MAKALAH KIMIA ANALITIK INSTRUMEN

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

(HPLC)

DISUSUN OLEH :
KELOMPOK 2
1. Agung Aditya

(06144041)

2. Akhmad Hafiz Adytia

(06144041)

3. Oci Oktarini

(061440411710)

4. Putu Injario

(061440411712)

KELAS : 2 EG.C
DOSEN PEMBIMBING : Dr. Ir. Rusdianasari, M.Si.

Jurusan Teknik Kimia

Program Studi Teknik Energi (S1)
POLITEKNIK NEGERI SRIWIJAYA
Tahun Ajaran
2015

KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis haturkan kepada Allah SWT yang telah memberikan
petunjuk dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan Makalah ini
sesuai waktu yang telah ditentukan setelah. Makalah Kromatografi Cair Kinerja
tinggi ini berperan penting dalam menambah pengetahuan mengenai cara kerja
dan mekanisme dalam penggunaan HPLC itu sendiri. Pembuatan Makalah ini
bertujuan agar para mahasiswa dapat mengetahui, memahami dan
mengaplikasikan sesuai dengan apa yang telah dipelajari. Penulisan laporan ini
juga dibuat untuk memenuhi syarat mata kuliah Kimia Analitik Instrumen
Teknik Energi Politeknik Negeri Sriwijaya.
Dalam menyelesaikan Makalah Kromatografi Cair Kinerja
tinggi (HPLC), penulis banyak mendapatkan pengarahan dan
bimbingan serta bantuan dari berbagai pihak. Untuk itu penulis
mengucapkan banyak terima kasih kepada :
1. Ibu Dr. Ir. Rusidanasari M,Si selaku dosen pembimbing
2. Serta Teman-teman kelas 2 EGC.
Penulis juga mengharapkan kritikan dan saran dari para pembaca sehingga
penulis dapat memperbaiki kesalahan-kesalahan dalam penyusunan makalah
selanjutnya. Demikian makalah ini, semoga makalah yang telah penulis buat dapat
bermanfaat bagi semua pihak.

Palembang, 19 Maret 2015

Penulis

BAB I
LATAR BELAKANG
Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacammacam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa
gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan
ataupun suatu padatan. Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903,
mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu
kolom yang berisi kapur (CaSO4). lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett
untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom.
Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi
untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui
sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.
Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai
digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian
pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai
berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938
oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958.
Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini
mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kroinatografi
cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan
kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah
pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an
kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih.
Pembahasan teknik kromatografi modern, baru lengkap bila disebut
kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik
merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase cair yang
mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi. Umumnya metode itu
dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama.
Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup
kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi
oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2

(3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dan
eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1).
Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih
cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang
tersedia di pasar dewasa ini agak mahal, HPLC telah terbukti luas penggunaannya
dalam kimia organic.
Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas
berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama
dan segala prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an,
semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai
suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High
Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan
Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam
keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga
sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi
dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik
yang sudah matang dan dengan cepat KCKT mencapai suatu keadaan yang
sederajat dengan kromatografi gas.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Pengertian HPLC
Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif
dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. HPLC secara mendasar
merupakan sebuah perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari
pelarut yang menetes melalui kolom di bawah pengaruh gravitasi, HPLC didukung oleh
pompa yang dapat memberikan tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Hal ini membuat
HPLC dapat memisahkan komponen sampel lebih cepat. Saat ini, HPLC merupakan teknik
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam
suatu sampel dalam berbagai bidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi,
polimer, dan industri-industri makanan. Beberapa perkembangan HPLC terbaru antara
lain : miniaturisasi sistem HPLC, penggunaan HPLC untuk analisis asam-asam nukleat,
analisis protein, analisis karbohidrat, dan analisis senyawa-senyawa kiral.
2.2 Jenis- Jenis HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya
lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang
non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering
kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain
klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan
atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi
kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya
menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina,
meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya.
Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut.
Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat
terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara
kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan
fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan
kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau
dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH
sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi
atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan
fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak
terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
3. Kromatografi penukar ion
HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion
dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun
demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan
kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya.
Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut
organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh
kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam
dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan
kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada
resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel
ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel
ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat
digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000
dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus
sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase
diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih

dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul
yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati
porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan
dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti
tipe kromatografi yang lain.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang
sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap
sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada
sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran
yang sangat kompleks.
2.3 Prinsip Kerja
Kerja KCKT pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai
fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada
HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan
terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu
retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya
terpisah.
Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa
terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol <
golongan asam.
KCKT dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif
cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time
(RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai
peak milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari
signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama.
Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan
adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.
Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang
dianalisis di dalam sampel. Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC

adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom
C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya.
Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom
Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-,
di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis
kolom dan juga fasa mobil.
Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah
proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram.
Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis
komponen dalam sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai
kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk
(overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh
karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih
rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis.
Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain
zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.
Seleksi Tipe KCKT
Analisis (pengguna KCKT) sebelum mengoperasikan KCKT, harus
membuat keputusan tipe yang mana yan gharus dipilih yang dapat memberikan
informasi yang diinginkan.
Skema I : Seleksi tipe KCKT adalah suatu petunjuk umum untuk seleksi
tipe KCKT . Informasi ini akan memudahkan para analis untuk memutuskan
pemelihan tipe KCKT yang memberikan para analis untuk memutuskan pemilihan
tipe KCKT yang memberikan kemungkinan terbaik pada pemisahaan yang
diinginkan. Namun, sampel yang tidak dikenal (unknown) akan menyulitkan
pemilihannya tipe KCKT.
Informasi seperti kelarutan, gugus fungsi yang ada, besarnya Berat
Molekul dapat diperoleh dari pembuat informasi, pemberi sampel, atau data
spektroskopik seperti nucleic magnetic resonance Spectrosphotometer, infra red
spectrophotometer, ultra violet spectrumeter, dan mass

Spectrophotometer. Semua data-data ini dapat digunakan sebagai petunjuk

bagi analis memilih tipe HPLC yang tepat untuk digunakan.

2.4 Kelebihan dan Kekurangan KCKT

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam banyak
hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang sama
membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak
diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak
menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT
menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih besar bagi para analis
laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada KCKT karena teknik ini dapat
digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya digunakan.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi
cair klasik, antara lain:
Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu
analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai
Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi
selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat;

pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi
secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT memberikan parameter
tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat.
Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram
(10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi,
Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT.
Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik,
kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan
dengan kolom yang sma sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven
dan jenis solven yang digunakan.
Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat zat yang tidak bisa dianalisis
dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies
ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat zat
tersebut.
Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak
menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena
itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah sikumpulkan setelah melewati detector.
Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar
ion memerlukan prosedur khusus.
Dismping kelebihan diatas, KCKT juga memiliki kekurangan, yaitu :
Mahal
Sampel yang digunakan jumlahnya sedikit
Perlu tenaga ahli untuk mengoperasikan

BAB III
INSTRUMENTASI ALAT

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase
gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

Komponen-komponen penting dari KCKT dapat dilihat pada Gambar dibawah ini :

3.1. Pompa (Pump)

Fase gerak d

3.1. Pompa (Pump)

Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada
dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan
konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu:
pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran
yang berdenyut teratur (pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau
peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila
detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak
terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya
terbatas.
3.2. Injektor (injector)
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi
yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum :
a. Stopped Flow
b. Solvent Flowing
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
a. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem
tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di
dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi

b. Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada
Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir.
Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi
Cair.Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat
menyebabkan penyumbatan.
b. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih
besar dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor
yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi
LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan,
maka sampel akan masuK ke dalam kolom.
3. 3. Kolom

Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung
pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi
dua kelompok :
a. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis
material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah
50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang
5 cm.
b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang
kolom 25 -100 cm.
Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada
temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama
untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom
tergantung pada model KCKT yang digunakan (Liquid Solid Chromatography,
LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC; Ion Exchange Chromatography, IEC,
Exclution Chromatography, EC)
3.4. Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam
kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif).Detektor yang
baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier
yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah
terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat
diperoleh.
Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel
panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range
yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada
kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor
UV. Detektor-detektor lainnya antara lain:

3.5

Detektor Fluorometer
Detektor lonisasi nyala

Detektor Spektrofotometer Massa

Detektor Refraksi lndeks

Detektor Elektrokimia

Detektor Reaksi Kimia

Sistem penyuntik

Teknik penyuntikan harus dilakukan dengan cepat untuk mencapai ketelitian

maksimum analisis kuantitatif. Yang terpenting sistem harus dapat mengatasi tekanan balik
yang tinggi tanpa kehilangan terokan. Pada saat pengisian terokan, terokan dialirkan melewati
lekuk dan kelebihanya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan, katup diputar
sehingga fase gerak mengalir melewati lekuk ke kolom.

3.6.

Tendon pelarut
Tendon pelarut atau fase gerak mempunyai ciri yaitu bahan tendon harus lembam
terhadap berbagai fase gerak berair dan tak berair. Sehingga baja anti karat jangan dipakai pada
pelarut yang mengandung ion halida dan jika harus bertekanan, hindari menggunakan gelas.
Daya tampung tendon harus lebih besar dari 500 ml yang dapat digunakan selama 4 jam untuk
kecepatan alir yang umumnya 1 2 ml/menit.

3. 7

Elusi Gradien
Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama

analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu
retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi gradien
dijelaskan oleh Snyder.
Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :
a. Total waktu analisis dapat direduksi
b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah
c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)
d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak
Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradien dapat dipilih
dengan cara trial and error. Tabel 3. 1. berikut ini menunjukkan kompatibilitas dari
bermacam-macarn mode kromatografi cair dengan analisis gradien. Dalam praktek,
gradien dapat diformasi sebelum dan sesudah pompa.
Tabel 3. 1 : Mode Kompatibilitas dengan Gradien
Gradien Mode
Kromatografi Cair padat (LSC)
Kromatografi ekslusi
Kromatografi Penukar Ion (IEC)
Kromatografi Cair Cair (LLC)
Kromatografi Fasa Terikat (BPC)

Solven Gradien
Ya
Tidak
Ya
Tidak
Ya

3.8 Pengolahan Data (Data Handling)

Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk
kromatogram pada rekorder. Suatu tipe Kromatogram dapat dilihat pada Gambar 3. 2
berikut ini

Gambar 3.2 : kromatogram dari senyawa 5 Nukleotida

Dari Gambar 3.2. waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui /dihitung. Lni
bisa digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi kerja
dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan
konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif.
3.9 Fasa gerak
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah
satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada
solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat disukai,
yaitu rasa gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah

Fase dalam KCKT

Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak, KCKT (kolomnya) dibedakan

menjadi:
a. Kromatografi fase normal
Kromatografi dengan kolom konvensional dimana terdiri atas :
Fase diam : normal (bersifat polar), misalnya Silika gel
Fase gerak : bersifat non polar
Contohnya adalah sebuah kolom sederhana diisi dengan partikel silika yang
sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih
lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh
karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.
b. Kromatografi fase terbalik
Kromatografi fase terbalik terdiri atas :
Fase diam yang sifatnya non polar, misalnya Silika gel direaksikan dengan

klorosilan, dan
Fase gerak yang bersifat polar
Contoh kasusnya yaitu silika yang dimodifikasi menjadi non polar melalui

pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana

baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa
campuran air dan alkohol seperti metanol.
Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan
molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan
sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase
diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul
polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama
dengan pelarut.
Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk
atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals.
Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan
pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada
dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawasenyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat
dalam kolom.
Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.
Keuntungan kromatografi fase terbalik :

Senyawa yang polar akan lebih baik pemisahannya

Senyawa ionic dapat dipisahkan
Air dapat digunakan sebagi pelarut

BAB IV
APLIKASI INDUSTRI
HPLC juga cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak
atsiri terdiri atas campuran yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna
untuk memisahkan campuran rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau

memisahkan golongan senyawa menjadi komponen-komponennya.

HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak, misalnya terpenoid
tinggi, segala senyawa jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula. HPLC baik digunakan
untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spekrum UV atau spectrum sinar
tampak.
Kolom yang tersedia mempunyai banyak sekali pelat teori (lebih dari 100.000
untuk kolom 100 cm), dan kromatografi dilakukan dalam kondisi mendekati
kondisi ideal demikian rupa sehingga dapat diperoleh dalam beberapa menit dan
ditafsirkan secara kuantitatif dengan ketepatan yang lumayan. Cuplikan dapat
dipisahkan secara preparative.

BAB V
PENUTUP
A. Kesimpulan
Kesimpulan yang dapat ditarik dari pemaparan makalah ini yaitu sebagai berikut :

1. Karakteristik dari KCKT yang membedaknnya dengan kromatografi lainnya yaitu pada
KCKT digunakan pompa yang dapa diatur pada tekanan tinggi untuk mendorong fasa
gerak.
2. Jenis-jenis KCKT antara lain kromatografi padatan cair, kromatografi partisi,
kromatografi penukar ion (IEC), kromatografi eksklusi, kromatografi pasangan ion
(IPC)
3. Instrumentasi pada KCKT terdiri atas : pompa, injector, kolom, detector, system
penyuntik, tendon pelarut.
4. Prinsip kerja KCKT adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya.
Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk
sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada
spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.
5. KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik,
antara lain: Cepat, Resolusi, Sensitivitas detector, Kolom yang dapat digunakan
kembali, Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik, Mudah rekoveri sampel.
B. Saran
Saran yang dapat kami ajukan melalui makalah singkat kami ini ialah agar proses
pembelajaran berjalan lancar, sebaiknya para mahasiswa menggunakan HPLC ketika
praktikum di laboratorium, tidak hanya sebatas pengetahuan materi.

DAFTAR PUSTAKA
Dr.Ir.Rusdianasari, M.Si, Ir.K.A. Ridwan, M.T. 2015. Kimia Analitik Instrumen .
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. POLSRI. diakses pada tanggal 10 Maret 2015

Kromatografi cair kinerja tinggi

(http://kimia analitik instrumen/HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

~ Lansida.htm) diakses tanggal 11 maret 2015
Kromatografi cair kinerja tinggi (hplc)
(http://FAITHFUL KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (HPLC).htm)
diakses tanggal 11 maret 2015
Kromatografi cair kinerja tinggi
(rahasia kimia Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).htm) diakses tanggal 11
maret 2015