TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

E CLONAGEM

Homo sapiens: UMA ESPCIE

TECNOLGICA
Antes de compreender j explorava os recursos
naturais.
Explorao da biotecnologia: cultivar plantas, criar
animais, fermentao.
Entender os seres vivos ou parte deles: produtos e
servios.

SERES VIVOS: HEREDITARIEDADE E

VARIAO
Mecanismos desconhecidos.
Cruzamentos experimentais hbridos instveis.

Resultados imprevisveis e instveis.

MENDEL E AS LEIS DA HERANA

Resultados previsveis e estveis.

Manipulao
de
cruzamentos
melhoramento gentico.
Novos estudos e novas aplicaes.

MAIS CONHECIMENTO E MAIS

BIOTECNOLOGIA
Novos conhecimentos e novas aplicaes:
teoria cromossmica da herana; estrutura e
funes do material gentico; tecnologia do
DNA recombinante e engenharia gentica.

 Engenharia Gentica ou Tecnologia do DNA Recombinante

um conjunto de tcnicas que permite aos cientistas identificar,

isolar e multiplicar e expressar genes de quaisquer organismos.

Manipulao gnica feita em ambiente de laboratrio

FERRAMENTAS UTILIZADAS NA
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE.
Clonagem de genes de
interesse para expresso e
produo de protenas
recombinantes: insulina,
hormnio de crescimento
genes de humanos
clonados em bactrias;
Plantas transgnicas;
Animais transgnicos.

PCR;
Bibliotecas genmicas;
Vetores;
Sequenciamento de DNA;
Hibridizao;
Eletroforese.

PRECISA ISOLAR O DNA...MAS DE ONDE

E COMO?
Clonagem dependente
de clulas

Clonagem independente de
clulas (PCR)

Clonagem: obteno de uma grande

quantidade de uma determinada sequencia
de DNA de interesse

CLONAGEM CELULAR

CPIAS IDENTICAS!!

HISTRICO DA TECNOLOGIA DO DNA

RECOMBINANTE (TDR)
1944 - Oswald Avery descobre que o DNA o
componente que transmite as informaes genticas e
que este o principal constituinte dos genes.

R=no virulentas

1928 - Frederick Griffith

S=virulentas

Streptococcus pneumoniae.

Material gentico das bactrias

virulentas (mortas) foi
responsvel pela transformao
das bactrias no virulentas
(vivas)

Da entra Oswald Avery ...

a. A atividade de transformao das clulas S no destruda pelo calor.
b. A atividade de transformao das clulas S no destruda por
proteases ou RNases.
c. A atividade de transformao das clulas S destruda por DNases.

PRINCPIO TRANSFORMANTE

1961 - Franois Jacob e Jacques Monod estudaram o processo de sntese de

protenas nas clulas de bactrias e descobriram que o principal responsvel
por essa sntese o DNA.

1972 - Paul Berg realizou a primeira experincia bem sucedida onde

foram ligadas duas cadeias genticas diferentes: ele ligou uma cadeia
de DNA do fago junto ao operon da galactose de Escherichia coli,
inserindo-os no DNA do vrus SV40.

O grande marco...
Cohen e Boyer (1973)

COHEN E BOYER (1973)

Organismos vivos podem ser portadores de
genes de outros organismos.
Enzimas que clivam e reconstituem
fragmentos de DNA que contm tais genes.
Molculas de DNA de um organismo isoladas
e manipuladas para insero no DNA de outro
organismo.

COMO FAZER UM DNA RECOMBINANTE

Organismo de interesse

Extrao do DNA total

Clivagem do DNA genmico ou PCR
Clonagem dos fragmentos em vetores

Armazenamento dos vetores em hospedeiros

Formao de uma
molcula de DNA
recombinante

CONSTRUO DO DNA RECOMBINANTE

Molcula de DNA de
um plasmdeo circular

Molcula de DNA de um plasmdeo

linear com extremidades coesivas

DNA exgeno

Clivagem com enzima

de restrio

Ligao covalente
pela DNA ligase

Insero em uma clula

hospedeira
Molcula de DNA
plasmidial
contendo o inserto
Transformao

ENZIMAS DE RESTRIO
Protenas que reconhecem e clivam o DNA em pontos
especficos, geralmente em sequncias de 4, 6 e 8 bases palndromas

CARACTERSTICAS
Enzimas de restrio so endonucleases;
Enzimas de bactrias;
Diferentes linhagens de bactrias expressam enzimas de
restrio;
O nome da enzima derivado do nome da linhagem e espcie
bacteriana em que foi isolada;
Cortam (hidrolisam) DNA em fragmentos definidos e
reproduzveis;
Ferramenta bsica em clonagem de genes.

NOMENCLATURA
As enzimas de restrio so chamadas de acordo com a bactria
que a produziu
Exemplo: EcoR I
Ordem de
descoberta

Gnero
Espcie

Escherichia

coli

Estirpe

RY 13

1 enzima a ser
descoberta nesta
bactria

E ASSIM RECOMBINO DNA

DOIS TIPOS DE CORTES

EXISTEM VRIAS ENZIMAS

ELETROFORESE

VAMOS VER SE EU APRENDI.

DNA GENMICO DIFERENTEMILHARES,

BILHES DE PARES DE BASES

CLONAGEM DEPENDENTE DE CLULAS VIVAS

CLONAGEM DE FRAGMENTOS DE DNA

Ferramentas de clonagem:
Enzimas:

enzimas de restrio
DNA ligase

Vetores:

plasmdios
fagos (vrus de bactrias)
cosmdeos
cromossomos artificiais
vrus

Hospedeiros:

E. coli
levedura
clulas animais
clulas vegetais

Tecnologia do DNA recombinante: construo de uma

molcula de DNA recombinante

DNA quimera
Fragmentos de DNA ligados a um vetor de clonagem

(DNA recombinante)

Vetores de clonagem - multiplicam molculas de

DNA recombinante (clones) em organismos vivos,
gerando quantidades abundantes de clones

VETORES DE CLONAGEM
Gene de interesse cortado
usando enzimas de restrio

Inserto: fragmento do DNA alvo a

ser usado para a construo da
molcula de DNA recombinante

Quatro tipos de vetores para clonagem podem ser usados, dependendo do

tamanho do inserto:

Plasmdeo - 0,1 a 10 Kb
Ex: pBR322; pUC; pGEM; pBluescript; pET
Fago lambda - ~0,1 a 20 Kb
Cosmdeo - ~35 a 50 kb
Cromossomos artificiais de bactrias e leveduras - fragmentos maiores
(BAC - ~100 kpb e YAC 2 Mpb)

PLASMDIOS E VETOR DE CLONAGEM

cromossomo

plasmdeos

Diviso celular

cromossomo

plasmdeos

ocorrem naturalmente em algumas bactrias;

so molculas de DNA dupla fita e circular;
muitas vezes carregam genes para resistncia a antibiticos;
replicao independente da replicao cromossmica
(apresentam uma origem de replicao independente).

PLASMDEOS COMO VETORES DE

CLONAGEM
Plasmdeos podem ser modificados para carregar novos
genes
devem apresentar origem de replicao;

devem apresentar um gene para seleo (gene para resistncia a

antibitico);
devem apresentar mltiplos stios de clonagem (poli-linker)

VETORES DE CLONAGEM: PRINCIPAIS

CARACTERSTICAS
Origem de replicao
Permite a auto-replicao, independente
do cromossomo

Genes para resistncia a

antibiticos
Permite que a clula hospedeira cresa
em meio seletivo

Mltiplos stios de clonagem

Permite a insero de DNA exgeno

VETORES DE CLONAGEM
Poli-linker (stio mltiplo de clonagem)

EcoRI

EcoRI

DNA de interesse
EcoRI

Plasmdeo

Extremidades coesivas
Ligao

DNA recombinante

Escherichia coli

Unicelular, na forma de basto;

Cresce rapidamente a 37oC ;
ciclo de 20 min

Uma gerao: 20 minutos

Pouco exigente quanto a nutrio;

Meio mnimo ou rico:
Glicose - melhor fonte de C
Extrato de levedura - vitaminas
Triptona e Peptona: fonte aminocidos

PROGRESSO GEOMTRICA DO CRESCIMENTO

POPULACIONAL BACTERIANO
Uma gerao: 20 minutos

Curva de crescimento

BACTRIAS PARA TRANSFORMAO

No apresentam DNA plasmidial

Precisam ser preparadas

Tornar-se competentes = aptas a receberem a molcula

de DNA recombinante

CLULAS COMPETENTES
INCOMPETENTE!!!

Uma bactria diz-se competente quando tem a capacidade de aceitar DNA estranho.

INSERO DO DNA DENTRO DA CLULA

BACTERIANA O HOSPEDEIRO

Transformao qumica
Eletroporao

TRANSFORMAO QUMICA

Incubar 30 min
no gelo

Molculas de DNA
recombinante
Suspenso de clulas
competentes

Choque trmico
(42C/30 s)

TRANSFORMAO QUMICA

Mecanismo molecular proposto

para explicar a transformao de
E. coli com uma molcula de DNA
exgeno.

Mandel e Higa, 1970

ELETROPORAO
Pulso eltrico

Cuveta
Eletroporador

Suspenso de clulas

Eletrodo

Eletrodo

SELEO DE CLONES RECOMBINANTES

Construo

Clones recombinantes
Transformao

Clula de E.coli

Meio seletivo
Ex: Meio com antibitico (ampicilina)

MC + ampicilina

Clulas transformadas
Clones resistentes a ampicilina

Clulas controle (no transformadas)

Clones sensveis a ampicilina

SELEO DE CLONES RECOMBINANTES

MC+X-gal+ampicilina

Perodo de incubao
12-16h / 37C)

*MC = Meio de cultura

SELEO DE CLONES RECOMBINANTES

Podem ser tambm utilizados marcadores que so inativados com a
insero do DNA estranho no plasmdio.
Exemplo: sistema de diferenciao branco-azul
Plasmdios da srie pUC possuem um gene (gene lacZ) que codifica a
produo da enzima -galactosidase. A insero do DNA estranho no stio
de clonagem do plasmdeo causa a interrupo do gene, levando perda
da funo da -galactosidase.
Como resultado:

colnias brancas (-gal inativa) - positivas (com inserto)

colnias azuis (-gal ativa) - negativas (sem inserto)

SELEO DE CLONES RECOMBINANTES

pUC8
Gene de resistncia
ampicilina

Vieira & Messing,

1982
Stio mltiplo de
clonagem

Produo da enzima -galactosidase

No h produo da enzima galactosidase

X-gal clivado = colnia azul

gar + ampicilina + X-gal

X-gal no clivado = colnia

branca

Gene lacZ = codifica a enzima -galactosidase

Quais colnias nos

interessam e por qu?

POSSVEIS RESULTADOS APS A ETAPA DE TRANSFORMAO

Clula bacteriana

DNA cromossomal

Inserto
Amp.

MC+X-gal+amp

Plasmdeo com inserto

Amp.

MC+X-gal+amp

MC+X-gal+amp

Plasmdeo sem inserto

Sem plasmdeo

Resistncia ampicilina Resistncia ampicilina Sem resistncia ampicilina

LacZ no funcional

LacZ funcional

Sem gene LacZ

Colnias brancas

Colnias azuis

Sem crescimento

*MC = Meio de cultura

1.

CLONAGEM MOLECULAR

2.

RESUMO DAS ETAPAS:

1. Preparao do vetor e do inserto

2. Ligao do vetor e inserto

3.
4.

3. Transformao em clula hospedeira

4. Seleo de clones
Animao: https://www.youtube.com/watch?v=PmM6jQ2wl5A

CLONAGEM INDEPENDENTE DE CLULAS VIVAS

PCR

REAO DE PCR

H2O + tampo

primers

DNA molde

A T C G
nucleotdeos
DNA polimerase

Thermus aquaticus
Thermus aquaticus uma espcie
de bactria que pode suportar
temperaturas elevadas, uma de
vrias bactrias termfilas. Esta a
fonte da enzimas resistente ao calor
como a Taq polimerase de DNA , um
dos mais importantes enzimas
na biologia molecular devido sua
utilizao na reao em cadeia da
polimerase (PCR), tcnica de
amplificao de DNA.

A bactria foi descoberta pela primeira vez

no Lower Geyser Basin do Parque Nacional de
Yellowstone

Thermus aquaticus

Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B.

Mullis, and H. A. Erlich. "Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a
Thermostable DNA Polymerase." Science 239 (1988): 487-491.

Step 1 desnaturao
1 minuto 94oC

Step 2 anelamento
45 segundos 55oC

Step 3 extenso
45 segundos 72oC

A AMPLIFICAO EXPONENCIAL!!
4o ciclo
Gene desejado

2o ciclo

1o ciclo

35 ciclos

DNA Molde

4 cpias

8 cpias

16 cpias

32 cpias

60 bilhes de cpias

TERMOCICLADOR

Por que clonar genes???

Para o sequenciamento do DNA

Separar fragmentos de DNA em clones independentes

Estudar a transcrio e traduo de genes

Estudar a expresso funcional de genes

Sintetizar de protenas para produo de anticorpos
Sintetizar protenas para uso teraputico
Produo de vacinas recombinantes
Etc..etc..etc...

International Rice Research Institute (IRRI)

The Golden Rice Story

Deficincia em vitamina A
um problema importante de
sade pblica
Causa cegueira
Influencia na severidade de diarrias e sarampo

>100 milhes de crianas tem este problema

Para muitos pases a infra-estrutura no existe para entregar
plulas de vitaminas
Melhorar o contedo de vitamina A em cereais parece uma
alternativa atrativa

Via do -Caroteno em Plantas

isopentenyl diphosphate

Geranylgeranyl diphosphate
Phytoene synthase

Phytoene
Problema:
Arroz faltam
estas enzimas

Phytoene desaturase
-carotene desaturase

Lycopene
Lycopene-beta-cyclase
Normal
Vitamin A
Deficiente
arroz

-carotene
(precursor de vitamina A)

The Golden Rice Solution

Adicionar os genes da via do -Caroteno
IPP

Geranylgeranyl diphosphate
Daffodil gene

Phytoene synthase

Phytoene
via
Vitamina A
est completo
e funcional

1Gene de bactria;
Realiza as duas funes

Phytoene desaturase
-carotene desaturase

Lycopene
Daffodil gene
Golden
Rice

Lycopene-beta-cyclase

-carotene
(precursor de vitamina A)

Flavr Savr (Calgene)

O tomate Flavr Savr, foi desenvolvido pela Calgene, uma companhia de
biotecnologia com base em Davis, na Califrnia. Vrios anos se passaram
at que o FDA aprovasse o transgnico. O FDA no exige aprovao, no
entanto a Calgene submeteu voluntariamente o Flavr Savr para aprovao
em 1989. Em 1994, o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos
aprovou que este no apresentava risco ao ambiente.

Flavr Savr (Calgene)

Tomate transgnico

O tomate transgnico
amadurece na planta,
ficando com mais sabor.
Mantm-se firme aps a
colheita.

Tomate tradicional

O tomate tradicional
vaporizado com
etileno para induzir a
maturao.

SUPERMERCADO

O tomate tradicional
tem de ser colhido
verde, para no ser
esmagado durante o
transporte.

Flavr Savr
Gene que amolece o
tomate (poligalacturonase)

DNA

Gene Flavr Savr

RNA mensageiro

RNA inativado

ESTUDO DIRIGIDO
1. Principio da Tecnologia do DNA recombinante
2. Enzimas de restrio
3. Eletroforese
4. O que um vetor de clonagem?
5. Quais as caractersticas de um vetor de clonagem?
6. Qual a diferena entre plasmdeo e vetor de clonagem?

7. O que transformao bacteriana? Qual o princpio? Quais as aplicaes?

8. Como se faz a seleo de uma bactria transformada?
9. O que a PCR?

Aula cedida, com modificaes:

Profa. Maria Carolina Quecine
Departamento de Gentica