CRESCIMENTO CELULAR


Fatores de Rendimento Aparente ou Global
Variam de acordo com a fase do cultivo celular;
Definidos com base no consumo de um material:

YX/S = - X/S

YP/X = P/X

YP/S = - P/S

Rendimento Aparente ou Observado (Y)


As condies de cultivo
podem alterar o padro de
utilizao de um substrato

Os coeficientes de
rendimento aparentes no
so constantes verdadeiras

Para uma dada fonte de carbono:

Substrato

Biomassa
Produto extracelular

Clula
Energia para crescimento
Energia manuteno

ST =

Sbiomassa + Sproduto extracelular + Screscimento + Smanuteno

Rendimento Terico (Y)


Baseado na estequiometria da reao
Substrato Produto

X
=

TERICO

X
=
( + )

OBSERVADO

X : Variao de Biomassa

ST: Variao de total substrato

SG: Variao de substrato

SR: Variao de substrato

direcionado para a produo do

direcionado para outras atividades

material de interesse

(manuteno)

Rendimento mximo Representa o rendimento sem competio de


outras reaes

EXERCCIO:
Rendimento Terico (Y) X Aparente (Y)
A reao para a produo aerbica do cido actico a partir
do etanol :
C2H5OH + O2 CH3CO2H + H2O
(etanol)
(cido actico)
A bactria Acetobacter aceti adicionada em um meio
vigorosamente aerado contendo etanol a uma concentrao
inicial de 10 g/l. Aps algum tempo, a concentrao de etanol 2
g/l e a concentrao de cido actico produzido 7,5 g/l.
Compare o rendimento aparente com o terico.
Explique a razo das diferenas ou semelhanas dos valores
encontrados.

PADRES CINTICOS DE CRESCIMENTO E


DE FORMAO DE PRODUTOS EM BATELADA
Produtos associados ao
crescimento
Produtos no associados ao
crescimento
Produtos parcialmente associados ao
crescimento

PADRES CINTICOS DE CRESCIMENTO E


DE FORMAO DE PRODUTOS EM BATELADA
Produtos associados ao crescimento:
As taxas especficas de formao do produto e de
crescimento celular so proporcionais

qP = (1/X)(dP/dt) = Yp/x

Ex: metablito primrio:


etanol

X
ou
P

tempo

PADRES CINTICOS DE CRESCIMENTO E


DE FORMAO DE PRODUTOS EM BATELADA
Produtos parcialmente associados ao
crescimento
A formao do produto ocorre
durante as fases de crescimento
lento e estacionria.
X
Equao de Luedeking-Piret

ou
P

qP = X +
Exemplo:
cido ctrico
tempo

Se = 0 O produto no associado ao crescimento


Se = 0 O produto ser somente associado ao crescimento e = YP/X

PADRES CINTICOS DE CRESCIMENTO E


DE FORMAO DE PRODUTOS EM BATELADA
Produtos no associados ao crescimento:
A formao do produto ocorre durante a fase estacionria,
quando a taxa de crescimento celular nula.

qP = = constante
X
ou
P

Ex: metablitos secundrios:


antibiticos, vitaminas

tempo

DETERMINAO DA CONCENTRAO
DE CLULAS
MTODOS
Diretos: determinao da populao total e/ou do
nmero de clulas viveis (sujeitos a interferentes)
Indiretos : baseados na medida de consumo de
substrato e/ou na formao de produtos

MTODOS DIRETOS
Mtodo do Hemocitmetro
A suspenso celular, colocada em uma cmara de volume conhecido,
observada no microscpio ptico.

profundidade: 0,1 mm
1 mm X 1 mm X 0,1 mm = 0,1 L

- aplicvel a meios de cultura sem outras partculas suspensas;


- pode-se usar corantes para se distinguir entre clulas vivas e mortas (clulas
totais e clulas viveis);
- adequado para clulas no agregadas.

MTODOS DIRETOS
Mtodo de Plaqueamento
Placas de Petri com meio de cultura gelificado so usadas para a
contagem de clulas viveis (capazes de se reproduzir)

~ 25 geraes colnia visvel a olho nu


Clulas metabolicamente ativas podem no formar colnias se o
meio e as condies de cultura no forem adequados
Mtodo adequado para bactrias e leveduras

MTODOS DIRETOS
Medida da Massa Seca
Aplicvel a meios de cultura sem outras partculas suspensas.

Centrifugao
Determinao
rpida:
volume empacotado

Filtrao

Secagem
80oC, 24 h

Massa
seca
celular

MTODOS INDIRETOS
Mtodos Indiretos:
Baseados na medida de consumo de
substrato e/ou na formao de
produtos
Monitoramento de componentes intracelulares:
DNA, protenas, RNA, ATP, NADH E outros
Quantificao de substratos:
Oxignio, fontes de carbono, fontes de nitrognio
Quantificao de produtos:
Etanol e cido ltico (processos anaerbios);
CO2 (processos aerbicos);
H+ (queda no pH resultante do uso de amnio)
Monitoramento da viscosidade:
Aumento: Crescimento de miclios
Formao de polissacardeo extracelular
Reduo: substrato = polmero biodegradvel

Bibliografia recomendada
o DORAN, P. M. - Bioprocess Engineering Principles, 2a edio,
Editora Academic Press Ltd., London, 1997. cap. 11
o SHULER, M. L.; KARGI, F. - Bioprocess Engineering Basic
Concepts, Editora Prentice- Hall International Inc., Englewood Cliffs,
1992. 2a. Edio cap. 6

o PELCZAR, M. - Microbiologia . Vol 1, 2a edio, Makron Books,


1996.