Electroforesis
David Alejandro Lpez de la Mora Ana Soledad Sandoval Rodrguez
Introduccin
En biologa molecular, una gran cantidad de tcni
cas que se realizan comnmente requiere el uso de la
electroforesis, lo que supone una parte importante del
procedimiento sistemtico del anlisis (separacin, puri
ficacin, preparacin) de los cidos nucleicos y las pro
tenas. La mayora de las biomolculas poseen una carga
elctrica cuya magnitud depende del pH del medio en
el que se encuentran; como consecuencia, pueden des
plazarse cuando se someten a un campo elctrico hacia
el polo de carga opuesta al de la molcula. A diferencia
de las protenas, que pueden tener una carga positiva o
negativa, los cidos nucleicos slo poseen carga negati
va, debido a su esqueleto de fosfatos. Por lo tanto, en
una electroforesis, los cidos nucleicos migrarn hacia
el polo positivo, es decir, el nodo. En el caso de las
protenas, que suelen ser de carga neutra, se realiza pre
tratamiento con detergentes, como el dodecilsulfato de
sodio (SDS), que les confiere carga negativa; con ello se
homogeneizan las protenas de la muestra y todas migra
rn hacia el polo positivo; slo se separarn por tamao.
El principio de la electroforesis consiste en la mi
gracin proporcional de las molculas a travs de un gel
u otro tipo de matriz porosa, segn su peso molecular o
tamao; movimiento generado por el campo elctrico.
Cmara de electroforesis
La cmara de electroforesis es un dispositivo que permite la
generacin de un campo elctrico alrededor de un gel en el
que se depositan las muestras. Este campo se genera dentro
de una solucin amortiguadora en la que se encuentra sumergido el gel que contiene las muestras; el alto contenido
de electrolitos permite la transmisin de la corriente elctrica, manteniendo el pH estable al paso de la corriente. La
cmara cuenta con dos polos que se conectan a una fuente
de energa. En las cmaras de electroforesis vertical el polo
positivo se encuentra en la parte inferior de la cmara (figura 13-2A) y en las horizontales, en uno de los extremos
(figura 13-2B). En ambos tipos de cmaras el polo positivo
se identifica con color rojo y el negativo con negro.
13
Gel
La muestra debe colocarse sobre un medio de soporte, con
la finalidad de evitar perturbaciones mecnicas durante la
separacin. El soporte idneo es un gel semislido o gelatinoso, compuesto por polmeros que forman una especie
de malla o microporos tridimensionales a travs de los cuales las molculas avanzan, segn el peso molecular, lo que
permite la separacin por tamao de los diferentes componentes de la muestra. Los geles pueden ser de agarosa
o poliacrilamida. Para la separacin de cidos nucleicos se
usan geles de agarosa o acrilamida y para protenas, slo
de acrilamida.
Geles de agarosa
La agarosa es un polisacrido extrado de algas marinas que
tiene la propiedad de mantenerse en estado slido a temperatura ambiente, que se disuelve con facilidad en temperatura de 50 a 60C, se torna lquida y se solidifica cuando
se enfra formando un gel altamente poroso. El gel de agarosa es la manera ms efectiva de separar fragmentos de
cido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid)
que van de 100 pb a 25 kb. Para elaborar el gel se pesa la
cantidad de agarosa requerida, se disuelve en una solucin
amortiguadora adecuada de la misma composicin y concentracin que el buffer de corrimiento y se calienta hasta
formar una solucin. Sin dejar enfriar, se vaca de forma
inmediata sobre un molde de forma rectangular y en uno
de los extremos se coloca un aditamento en forma de peine
con la finalidad de generar los pocillos u orificios en los que
se colocarn las muestras (figura 13-3). La agarosa posee
ventajas sobre la acrilamida, ya que no es un compuesto
txico y permite realizar el anlisis de cidos nucleicos con
pesos moleculares variados, segn la concentracin de
agarosa que se emplee. Sin embargo, su poder de resolucin es menor que el de los geles de poliacrilamida. La concentracin de agarosa se escoge segn el tamao del cido
nucleico que se vaya a analizar (cuadro 13-1). El tamao de
los poros de la matriz del gel depende de la concentracin
de agarosa utilizada y la concentracin de agarosa es inversamente proporcional al tamao del poro obtenido; esto
es, a mayor concentracin, menor tamao de los poros, y
viceversa, si los poros son pequeos la migracin del cido
nucleico es ms lenta. La figura 13-4 representa la migracin de las molculas de DNA en un gel de agarosa. Durante la electroforesis, los cidos nucleicos lineales con un
peso molecular alto migran al nodo con ms lentitud que
los de menor peso molecular. Esto se debe a que los cidos
118
Cmara de
electroforesis
A)
MIGRACIN DE LA MUESTRA
Gel
Transiluminador
Fuente de poder
B)
100
Buffer
Buffer de carga
1KB
BUFFER
Marcador de peso
molecular
Buffer de corrimiento
MIGRACIN DE LA MUESTRA
nucleicos de peso elevado tardan ms tiempo en atravesar los poros de agarosa. En el caso de cidos nucleicos no
linearizados, como plsmidos circulares (conformacin
nativa), cido ribonucleico (RNA, ribonucleic acid) con
estructuras secundarias o DNA de gran longitud, la migracin no slo depende del peso molecular, sino tambin
del grado de empaquetamiento que presenten. En la electroforesis de un plsmido, por ejemplo, se visualizan tres
conformaciones distintas de la misma molcula: la forma
superenrrollada, la semirrelajada y una relajada. Esto se refleja en tres bandas de tamao diferente, aunque se trate
del mismo plsmido (figura 13-5). Por ello, antes de una
electroforesis es importante la linearizacin y la eliminacin de estructuras secundarias por desnaturalizacin de
la muestra. La concentracin de agarosa ms utilizada para
electroforesis de cidos nucleicos es de 0.5 a dos por ciento.
Geles de acrilamida
La acrilamida es un polmero sinttico, termoestable, incoloro y qumicamente inerte, con el que se pueden generar
Electroforesis
Patrn o
Ladder
Migracin
Muestra
Banda de DNA
Gel
de 19:1. Regulando la concentracin de ambas y su proporcin se consiguen distintas porosidades, siempre menores
que la de los geles de agarosa. Cuando la acrilamida se encuentra en disolucin acuosa experimenta autopolimerizacin de forma espontnea y lenta, con el resultado de
que las molculas de acrilamida se unen cabeza con cola.
En presencia de un sistema generador de radicales libres
se da una polimerizacin vinlica en la cual se activan los
monmeros de acrilamida, quedan en estado de radical
libre y reaccionan rpidamente para formar polmeros de
119
Tamao de banda
0.3
> 700 pb
0.5
700 pb a 25 kb
0.8
500 pb a 15 kb
1.0
250 pb a 12 kb
1.2
150 pb a 6 kb
1.5
80 pb a 4 kb
2.0
100 pb a 3 kb
3.0
500 pb a 1 kb
4.0
100 pb a 500 pb
6.0
10 pb a 100 pb
Muestra
Patrn o
Ladder
Migracin
120
Gel de
empacamiento
Banda de
protenas
Buffer de corrimiento
El buffer de corrimiento es de la misma composicin y pH
que el buffer con el que se prepara el gel de resolucin, ya
sea de agarosa o de acrilamida. ste proporciona el medio
para la transmisin de la corriente elctrica y mantiene el
pH sin variaciones mientras se realiza el corrimiento. En
el caso de los cidos nucleicos, pueden emplearse TBE o TAE
como buffer de corrimiento. El buffer TBE contiene Tris
base, cido brico y EDTA, y se maneja a un pH de 7.2. El
buffer TAE contiene Tris base, cido actico y EDTA, ajustado a pH 8.5. El buffer de corrimiento de electroforesis de
protenas lleva Tris, 25 mM, SDS al 1% y glicina, 192 mM,
a un pH 8.3.
Pares de bases
3.5
1000 a 2000
5.0
80 a 500
8.0
60 a 400
12.0
40 a 200
15.0
25 a 150
20.0
6 a 100
Gel de
resolucin
Electroforesis
12 000
1 353
1 078
872
5 000
603
310
271 281
234
2 000
1 650
194
188
72
1 000
850
650
500
400
300
200
100
Buffer de carga
Este amortiguador tiene como fin brindar peso, densidad
y color a la muestra, lo que facilita su depsito en el pocillo y evita su salida del gel; permite, adems, monitorear el
corrimiento de la muestra en el gel. Se emplea en relacin
1:3 para cidos nucleicos o 1:6 para protenas, respecto a la
cantidad de muestra. El buffer de carga de cidos nucleicos
contiene Tris, azul de bromofenol, azul de xileno y glicerol. Mientras que el buffer de carga para protenas contiene
Tris-HCl, pH 6.8, ditiotritiol (DTT), SDS, glicerol y azul
de bromofenol. En el caso de que se deseen condiciones
reductoras y desnaturalizantes, deber aadirse betamercaptoetanol a este buffer y habr que calentar las muestras
a 95C por cinco minutos.
121
Electroforesis horizontal
Se lleva a cabo con gel de agarosa para cidos nucleicos.
Para el corrimiento el buffer debe cubrir el gel, con la finalidad de evitar que se seque por el calentamiento inducido
por el paso de la corriente elctrica. Al momento de cargar
las muestras en los pocillos, se puede optar por hacerlo en
seco; esto es, llenar parcialmente la cmara con lquido de
corrimiento de tal manera que la parte superior del gel no
se cubra de buffer para que los pocillos puedan llenarse sin
la interferencia del lquido. Una vez cargada la muestra, se
corre por unos minutos a bajo voltaje hasta que la muestra
entre en el gel y entonces se cubre del todo con el buffer de
corrimiento. Tambin existe la tcnica denominada electroforesis submarina, en la que la totalidad del gel se cubre
con buffer de corrimiento, desde el momento de cargar las
muestras en los pocillos, como se ejemplifica en la figura
13-8. En esta tcnica el buffer siempre debe cubrir el gel, y
se llama submarina porque la muestra se coloca con el gel
sumergido en el buffer.
Electroforesis vertical
Empleada de forma exclusiva con gel de poliacrilamida, se
utiliza para protenas o cidos nucleicos de pequeo tamao. El gel debe estar contenido entre dos placas rectangulares de vidrio donde la corriente elctrica se genera gracias
al buffer en el que se encuentra embebido el gel y llena las
cubetas o compartimientos del nodo y el ctodo como se
aprecia en la figura 13-9.
Transiluminador ultravioleta
El transiluminador es un aparato que transmite luz del espectro ultravioleta a travs de la muestra, lo cual excita la
122
Migracin de la muestra
cin requerida.
adecuado.
Buffer interno
Buffer externo
Figura 13-9. Electroforesis vertical. En esta cmara se aprecia cmo el gel de acrilamida ha quedado embebido en el buffer de
corrimiento en su extremo superior gracias a la colocacin de amortiguador en la parte interna de la cmara. El buffer de la parte
externa permite que el polo positivo cuente con la misma solucin buffer que transmita la corriente a la parte inferior del gel.
Electroforesis
123
Mayor intensidad
V
mA
V/A
Mayor tamao
STOP
RUN/PAUSE
VOLTS/AMPER
Menor intensidad
Menor tamao
mezclan con el buffer de carga y se depositan de forma cuidadosa en los pocillos, con lo que se evita que se salgan y
puedan contaminar el pocillo contiguo. Debe considerarse
el uso de un marcador de peso molecular en, por lo menos,
uno de los carriles, para la determinacin del peso molecular de la muestra. Este marcador tambin debe mezclarse
con un buffer de carga, excepto cuando ya viene preparado
para su uso de la casa comercial en que se obtuvo.
Una vez depositadas las muestras en los pocillos, se
procede a la transmisin de la corriente elctrica. Se conectan los cables de la fuente de energa de cada polo elctrico a la cmara de electroforesis en el electrodo que le
corresponda y se aplica un voltaje de acuerdo con el peso
molecular de las molculas de DNA que se va a separar.
Para el caso de productos de PCR (entre 100 pb y 1.5 kb)
se recomienda usar voltajes comprendidos entre 75 y 100
V. Para muestras de DNA genmico y plasmdico (> 2 kb)
se recomienda aplicar valores de entre 25 y 75 V. En la figura 13-11 se aprecia una fuente de energa, con su pantalla,
que indica el amperaje. Es importante que se estandarice el
tiempo de electroforesis a fin de conseguir la mejor resolucin posible.
Durante el corrimiento se monitorea la migracin de
la muestra con colores que contiene el buffer de carga, en
que se observa el color azul y el verde correspondientes
a los colorantes azul de bromofenol y azul de xileno, de
forma respectiva. En geles de agarosa, dentro del rango
124
Electroforesis de protenas
El mtodo ms empleado para electroforesis de protenas
se lleva a cabo en un sistema discontinuo; es decir, un
gel conformado por dos geles de poliacrilamida (uno de
resolucin y otro de compactamiento), que difieren en su
concentracin, composicin y pH. Los geles estn unidos
pero limitados por una fase de separacin visible a contra
luz; para lograrlo, deben prepararse por separado, espe-
A)
B)
Figura 13-12. Visualizacin de fragmentos de DNA. Estas imgenes son de un gel de agarosa donde la muestra fue visualizada por
A) bromuro de etidio y B) colorante de cianina asimtrico (SyberR-Green).
Electroforesis
125
Aplicaciones de la electroforesis
Algunos de los usos de la electroforesis para cidos nucleicos en geles de agarosa son determinar los tamaos moleculares de los cidos nucleicos, analizar los fragmentos
cortados con enzimas de restriccin (mapa de restriccin),
comparar los tamaos de distintos tipos de DNA, aislar y
recuperar fragmentos de DNA purificados para clonaciones moleculares, y analizar productos de PCR, entre otros.
Asimismo, la electroforesis puede ser un proceso previo a
las tcnicas de hibridacin, como el Southern blot (DNA)
o el Northern blot (RNA), en que la presencia de determinada secuencia del cido nucleico en una mezcla de
molculas se distingue por su tamao, la cual se confirma
por hibridacin con una sonda especfica. En el caso de
las protenas, la electroforesis se aplica para la identificacin de fracciones proteicas o protenas particulares por
tamao, como es el caso de la electroforesis de globulinas,
o protenas sricas; pero, sobre todo, para la identificacin de molculas particulares empleando despus una
reaccin antgeno-anticuerpo especfica en la tcnica de
Western blot. Asimismo, la electroforesis es crucial en tcnicas como la secuenciacin, en que, tras un corrimiento
electrofortico de las cuatro reacciones de elongacin con
los dideoxinucletidos (vase el captulo 18), se puede deducir la secuencia del segmento de cido nucleico. Incluso,
los secuenciadores automticos modernos emplean una
electroforesis capilar para el discernimiento de la secuencia. Tambin, los termocicladores en tiempo real basan la
deteccin de los fragmentos amplificados en una electrofo
resis capilar, en que es posible la deteccin inmediata de los
segmentos amplificados y su lectura por el lser correspondiente al flurocromo con que el producto est marcado.
126
Ejercicios de integracin
del carril C?
2. De qu peso molecular es la banda de mayor tamao
del carril D?
3. En qu carril y qu peso molecular presenta la banda
centracin?
enzimas de restriccin, qu carriles contienen aparen
temente la misma muestra. Explique su respuesta?
lecular?
7. Indique el sentido de corrimiento de las muestras con
una flecha.
8. Seale la polaridad correspondiente a cada extremo
del gel.