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Los factores de supervivencia de los neutrfilos (TNF-alfa, GM-CSF y G-CSF)

producidos por los macrfagos en gatos infectados con el virus de la peritonitis


infecciosa felina contribuyen a la patognesis de las lesiones granulomatosas.
Resumen: La peritonitis infecciosa felina (FIP) es una enfermedad mortal inducida por
coronavirus felino (FCoV) de gatos domsticos y salvajes. La infiltracin de neutrfilos en
lesiones granulomatosas es inusual para una enfermedad viral, pero es un hallazgo tpico
de FIP. Este estudio tuvo como objetivo investigar la razn de las lesiones que contienen
neutrfilos en gatos con FIP. Se cultivaron neutrfilos de gatos con FIP y se evaluaron los
cambios en la tasa de supervivencia celular. Adems, se investig la presencia o ausencia
de factores de supervivencia de neutrfilos en especmenes recogidos de gatos con FIP.
Adems, se investig si los macrfagos, una de las clulas diana de la infeccin por FIPV,
producen factores de supervivencia de neutrfilos (TNF-alfa, GM-CSF y G-CSF). Se
demostr que los macrfagos infectados por el virus sobreproducir los factores de
supervivencia de neutrfilos, y estos factores actan sobre los neutrfilos y regular su
supervivencia. Estas observaciones sugieren que la produccin sostenida de factores de
supervivencia de neutrfilos por macrfagos durante la infeccin por FCoV es suficiente
para la supervivencia de neutrfilos y contribuye al desarrollo de lesiones granulomatosas.
Introduccin: El coronavirus felino (FCoV) pertenece al grupo I de la familia
Coronaviridae. FCoV consta de tres protenas principales: protena nucleocpsida (N),
protena de membrana (M) y protena peplmera (S). El FCoV se clasifica en los serotipos
I y II de acuerdo con la secuencia de aminocidos de su protena S. Ambos serotipos
constan de dos biotipos: el virus de la peritonitis infecciosa felina (FIP) y el coronavirus
entrico felino (FECV). As, hay tipos I y II FECV y FIPV en FCoV. FECV es asintomtica
en gatos, pero FIPV causa FIP. Se ha propuesto que FIPV surge de FECV por mutacin,
pero la mutacin exacta y los factores inductores an no se han aclarado. FIP es una
enfermedad fatal, caracterizada por vasculitis asociada con inflamacin granulomatosa
que contiene clulas B, neutrfilos y macrfagos. La infiltracin de neutrfilos en lesiones
granulomatosas es inusual para una enfermedad viral, pero es un hallazgo tpico de FIP.
Los macrfagos/monocitos desempean un papel importante en la patognesis de la FIP.
Se ha informado de que la diferencia en la proliferacin de macrfagos / monocitos est
relacionada con la diferencia de patogenicidad entre FECV y FIPV. Tambin se ha
informado de la posibilidad de lesin de clulas endoteliales vasculares felinas causada
por metaloproteinasa-9 y TNF-alfa producidas por monocitos infectados con FIPV. Se
inform de que la replicacin del virus en los macrfagos inducida por TNF-alfa
produccin, y el TNF-alfa producido se implic en el agravamiento de la FIP patologa:
TNF-alfa producido por FIPV-macrfagos infectados particip en la linfopenia y un
aumento en el nivel de la clula Receptor de FIPV de tipo II, aminopeptidasa N. El TNFalfa inhibe la apoptosis de neutrfilos, lo que sugiere su participacin en la infiltracin de
neutrfilos en lesiones granulomatosas en gatos con FIP, pero esto an no se ha
aclarado. Tampoco est claro si los macrfagos / monocitos infectados con FIPV
producen factores distintos de TNFalfa que estn relacionados con la supervivencia de los
neutrfilos. En este estudio, se investig la razn de las lesiones granulomatosas que
contienen neutrfilos en gatos con FIP. Se cultivaron neutrfilos de gatos con FIP y se
examinaron los cambios en la tasa de supervivencia. Tambin se investig la presencia o
ausencia de factores de supervAdems, se evalu si los macrfagos, una de las clulas

diana de FIPV, producen factores de supervivencia de neutrfilos.ivencia de neutrfilos en


especmenes de gatos con FIP.
Materiales y mtodos
Experimentacin de animales: La cepa FIPV de tipo II 79-1146 (104 TCID50/ml) se
administr oralmente a gatos SPF de 6 a 8 meses de edad. Nueve gatos que
desarrollaron sntomas FIP (FIP), como fiebre, prdida de peso, derrame peritoneal o
pleural, disnea, lesiones oculares y sntomas neurales, y nueve gatos SPF de 6 a 8 meses
de edad, administraron un medio de una infeccin simulada como controles se utilizaron
en este estudio. Los diagnsticos de FIP se confirmaron en el examen post-mortem,
revelando derrames peritoneales y pleurales y lesiones granulomatosas en rganos
mayores.
Cultivo de clulas y virus: Se cultivaron clulas Felis catus enteras fetus-4 (Fcwf-4) en
medio esencial mnimo de Eagle que contena 50% de medio L-15, 5% de suero fetal de
ternera (FCS), 100 U/ml de penicilina y 100 lg/ml de estreptomicina. Los neutrfilos felinos
y los macrfagos alveolares se mantuvieron en medio de crecimiento RPMI 1640
suplementado con FCS al 10%, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 lg/ml y 2mercaptoetanol 50 lM. La cepa FIPV de tipo II 79 - 1146 se cultiv en clulas Fcwf - 4 a
37C. La cepa FIPV 79-1146 fue suministrada por el Dr. M. C.
Anticuerpos: El MAb 6-4-2 (IgG2a) utilizado en el presente estudio reconoce la protena
S del FIPV de tipo II, como se demuestra por inmunotransferencia. Se ha informado de
que el MAb 6-4-2 tiene actividad neutralizante de virus en ensayos llevados a cabo en
clulas Fcwf-4 y CrFK, pero una actividad potenciadora en cultivos de macrfagos felinos,
dependiendo de las condiciones de reaccin.
Muestras de gatos SPF y FIP: La sangre recogida de los gatos SPF y FIP usando una
jeringa heparinizada se centrifug a 3.000 rpm durante 10 min, y el sobrenadante se us
como una muestra de plasma. Se recogi fluido de ascitis de gatos FIP usando una
jeringuilla heparinizada y se centrifug a 3.000 rpm durante 10 min, y se recogi el
sobrenadante.
Separacin de neutrfilos: La sangre heparinizada (10 ml) de gatos SPF y FIP se diluy
en dos etapas con solucin salina tamponada con fosfato (PBS) y se someti a
centrifugacin en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque a 1.700 rpm durante 20 min.
Despus de la extraccin de clulas mononucleares de sangre perifrica y sobrenadante
por aspiracin de la capa superior, los grnulos se mezclaron con un volumen igual de
solucin salina que contena dextrano al 6% para separacin de granulocitos y se dejaron
reposar durante 45 min a 37C. La capa transparente superior se centrifug a 400 g
durante 10 minutos y el precipitado se mezcl con 4 ml de NaCl al 0,2% durante 2
minutos para eliminar los eritrocitos contaminantes y luego se mezcl con 4 ml de NaCl al
1,6%. Las clulas se lavaron tres veces con PBS y se resuspendieron con medio de
crecimiento. Se evalu que la pureza celular era ms del 98% de neutrfilos mediante el
examen de un frotis teido con soluciones Wright/Giemsa.
Cultivo de neutrfilos con especmenes de gatos FIP: Para examinar el efecto de los
especmenes de gatos sobre la tasa de supervivencia de neutrfilos, se sembraron
neutrfilos felinos (1 9 105 clulas / 100 l) en placas de 96 pocillos y se cultivaron en

presencia de fluido asctico derivado de FIP-cat (concentracin final de 1:20), plasma


(concentracin final de 1:20) y plasma derivado de SPF-gato (concentracin final 1:20)
durante 24 h. Antes y despus de la incubacin, se aadieron 10 l de solucin WST-8
(kit de ensayo de proliferacin celular WST-8, Kishida Chemical Co., Ltd, Japn). WST-8
es una sal de tetrazolio que reacciona con las deshidrogenasas mitocondriales, formando
el colorante de formazano. La expansin del nmero de clulas viables da como resultado
un aumento de la actividad de las deshidrogenasas mitocondriales en las clulas, lo que
corresponde a un aumento en el metabolismo del colorante de formazano. Despus de
que las clulas se devolvieron a la incubadora durante 4 h, se midi la absorbancia del
formazn producido a 450 nm con un lector de placas espectrofotomtricas de 96 pocillos,
segn lo descrito por el fabricante. El porcentaje de viabilidad se calcul usando la
siguiente frmula: Viabilidad celular (%) = (despus de la incubacin OD / antes de la
incubacin OD) 9 100.
Recuperacin de macrfagos alveolares: Los macrfagos alveolares felinos se
obtuvieron a partir de gatos SPF y FIP mediante lavado broncoalveolar con solucin salina
equilibrada de Hank (HBSS) como se describi previamente por Hohdatsu et al.
Aislamiento de ARN y preparacin de cDNA
El aislamiento de ARN y la preparacin de cDNA se realizaron empleando el mtodo
de et al.
Determinacin de los niveles de ARNm de GAPDH felino, mRNA de TNF-alfa, ARNm
de G-CSF, ARNm de GM-CSF y expresin gnica de FCoVN.
El ADNc se amplific mediante PCR usando cebadores especficos para ARNm de
GAPDH felino, ARNm de TNF-alfa, ARNm de G-CSF, ARNm de GM-CSF y FCoV N. Las
secuencias de cebador se muestran en la Tabla 1. La PCR se realiz usando el mtodo
de Takano et al.
La densidad de banda se cuantific bajo una exposicin UV adecuada por densitometra
de video usando el software Scion Image (Scion Corporation, EE.UU.). El ARNm de TNFalfa, ARNm de G-CSF, ARNm de GM-CSF y FCoV N se analizaron cuantitativamente en
trminos del valor de densidad relativa comparado con el ARNm para el gen de
mantenimiento GAPDH.
Ensayo de placa: Se inocularon monocapas de clulas Fcwf-4 confluentes en placas de
24 pocillos con 100 \ mu l de las diluciones de la muestra. Despus de la adsorcin del
virus a 37 C, las clulas se lavaron con HBSS y se aadieron a cada pocillo 1 ml de
medio de crecimiento que contena carboximetilcelulosa al 1,5%. Los cultivos se
incubaron a 37C durante 2 das, se fijaron en formalina tamponada al 10% y se tieron
con 1% de violeta de cristal.
Inoculacin de macrfagos alveolares felinos con FIPV: La suspensin vrica (FIPV
cepa 79-1146, 2 9 103 TCID50 / 0,1 ml) y la solucin de MAb 6-4-2 se mezclaron en una
proporcin en volumen igual y se dejaron reaccionar a 4C durante 1 h, y 0,1 ml de esta
solucin de reaccin Se us para inocular macrfagos alveolares felinos (2 9 106 clulas)
cultivados en cada pocillo de placas de 24 pocillos. Como controles, el medio solo y la
suspensin de virus solo se aadieron a los macrfagos alveolares felinos. Despus de la
adsorcin del virus a 37C durante 1 h, las clulas se lavaron con HBSS y 1 ml de medio

de crecimiento. Las clulas y el sobrenadante del cultivo se recogieron cada 24 horas a


partir de entonces. Las clulas se usaron para la medicin de los ARNm de TNF-alfa,
mRNA de G-CSF, ARNm de GM-CSF y genes de FCoV N. Los ARNm de TNF alfa, ARNm
de G-CSF, ARNm de GM-CSF y FCoV N se analizaron cuantitativamente en trminos del
valor de densidad relativa en comparacin con el ARNm para el gen de mantenimiento
GAPDH. El sobrenadante del cultivo se emple para la determinacin del ttulo del virus.
Anlisis estadsticos: Los datos se analizaron mediante la prueba t de Student. Los
datos de la Fig. 1a, b se analizaron tambin utilizando la prueba de Mann-Whitney. P
valores \ 0,05 se consideraron para indicar una diferencia significativa entre los grupos
comparados.
Resultados: Contaminacin de neutrfilos en la sangre de los gatos SPF y FIP
Se examinaron los recuentos de neutrfilos en sangre perifrica de gatos FIP y se
compararon con los de gatos SPF no infectados. El recuento de neutrfilos en el
momento del muestreo de sangre se muestra en la Fig. 1. Los recuentos de neutrfilos en
sangre en los gatos SPF y FIP fueron 5,252 1,493 ll-1 (media DE) y 9,425 3,996 ll-1,
y los valores medianos fueron 4,921 y 8,093 ll-1, respectivamente (P \ 0,05).
Tasa de supervivencia de los neutrfilos de los gatos SPF y FIP: Para investigar la
causa del aumento de los recuentos de neutrfilos en gatos FIP, se aislaron neutrfilos de
gatos SPF y FIP y se compararon las tasas de supervivencia despus de 24 h de cultivo.
La tasa de supervivencia de los neutrfilos de los gatos FIP se increment, pero no
significativamente (P = 0,122), en comparacin con la de los gatos SPF (Fig. 2).
Tasa de supervivencia de neutrfilos en especmenes de SPF y FIP gatos: La tasa de
supervivencia de los neutrfilos en presencia de especmenes de los gatos FIP fue
significativamente mayor que la de los neutrfilos cultivados con plasma SPF derivado de
plasma y medio (Fig. 3).
TNF-alfa, GM-CSF y G-CSF y los niveles de expresin de genes de FCoV N en
macrfagos de gatos SPF y FIP.
TNF-alfa, GM-CSF, y G-CSF mRNA y FCoV N niveles de expresin gnica se
incrementaron en macrfagos alveolares derivados de FIP gatos (Fig. 4].
El sobrenadante de cultivo de macrfagos infectados con FIPV promueve la supervivencia
de neutrfilos
El ttulo de virus fue significativamente mayor en el sobrenadante de cultivo de
macrfagos infectados con una mezcla de FIPV y MAb 6-4-2 que en el de macrfagos
cultivados con medio y FIPV solo. Las tasas de supervivencia de los neutrfilos
aumentaron significativamente en presencia del sobrenadante del cultivo de macrfagos
infectados con la mezcla de FIPV y MAb 6-4-2 en comparacin con aquellos en presencia
de otros sobrenadantes (Figura 5).
Relacin entre la expresin de mRNA de TNF-alfa, GM-CSF y G-CSF y la replicacin de
FIPV en macrfagos.

Cuando los macrfagos alveolares derivados de SPF-gato se infectaron con una mezcla
de FIPV y MAb 6-4-2, los niveles de ARNm intracelular de TNF-alfa, GM-CSF y G-CSF
aumentaron (Figura 6).
Discusin: Los neutrfilos son importantes para la defensa del husped frente a los
patgenos. La infeccin viral generalmente reduce el nmero de neutrfilos. Se considera
que la transferencia de neutrfilos de la sangre perifrica a tejidos marginales, la
destruccin de neutrfilos debido al exceso de produccin de anticuerpos y la muerte
celular directa causada por infeccin viral son las causas de la neutropenia. En el virus de
la inmunodeficiencia humana y las infecciones por parvovirus canino, se ha sugerido un
recuento reducido de neutrfilos para permitir una infeccin bacteriana grave. El virus de
la inmunodeficiencia felina y las infecciones por el virus de la panleucopenia felina
tambin afectan a las clulas del estroma en la mdula sea, lo que conduce a una
disminucin de la produccin de neutrfilos. En contraste, el coronavirus del sndrome
respiratorio agudo severo (SARS), que pertenece a la misma familia que la FIPV, tambin
puede causar neutrofilia. La neutrofilia tambin ha sido reportada en gatos con FIP.
Paltrinieri inform de que las citoquinas acelerar la entrega de neutrfilos a las lesiones
inflamadas, prolongando as la vida til de los neutrfilos circulantes. Tambin inform de
que la apoptosis de los neutrfilos se retrasa por las citoquinas, lo que aumenta la vida de
los neutrfilos en las lesiones. Es probable que la neutrofilia en gatos con PIF se asocie
con la infiltracin de neutrfilos en lesiones granulomatosas. Sin embargo, parece que no
existe una teora establecida para explicar la infiltracin de neutrfilos en lesiones
granulomatosas en gatos con FIP.
En los seres humanos, la vida til de los neutrfilos es corta. Cuando se aislan neutrfilos
de sangre perifrica y se cultivan in vitro, se induce la apoptosis y aproximadamente la
mitad de las clulas mueren en 24 h. Cuando los neutrfilos aislados de sangre perifrica
de gatos SPF se cultivaron durante 24 h, ms del 60% muri, lo que sugiere que los
neutrfilos felinos tambin mueren debido a la apoptosis, similar a los neutrfilos
humanos. Adems, la cocultura con especmenes de gatos FIP aument la tasa de
supervivencia de los neutrfilos, lo que sugiere que la produccin de factores implicados
en la supervivencia de los neutrfilos se incrementa en los gatos FIP, y estos factores
actan sobre los neutrfilos y prolongan su vida til.
Los niveles de mRNA de TNF-alfa, GM-CSF y G-CSF aumentaron en macrfagos de
gatos FIP. Estos niveles de mRNA de citoquina tambin estaban elevados en macrfagos
infectados con FIPV y MAb 6-4-2, aclarando la presencia de factores de supervivencia de
neutrfilos en el sobrenadante de cultivo de macrfagos. Se sugiri que: (1) los
macrfagos infectados con FIPV liberan TNF-alfa, GM-CSF y G-CSF en respuesta a la
replicacin del virus, y (2) estas citocinas actan sobre los neutrfilos y prolongan su
supervivencia. Anteriormente se inform de que FIPV-macrfagos infectados producido
TNFalpha y B-clulas de diferenciacin / factores de supervivencia, y estos factores
pueden haber estado involucrados en linfopenia e hipergammaglobulinemia. Kipar et al.
Sugirieron que los monocitos infectados con FIPV estn implicados en la lesin de clulas
endoteliales vasculares felinas. Las citoquinas y mediadores qumicos producidos por
macrfagos / monocitos infectados con FIPV pueden desempear un papel importante en
la patognesis de FIP en gatos. TNF-alfa, GM-CSF y G-CSF son citoquinas que inhiben la
apoptosis de los neutrfilos. Estas citocinas son secretadas por macrfagos y clulas T.

Cuando estas citocinas actan sobre los neutrfilos, el nivel intracelular de protena
inhibidora de la apoptosis aumenta, mientras que el nivel de protena promotora de la
apoptosis disminuye, prolongando la supervivencia de los neutrfilos. En las
enfermedades inflamatorias, como la fibrosis qustica y la enfermedad de Kawasaki, el
estado patolgico se agrava a medida que el tiempo de supervivencia de los neutrfilos se
prolonga. Adems, el agravamiento patolgico de las enfermedades inflamatorias est
asociado con proteasa y especies reactivas de oxgeno producidas por neutrfilos. Estos
mediadores tambin pueden producirse en exceso y agravar las lesiones granulomatosas
en gatos FIP. Ahora estamos progresando con estudios sobre la expresin de la apoptosis
inhibidor y promotor de protenas en neutrfilos de FIP gatos.
El aumento de la produccin de catepsina B en los macrfagos por la elastasa producida
por neutrfilos ha sido reportado, mientras que la FIPV requiere catepsina B invaden las
clulas, lo que sugiere que los neutrfilos tambin estn involucrados en un mecanismo
de mejora de la replicacin viral, diferente de la mejora dependiente de anticuerpos
(ADE), en la infeccin por FIPV. Addie et al. Informaron que la re-infeccin por FCoV de
los gatos domsticos con anticuerpos anti-FCoV positivos podra no resultar en el
desarrollo de ADE. La participacin de los neutrfilos en el aumento de la produccin de
FIPV en los macrfagos y la influencia de los macrfagos en la supervivencia de los
neutrfilos debe investigarse ms.
La produccin de virus y la expresin de mRNA de TNF-alfa, GM-CSF y G-CSF se
mejoraron marcadamente en macrfagos infectados con FIPV y MAb 6-4-2 en
comparacin con macrfagos infectados con el virus solo. Utilizamos la
inmunofluorescencia para detectar el antgeno FIPV: el 10-20% de las clulas fueron
positivas cuando los macrfagos alveolares derivados de SPF fueron infectados con FIPV
y MAb 6-4-2, mientras que el 1-2% de las clulas fueron positivas cuando los macrfagos
alveolares fueron infectados con FIPV. Parece que el aumento del nmero de macrfagos
infectados por virus conduce a la sobreexpresin del ARNm asociado al factor de
supervivencia de los neutrfilos en los macrfagos.
En gatos con FIP, el virus puede ser detectado en macrfagos de lesiones
granulomatosas. Para dilucidar el mecanismo de la infiltracin de neutrfilos en lesiones
granulomatosas, se usaron macrfagos alveolares, que se pueden recoger fcilmente en
nmeros apropiados. Adems, los macrfagos alveolares pueden cultivarse sin
tratamiento de activacin, a diferencia de los monocitos.
En este estudio, hemos demostrado que los macrfagos infectados por el virus
sobreproducir neutrfilos supervivencia factores, y estos factores actan sobre neutrfilos
y regular su supervivencia. Estas observaciones sugieren que la produccin sostenida de
factores de supervivencia de neutrfilos por macrfagos durante la infeccin por FCoV es
suficiente para la supervivencia de neutrfilos y contribuye al desarrollo de lesiones
granulomatosas. Estos hallazgos pueden ser importantes para elucidar la patognesis de
FIP.
Fig. 1: Recuento de neutrfilos en la sangre de los gatos SPF y FIP. Las lneas
horizontales representan la mediana de cada grupo. Secuencias de cebadores de PCR
para GAPDH felino, TNF-alfa, GM-CSF, G-CSF y FCoV N.

Fig.2: Tasa de supervivencia de neutrfilos en SPF y FIP gatos. Los neutrfilos de gatos
SPF (10610 ml) se cultivaron a 37C durante 24 horas en medio y la viabilidad celular se
evalu mediante el ensayo WST-8.
Fig. 3: Tasa de supervivencia de neutrfilos en especmenes de gatos SPF y FIP. Los
neutrfilos de gatos SPF (1 ^ {9} 106 ml ^ {- 1}) se cultivaron a 37C durante 24 h en
presencia del plasma de gatos SPF y FIP y ascitis de gatos FIP. La viabilidad celular se
evalu mediante el ensayo WST-8. N = 7, ** P \ 0,01.
Fig.4: TNF-alfa, GM-CSF y G-CSF mRNA y FCoV N niveles de expresin de genes en los
macrfagos de SPF y FIP gatos. Los macrfagos alveolares (2 9 106 clulas) se
recogieron de SPF y FIP gatos, y TNF-, GM-CSF y G-CSF mRNA y FCoV N expresin
fue detectada por RT-PCR. TNF-, GM-CSF, y G-CSF ARNm y FCoV N niveles de
expresin gnica se analizaron cuantitativamente en trminos de la densidad relativa valor
de mRNA para el hogar de genes GAPDH. N = 7, ND no detectado.
Fig. 5: El sobrenadante de cultivo de macrfagos infectados con FIPV promueve la
supervivencia de neutrfilos. Se cultivaron macrfagos alveolares derivados de SPF (2 9
106 clulas) con medio solo, FIPV, o FIPV y MAb 6-4-2. El sobrenadante de cultivo se
recogi despus de 72 h. El ttulo de virus en el sobrenadante del cultivo se midi
mediante el mtodo de ensayo en placa (a la izquierda). Los neutrfilos de gatos SPF (1 ^
{9} 106 ml-1) se cultivaron a 37C durante 24 h en presencia de cada sobrenadante de
cultivo (dilucin final de 1: 5) y la viabilidad celular se evalu mediante el ensayo WST-8
derecho). N = 6. ND no detectado.
FIG. 6 Relacin entre la expresin de mRNA de TNF-, GM-CSF y G-CSF y la replicacin
de FIPV en macrfagos. Se cultivaron macrfagos alveolares catados por SPF (2 9 106
clulas) con medio solo, FIPV, o FIPV y MAb 6-4-2. Las clulas se recogieron a 0 h (como
control) y 72 h. Los niveles de expresin de ARNm intracelular de TNF-alfa, GM-CSF y GCSF se midieron mediante RT-PCR. TNF-alfa, GM-CSF, y G-CSF ARNm se analizaron
cuantitativamente en trminos de la densidad relativa valor de mRNA para el hogar de
genes GAPDH. N = 6.