Protocolo Perã Xidos Patricia Bromatologã-A

GRADO EN CIENCIA Y TECNOLOGA
DE LOS ALIMENTOS
PRACTICAS DE ACEITES Y GRASAS
(LABORATORIO - PLANTA PILOTO)
1. RENDIMIENTO GRASO DE ACEITUNA (ANALIZADOR ABENCOR)

2. INDICE DE MADUREZ DE ACEITUNAS
3. RIQUEZA GRASA (METODO SOXHLET)
4. GRADO DE ACIDEZ ACIDEZ LIBRE
5. INDICE DE PEROXIDOS
6. MEDIDA ESPECTOFOTOMETRICA EN EL UV
7. ANLISIS DE ESTERES METILICOS DE LOS ACIDOS GRASOS POR
CROMATOGRAFA DE GASES
8. ESTABILIDAD OXIDATIVA DE UNA GRASA (METODO RANCIMAT)
9. DETERMINACIN DE COMPUESTOS POLARES EN GRASAS
10. DETERMINACION DE ALFA-TOCOFEROL EN ACEITES
Prcticas de Aceites y Aceites Grado en CTA -UCLM
1. RENDIMIENTO GRASO DE ACEITUNA (Analizador ABENCOR)
INTRODUCCIN
El analizador Abencor es un sistema de laboratorio de la casa comercial Abengoa, que
consta de tres elementos bsicos construidos en acero inoxidable: molino,
termobatidora y centrfuga de pastas, y de otros elementos auxiliares como balanza,
probetas de 500 mL, termo para agua caliente y resistencia de inmersin.
El molino de martillos, constituido en acero inoxidable, est accionado por un motor
de 1,5 KW a 3000 rpm. Est dotado de un juego de tamices intercambiables que
permiten obtener diferentes grados de molienda. Tambin dispone de una bandeja de
recepcin de la pasta de aceituna molida.
La termobatidora tiene forma circular y capacidad para batir 8 muestras a la vez. En su
parte inferior lleva un bao de agua caliente donde se alojan los jarros de acero
inoxidable destinados a recibir la pasta. La temperatura est regulada mediante un
termostato. Las paletas batidoras, accionadas desde la parte superior por un motor,
giran a 50 r.p.m. Estas paletas, tambin de acero inoxidable, van dotadas de un
mecanismo que permite manipular las muestras de forma independiente, es decir se
puede parar el batido de una o varias muestras sin que dejen de batirse las dems).
La centrfuga es de tipo cesta y est constituida por un recipiente que gira a 3500 rpm
dentro de una carcasa, ambas de acero inoxidable, con un orificio en la parte inferior
para la salida de los lquidos. El sistema est accionado por un motor de 1,5 KW y va
montado sobre un chasis de acero.
FUNDAMENTO
El procedimiento que se sigue para la extraccin del aceite en el analizador Abencor
presenta importantes similitudes con el que se desarrolla a escala industrial en los
sistemas de centrifugacin industrial de las almazaras convencionales. Se distinguen en
el proceso cuatro etapas bsicas: molienda de la aceituna, termobatido de la pasta,
centrifugacin y decantacin. Estas operaciones permiten que se pueda prever el
comportamiento de las pastas a nivel industrial.
Una vez extrado el aceite y decantado en una probeta de cristal se puede medir el
volumen obtenido y determinar el rendimiento graso de las aceitunas de las que
procede.
Como el aceite obtenido no sufre ningn deterioro (como ocurre en los mtodos que
emplean disolventes para la extraccin), se puede utilizar, previamente filtrado, para
determinar en l parmetros de calidad como por ejemplo el grado de acidez, asi como
A. Salvador Moya, Facultad de Ciencia y Tecnologas Qumicas, UCLM
apreciar sus caractersticas organolpticas y someterlo a cuantos anlisis de control de

calidad se consideren necesarios.
MATERIAL Y REACTIVOS
Analizador ABENCOR completo (molino de martillos, termobatidora y centrfuga de
pastas con paleta de descarga)
Balanza con sensibilidad de 1g
Termo de acero inoxidable para conservar el agua caliente
Resistencia de inmersin
Probeta de 250 mL
Probetas de 500 mL
Cronmetro
Bomba peristltica pequea para transvasar el aceite
Microtalco natural (MTN)
PROCEDIMIENTO
Se muele 1 Kg de aceitunas como mnimo, ya que una parte de la muestra se puede
utilizar para arrastrar los restos de pasta que hayan quedado en el molino de la
muestra anterior y se desprecia.
Una vez recogida la pasta en la bandeja, se homogeneiza con la ayuda de una paleta
para mezclar los trozos de hueso y piel con la pulpa, pero sin llegar a producir la
separacin de aceite.
Seguidamente se tara el jarro de acero inoxidable y se pesan entre 500 a 700 gramos
de pasta. Se puede eventualmente aadir agua si la pasta est muy seca debido
principalmente a condiciones climatolgicas adversas durante la campaa. A
continuacin se pone a batir el cazo con la muestra durante 20 minutos, procurando
que la pasta est a 25 C (se puede controlar la temperatura del bao si se desea). En
esta fase se debe observar el comportamiento de la pasta de aceituna al batido para
determinar si es una pasta difcil y por lo tanto debe ser tratada con talco o no. Si la
pasta se comporta de forma normal, a los 20 minutos de batido se le aade agua
caliente (80-90 C) hasta un mximo de 300 mL. Despus se deja la pasta batiendo
durante 10 minutos ms.
Una vez terminado el batido, se vierte el jarro en la centrfuga, con el orificio de salida
tapado, y se pone la centrfuga en marcha. Con la centrfuga en marcha, se quita el
tapn del orificio de salida. La centrifugacin se realiza de forma automtica durante
1-2 minutos, recogindose las corrientes lquidas por la parte inferior en una probeta
graduada de 500 mL.
A continuacin se tapa el orificio de salida, se aaden 100 mL de agua caliente y se
somete de nuevo la pasta a una segunda centrifugacin con objeto de arrastrar el
2
aceite que ha quedado en la parte exterior del anillo de pasta que se ha formado, no
olvidando quitar el tapn de salida cuando la centrfuga est an en marcha.
Una vez recogido el lquido de la segunda centrifugacin, se deja la probeta decantar
durante 10 minutos como mnimo, segn las caractersticas de la muestra. Cuando el
aceite ha decantado y se ha separado claramente del alpechn, se mide el volumen (en
mL) del aceite obtenido que hay en la probeta. La lectura del volumen para una
cantidad de pasta de aceituna de partida batida permite, a travs de las tablas
suministradas por el fabricante, obtener la medida del rendimiento graso de la
aceituna procesada.
A continuacin se transvasa el aceite de oliva virgen obtenido con ayuda de una
pequea bomba peristltica y se filtra a travs de papel jarabe y de sulfato sdico
anhidro para la evaluacin de los parmetros normalizados de calidad en el producto.
CLCULOS
El rendimiento graso de la aceituna se calcula aplicando la frmula siguiente:
Rendimiento % = 91,5 V / P
Siendo:
V, volumen de aceite ledo en la probeta en mililitros;
P, cantidad de pasta de aceituna que hemos pesado en el jarro en gramos.
PASTAS DIFCILES
Ciertos tipos de aceitunas presentan dificultades tcnicas para la extraccin en la
elaboracin del aceite, y con este sistema de anlisis (Abencor) donde se puede
observar el comportamiento de las pastas en la industria.
Las pastas difciles se detectan por una persona experta en el momento de la
molienda, pero donde mayormente demuestran su dificultad es en la etapa del batido,
cuando no se separa el aceite del resto de la pasta y llega a emulsionarse con el agua.
Se reconoce la presencia de una pasta difcil en un sistema de centrifugacin por
alguna de las siguientes circunstancias:
1. La molienda da como resultado una pasta fluida, en la que los trozos de hueso
estn prcticamente sueltos de la pulpa correspondiente.
2. Durante el batido no se consigue la separacin de aceite suelto y las paletas
de la batidora salen sucias, impregnadas de trozos de masa. En muchos casos,
el color de la pasta no vara, conservando una tonalidad morada.
3. El aceite obtenido por decantacin est sucio, emulsionado y con tono
violceo.
4. Los orujos del procesado tienen un contenido anormalmente alto en grasa.
Despus de haber ensayado y estudiado un gran nmero de productos que

tcnicamente se podran aadir para eliminar la dificultad que presentan estas pastas
difciles sin afectar a las caractersticas fisicoqumicas ni a los caracteres organolpticos
del aceite, se ha llegado a la conclusin de que el producto con que se pueden
conseguir los mejores resultados es el microtalco natural (MTN), aadido durante el
batido tanto en sistemas continuos de elaboracin como en el analizador Abencor. Con
este tratamiento se obtiene una mejor separacin del aceite en el batido, una mayor
adherencia de los slidos en la centrfuga y una mejor decantacin.
La cantidad de talco a aadir en los jarros de la termobatidora, depende de la
dificultad de la pasta. Para obtener la cantidad adecuada deben realizarse un ensayo
previo utilizando cantidades crecientes de talco para una misma masa de aceituna.
Como punto de partida puede considerarse que generalmente se obtienen buenos
resultados con las siguientes cantidades:
10 g de talco para 600 g de pasta de aceituna en pastas medianamente

difciles (1,6%)
20 g de talco para 600 g de pasta de aceituna en pastas de dificultad
considerable (3,3%),
pudiendo llegar a aadirse ms talco si fuese necesario, pero siempre ensayando

muestras de 10 en 10 g de MTN sobre la pasta de aceituna.
REFERENCIAS
MARTINEZ, J.M.; MUOZ, E.; ALBA, J. Y LANZN, A. (1975). Informe sobre utilizacin
del Analizador de Rendimientos "Abencor". Grasas y Aceites, 26(6), 379-385.
2. NDICE DE MADUREZ DE ACEITUNAS

El ndice de madurez de las aceitunas se determina segn el mtodo propuesto por el
Consejo Olecola Internacional ( C.O I., 1984).
El procedimiento seguido consiste en tomar por azar una muestra de 100 aceitunas y
clasificarlas en 8 grupos diferentes atendiendo a sus caractersticas cromticas con
ayuda de una escala.
Los grupos empleados en la distribucin de las muestras son los siguientes:
Grupo 0. Piel verde intensa.
Grupo 1. Piel verde amarillenta.
Grupo 2. Piel verde con manchas rojizas (inicio del envero)
Grupo 3. Piel rojiza o morada (terminacin del envero)
Grupo 4. Piel negra con pulpa blanca.
Grupo 5. Piel negra con menos de la mitad de la pulpa morada.
Grupo 6. Piel negra con la mitad o menos de la pulpa blanca.
Grupo 7. Piel negra con toda la pulpa morada.
Posteriormente se cuentan las aceitunas incluidas en cada uno de los grupos y, para el
clculo del ndice de madurez, se aplica la frmula:
A0 + B1 + C2 + D3 + E4 + F5 + G6 + H7
I.M. =
100
siendo A, B, C, D, E, F, G y H el nmero de frutos integrados en los grupos 0 a 7.

La determinacin se realiza por triplicado y el ndice de madurez de las aceitunas se
calcula como la media de tres determinaciones.
3. RIQUEZA GRASA (METODO SOXHLET)

El mtodo Soxhlet se aplica para conocer el contenido graso de las semillas
oleaginosas. Si se considera necesario pueden realizarse diversas operaciones previas
como el descascarillado descascarado, la trituracin y la desecacin del fruto de la
semilla en funcin de las caractersticas de la materia prima.
Las materias primas utilizadas para la realizacin de esta prctica pueden ser:
almendra, cacahuete, pepitas de girasol, semillas de ssamo, pasta de aceituna y orujo.
El orujo es el subproducto slido obtenido en la extraccin del aceite de oliva.
Contiene la mayor parte de los slidos que se encuentran en la aceituna, adems de
una cierta cantidad de aceite y agua que depende del sistema de extraccin. En los
sistemas de presin, la humedad es del 24-28 % y el contenido graso del 5-9 %. En los
sistemas de extraccin por centrifugacin, la humedad suele tener valores
comprendidos entre el 40-55 % y el contenido graso vara del 2 al 5 %. Debido a esta
diferencia de humedad y contenido graso se aconseja referir siempre el contenido
graso a materia seca. El valor comercial de los orujos depende, principalmente, de la
humedad y del contenido graso en hmedo. Lgicamente, el contenido graso
revaloriza los orujos mientras que una alta humedad los deprecia, ya que exige un
mayor gasto en el transporte y en el secado.
El mtodo Soxhlet es el nico normalizado para determinar la riqueza grasa total en las
semillas oleaginosas, la pasta de aceituna y en orujos. Para la extraccin de la grasa de
un orujo o pasta de aceituna siguiendo este mtodo, es necesario eliminar
previamente el agua, hasta desecacin total de la muestra, de esta forma se dispone
tambin del dato de humedad en la muestra de semilla oleaginosa.
DESCRIPCIN DEL SISTEMA SOXHLET

El sistema de extraccin Soxhlet consta de tres elementos de vidrio y una fuente de
calor, insertados segn se muestra en la figura adjunta.
Matraz esfrico de fondo plano y boca esmerilada. En l se ha de recoger la
grasa que se extrae de la semilla, pasta u orujo que se va a analizar.
Cuerpo del extractor. Aqu se introduce la muestra previamente secada y
envuelta en un papel de filtro o bien dentro de un cartucho de extraccin.
Refrigerante de reflujo con entrada y salida de agua. Condensa el disolvente
que se evapora y lo conduce al interior del cuerpo del extractor.
El cuerpo del extractor est cerrado por su base, quedando con ello sin una
comunicacin directa con el matraz de fondo plano, aunque existen dos pequeos
tubos: uno que conduce el disolvente evaporado desde el matraz de fondo plano hasta
el refrigerante de reflujo y otro que desempea el papel de sifn y que conduce el
disolvente condensado ms la grasa extrada desde el cuerpo del extractor hasta el

matraz de fondo plano.
Esquema del Extractor Soxhlet
Refrigerante
Cuerpo del
extractor
Cartucho de celulosa
+ Muestra
Eter
Sistema de sifn
Matraz
Eter +
Extracto
FUNDAMENTO
La semilla oleaginosa, el orujo o la pasta de aceituna desecada, se pone en contacto
con un disolvente orgnico que produce la extraccin de la grasa, generalmente ter
de petrleo hexano. Esta disolucin se renueva varias veces durante el tiempo que
dura la extraccin con disolvente limpio que vuelve a caer de nuevo sobre la muestra
tras su condensacin en el refrigerante. La fraccin recogida es sometida a calefaccin
para eliminar el disolvente residual, quedando en el matraz solamente la grasa
extrada de la semilla oleaginosa, el orujo o la pasta de aceituna.
Balanza analtica
Estufa de desecacin por aire
Cpsula de fondo plano de 80 mm de dimetro
Esptulas de acero inoxidable
Desecador
Extractor Soxhlet completo
Cartuchos de extraccin de pasta de celulosa ( papel de filtro)
Algodn
Placa calefactora o bao de agua
Mortero
n-Hexano (tambin puede utilizarse ter de petrleo ter etlico)
Regulador de ebullicin (plato poroso, piedra pmez o perlitas de vidrio)
PROCEDIMIENTO
Se pesan en una cpsula seca, previamente tarada, 50-60 gramos de semilla oleaginosa
triturada de pasta de aceituna. Se introduce la cpsula con la muestra en la estufa de
aire forzado, mantenindola a 105 C durante 8 horas, para que la desecacin sea total
(para el orujo se procede de igual forma).
Se deja enfriar la muestra en el desecador y se pesa para determinar el agua perdida,
obteniendo por diferencia de peso el porcentaje de humedad de la muestra.
Disgregar el producto desecado con un mortero y pesar unos 20 g en un cartucho de
extraccin y taparlo con un poco de algodn.
Colocar el cartucho en el cuerpo del extractor cuidando que el envoltorio quede ms
bajo que el nivel superior del sifn.
Acoplar al cuerpo extractor con el cartucho un matraz esfrico de fondo plano con
regulador de ebullicin (plato poroso piedra pmez), previamente secado en estufa
durante 1 hora y tarado.
Aadir disolvente por la parte superior del extractor (ter de petrleo, ter etlico o
hexano), hasta hacerlo sifonar y volver a aadir hasta la mitad del cuerpo extractor
aproximadamente para asegurarse que hay suficiente cantidad de disolvente en el
equipo durante la extraccin.
Acoplar el refrigerante al cuerpo del extractor. El conjunto se sujeta a un soporte de
manera que el matraz descanse sobre el foco de calefaccin. Si el foco de calefaccin
es un bao de agua, se tendr cuidado de que el agua no sobrepase las tres cuartas
partes del matraz.
Se abre el paso de agua para la alimentacin del refrigerante, regulando el caudal para
que la refrigeracin sea adecuada. Despus se enciende el foco calefactor, con lo que
comienza la evaporacin del disolvente.
La grasa se extrae durante 6 horas a una velocidad aproximada de 1 ciclo de llenado
cada 5 minutos. Al cabo de este tiempo, comprobar que el disolvente del cuerpo
central de extraccin no presenta coloracin (si la tuviese se deja extraer durante una
hora ms).
Una vez hecha la extraccin, se apaga el foco calefactor, se espera a que se enfre el
extractor y se saca el cartucho con ayuda de unas pinzas.
El matraz con el cuerpo extractor y el refrigerante, se vuelve a poner en el foco
calefactor, hasta que la totalidad del disolvente pasa al cuerpo extractor. Despus se
retira el matraz con la grasa extrada, y se mantiene en estufa a 100 C durante 1 hora
para eliminar los restos de disolvente que puedan haber quedado. La eliminacin del
disolvente puede comprobarse por la ausencia de olor a disolvente en el matraz.
CLCULOS
La humedad de la muestra, en tanto por ciento, se calcula mediante la frmula:
Humedad % = 100 P2 / P1
siendo:
P1: peso de pasta de aceituna u orujo (hmedo) en gramos
P2: prdida de humedad en gramos
Riqueza grasa referida a materia seca, en tanto por ciento, se calcula mediante la
frmula:
RGMS % = 100 (Pmt + g - Pmt) / PMS
siendo:
10
Pmt+g : peso del matraz con la grasa extrada en gramos

Pmt : peso del matraz seco y vaco en gramos
PMS: peso de muestra seca empleado en la extraccin en gramos
La riqueza grasa, referida a la muestra original hmeda, en tanto por ciento, se calcula
mediante la frmula:
RG% = (100 - Humedad%)
RGMS%
100
siendo:
Humedad % : humedad expresada en tanto por ciento
RGMS % : riqueza grasa referida a materia seca, en tanto por ciento
REFERENCIAS
Norma Espaola UNE 55-032 (AENOR)
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4. GRADO DE ACIDEZ O ACIDEZ LIBRE

INTRODUCCIN
El grado de acidez o acidez libre es un ndice fisicoqumico de los aceites y grasas
comestibles que expresa el contenido en tanto por ciento de cidos grasos libres.
Normalmente se expresa referido a cido oleico y slo en casos particulares, segn la
naturaleza de la sustancia grasa, se expresa referido a cido palmtico, laurico u otros.
Otra forma de expresar el contenido en cidos grasos libres es mediante el ndice de
acidez, que es el peso, en mg, de hidrxido potsico necesario para neutralizar un
gramo de materia grasa.
La grasa sintetizada biolgicamente es neutra, por lo que la presencia de cidos grasos
libres es una anomala, resultante de un mal estado de los frutos, de un proceso
incorrecto de elaboracin o bien de una mala conservacin. Los cidos grasos se
liberan por hidrlisis (ruptura) de los enlaces ster de los triglicridos segn la
reaccin:
CH2OOR
CH2OH
+ 3 H2 O
CHOO
CH2OOR
AGUA
TRIGLICRIDO
CHOH
CH2OH
+ 3 ROOH
ACS. GRASOS
GLICERINA
En funcin de su acidez, comercialmente el aceite de oliva virgen se clasifica en las

siguientes categoras (Reglamento CEE 61/2011):
Virgen extra
0,8%
Virgen
2,0%
Virgen lampante
2,0%
FUNDAMENTO
Los cidos grasos de una muestra de aceite comestible se determinan mediante una
valoracin cido-base. La reaccin que tiene lugar es:
ROOH
CIDO
KOH
BASE
ROO- K+ +
SAL
H2 O
AGUA
Detectndose el punto final de la valoracin por el viraje del indicador fenolftalena.

Balanza analtica
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Bureta de 10 mL con graduacin de 0,05 mL

Erlenmeyer de 250 mL
Probetas de 500 y 50 mL
Pipetas Pasteur
Pera de goma
Mezcla ter etlico-etanol 96 para anlisis 1:1 (v/v)
Disolucin de fenolftalena en etanol al 1%
Disolucin de hidrxido potsico en etanol 0,1 N ( 0,5 N para aceites de elevada
acidez)
Biftalato potsico (patrn primario)
PROCEDIMIENTO ANALTICO
Cuando el contenido total en humedad e impurezas en la muestra sea superior al 1%,
sta deber filtrarse previamente.
Se pesan, con una precisin de 0,01 g, unos 10 g de muestra en un matraz erlenmeyer
de 250 mL (esta cantidad debe ser ms baja cuando la acidez de la muestra sea mayor
de 4).
Se disuelve la grasa con 50-100 mL de la mezcla ter dietlico-etanol 96 1:1 (v/v)
neutralizada exactamente en el momento de su uso con la solucin etanlica de
hidrxido potsico 0,1 N en presencia de 0,3 mL de la solucin de fenolftalena al 1%
por cada 100 mL de mezcla.
Valorar, agitando, con la disolucin etanlica de hidrxido potsico 0,1 N hasta que el
color rosa dbil de la fenolftalena permanezca al menos durante 10 segundos.
Notas:
Si la disolucin se enturbia durante la valoracin, aadir una cantidad suficiente de
la mezcla neutralizada ter dietlico-etanol 96 1:1 (v/v) para que la solucin se
aclare.
Si el volumen de disolucin etanlica de hidrxido potsico 0,1 N consumido en la
valoracin es superior a 10 mL, debe utilizarse una disolucin 0,5 N.
CLCULOS
El grado de acidez o Acidez Libre, expresado en porcentaje de cido oleico, se calcula
mediante la expresin:
GA (% c. oleico) = 28,2 V N / P
siendo:
V, volumen (en mL) de disolucin etanlica de KOH gastado;
N, concentracin exacta (eq/l) de la disolucin de KOH;
P, peso en gramos de aceite.
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El ndice de acidez, expresado en mg de KOH necesarios para neutralizar 1 g de aceite

se puede calcular por las siguientes expresiones:
IA (mg KOH/g aceite) = 56,11 V N / P
IA (mg KOH/g aceite) = GA 1,99
PREPARACIN DE REACTIVOS
Mezcla ter dietlico-etanol 96 1:1 (v/v)
Se prepara 1 litro mezclando 0,5 l de ter dietlico P.A. con 0,5 l de etanol de 96 P.A.
Para ello puede utilizarse una probeta de 500 mL.
Disolucin etanlica de hidrxido potsico 0,1 N
Se puede preparar 1 litro disolviendo 7 g de KOH P.A. del 85 % de riqueza en 1 litro de
etanol de 96 P.A. ayudndonos con un bao de ultrasonidos o calentando a reflujo.
Esta disolucin debe dejarse reposar unos das y separar por decantacin el lquido
claro sobrenadante del precipitado que sedimenta en el fondo. Su aspecto debe ser
transparente incoloro a amarillo paja. Se debe conservar en un frasco de vidrio topacio
bien cerrado. Existen disoluciones comerciales listas para su uso.
Esta disolucin es inestable, por lo que vara su concentracin con el tiempo. Se
recomienda determinar su concentracin exacta inmediatamente antes de su
utilizacin contrastndola con un patrn primario (por ejemplo cido oxlico, biftalato
potsico o cido benzoico). Si se utiliza biftalato potsico, se pesan unos 0,2 g con
precisin de 0,0001 g en un matraz erlenmeyer de 100 mL, se disuelven con agua
destilada hervida o pasada por ultrasonidos, se ponen 2 gotas de fenolftalena como
indicador y se anota el volumen de solucin etanlica de KOH que se consume hasta
que el indicador vira. La concentracin real de la solucin etanlica de KOH se calcula
mediante la expresin:
N = P 1000 / (204,23 V)
Siendo:
N, concentracin exacta (eq/L) de la solucin etanlica de KOH;
P, peso en gramos de biftalato potsico que hemos disuelto;
V, volumen (mL) de solucin etanlica de KOH que se ha consumido hasta viraje del
indicador.
El factor de correccin de concentracin por el que tendremos que multiplicar la
concentracin terica (0,1 N 0,5 N) es:
F= N / Nterica
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ya que
N = Nterica F
Donde:
F, factor de correccin de concentracin;
N, concentracin real (eq/L) de la solucin etanlica de KOH;
Nteorica, concentracin terica (eq/L) de la solucin etanlica de KOH (ser 0,1 0,5
eq/L).
Disolucin de fenolftalena en etanol al 1%
Se disuelven 2,5 g de fenolftalena con etanol de 96 P.A. en un vaso de precipitados
de 100 mL, poniendo la disolucin en un matraz aforado de 250 mL. Se enjuaga el vaso
con pequeas adiciones del mismo etanol, recogindolas tambin en el matraz
aforado de 250 mL. Finalmente se enrasa el matraz y se agita su contenido.
EJEMPLOS
1. Determinar la concentracin exacta de una disolucin de KOH 0,1 N utilizando
biftalato potsico como patrn primario. Cul es el factor de concentracin F=
N/Nteorica?
Datos:
Cantidad de biftalato potsico pesada: P = 0,2117 g
Volumen de disolucin de KOH gastado: V = 9,50 mL
Solucin: La concentracin exacta, en equivalentes/litro, se calcula mediante la
expresin:
N = P 1000 / (204,23 V)
Sustituyendo:
N = 0,2117 1000 / (204,23 9,5) = 0,1091 eq/l
El factor de concentracin ser:
F = N / Nteorica = 0,1091 / 0,1 = 1,091
2. Determinar el Grado de Acidez y el ndice de Acidez de un aceite de oliva del que

hemos pesado para hacer la determinacin 9,107 g, sabiendo que se han gastado 3,50
mL de disolucin etanlica de KOH 0,1 N con un factor de concentracin F=1,091.
Solucin: El Grado de acidez se calcula mediante la expresin:
GA = 28,2 N V / P
Siendo :
N = Nteorica F
Sustituyendo:
N = 0,1 1,091 eq/l
GA = 28,2 0,1 1,091 3,50 / 9,107 = 1,18 % c. oleico
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El ndice de acidez se calcula mediante la expresin:

IA = 56,11 N V / P
Sustituyendo:
I.A. = 56,11 0,1 1,091 3,50 / 9,107 = 2,35 mg KOH / mg aceite
REFERENCIAS
International Union of Pure and Applied Chemistry Standard Methods for the
Analysis of Oils, Fats and Soaps. 1964. II. D. 1.
Norma Espaola UNE 55.011 (AENOR).
Diario Oficial de las Comunidades Europeas. L 248/6 1991.
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5. NDICE DE PERXIDOS
INTRODUCCIN
Se denomina ndice de perxidos a la cantidad de perxidos (combinacin de oxgeno
de la forma -O-O-) presentes en la muestra, expresada en miliequivalentes de oxgeno
activo por kilogramo de grasa, que producen la oxidacin del yoduro a yodo en
condiciones determinadas.
El ndice de Perxidos es un ndice fsico-qumico que permite estimar el estado de
oxidacin primaria de los aceites y por lo tanto su alteracin.
En las primeras etapas de oxidacin de los cidos grasos se producen hidroperxidos y
por ello el ndice de Perxidos crece. Sin embargo, en las etapas posteriores, estos
compuestos evolucionan hacia otro tipo de sustancias ms oxidadas que dan del mal
olor y sabor a los aceites, por lo que puede disminuir dicho ndice.
Los valores lmite del ndice de perxidos para las distintas categoras comerciales del
aceite de oliva virgen son las siguientes (Reglamento CEE 61/2011):
Virgen extra
20 meq O2 activo / Kg
Virgen
20 meq O2 activo / Kg
Virgen lampante
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FUNDAMENTO
Los perxidos de la muestra son capaces de liberar yodo del yoduro potsico segn la
siguiente reaccin que tiene lugar en medio cido:
R-CH-CH-R'
O
+ 2 HI
R-CHOH-CHOH-R' + I2
R-CH-CH-R' + H2O + I2
O
formndose un mol de yodo por cada mol de oxgeno peroxdico.

El yodo liberado se valora con tiosulfato sdico segn la reaccin:
I2 +
2 Na2S2O3
2 NaI
Na2S4O6
El punto final de la valoracin se produce cuando la fase acuosa est incolora o de

color blanco sucio, siendo ms fcil de identificar dicho punto si se usa almidn como
indicador.
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Balanza analtica
Bureta de 25 mL con graduacin de 0,1 mL
Navecillas de vidrio (o plstico inerte) de 3 mL de capacidad aprox
Matraces erlenmeyer de 250 mL con boca esmerilada y tapn de vidrio
Pipetas Pasteur
Pipetas de 1, 10 y 25 mL
Pera de goma
Probeta de 100 mL
Matraz aforado de 1 litro
Reloj
Bala de gas inerte puro y seco (N2, CO2 Ar).
Cloroformo P.A. exento de oxgeno.
cido actico glacial P.A. exento de oxgeno.
Solucin saturada de yoduro potsico P.A. recin preparada.
Solucin indicadora de almidn al 1 %.
Solucin de tiosulfato sdico 0,1 N valorada exactamente.
Dicromato potsico (especie qumica primaria).
cido clorhdrico concentrado (37%).
Solucin de yoduro potsico para anlisis al 15 %.
La cantidad de grasa que se ha de pesar para realizar el ensayo estar de acuerdo con
el ndice de Perxidos que se presupone, segn se indica en el cuadro siguiente:
NDICE DE PERXIDOS PRESUPUESTO
(meq O2/Kg)
de 0 a 20
de 20 a 30
de 30 a 50
de 50 a 100
PESO DE LA MUESTRA (g)

entre 2,0 y 1,2
entre 1,2 y 0,8
entre 0,8 y 0,5
entre 0,5 y 0,3
El procedimiento que se describe a continuacin es vlido para el caso ms habitual,

en el que el ndice de Perxidos est comprendido entre 0 y 20 meq O2 activo por Kg
de grasa. Para el resto de los casos habr que hacer las modificaciones pertinentes.
Se desaloja el aire que hay dentro del matraz de boca esmerilada de 250 mL mediante
una corriente de gas inerte (N2, CO2 o Ar) y se tapa rpidamente con un tapn de
vidrio.
18
Se pesan entre 1,2 y 2 g de muestra, con una precisin de 0,001 g, en una navecilla de
vidrio o plstico inerte de unos 3 mL de capacidad (su tamao debe permitir
introducirla y sacarla del matraz sin dificultad).
Se introduce la navecilla con la muestra en el matraz de cuello esmerilado, resbalando
por la pared para no salpicar con la muestra el esmerilado, y se cierra de nuevo el
matraz con el tapn de vidrio.
Se aaden 10 mL de cloroformo para anlisis exento de oxgeno, disolviendo
rpidamente la muestra por agitacin.
Se agregan 15 mL de cido actico glacial para anlisis exento de oxgeno y 1 mL de
solucin saturada de yoduro potsico.
Se cierra rpidamente el matraz y se agita durante 1 minuto, levantando un poco el
tapn al final para que salgan los vapores.
Se deja reposar en la oscuridad durante 5 minutos a una temperatura comprendida
entre 15 y 25 C.
Se adicionan 75 mL de agua destilada para parar la reaccin y se agita vigorosamente
para que el yodo liberado pase a la fase acuosa.
Se ponen unas gotas de la solucin de almidn como indicador y se valora el yodo
liberado con la solucin de tiosulfato sdico 0,002 N, agitando con fuerza hasta que el
color cambia de violeta a blanco sucio. Para ello se usa una bureta de 25 mL.
Es conveniente efectuar dos determinaciones por muestra y hallar la media entre
ambas.
Se debe realizar una prueba en blanco (igual pero sin aceite), tambin por duplicado,
para conocer el estado de los reactivos. Si en este ensayo se gastan ms de 0,25 mL de
disolucin de tiosulfato 0,002 N deben sustituirse los reactivos que estn en mal
estado y/o realizar una limpieza escrupulosa del material.
Cuando el ndice de Perxidos sea mayor que 20 meq O2 activo por Kg de aceite, la
disolucin de tiosulfato sdico que se debe emplear en la valoracin debe tener una
concentracin 0,01 N.
CLCULOS
El ndice de Perxidos, expresado en miliequivalentes de oxgeno activo por kilogramo
de grasa, se calcula mediante la expresin:
IP = (V-V0) N 1000 / P
siendo:
19
V0: volumen de disolucin de tiosulfato sdico gastado en el ensayo en blanco, mL.

V: volumen de disolucin de tiosulfato sdico gastado en la valoracin, mL.
N: concentracin exacta de la disolucin de tiosulfato sdico, eq/l.
P: peso de la muestra de aceite, g.
El contenido en perxidos de la muestra, tambin puede expresarse en otras unidades
realizando las operaciones que figuran en la siguiente tabla:
ndice de Perxidos expresado en:

A) Microgramos de oxgeno activo por gramo de grasa
B) Gramos de oxgeno activo por kilogramo de grasa
C) Mililitros de disolucin de tiosulfato sdico 0,01 N por kg de grasa
D) Mililitros de disolucin de tiosulfato sdico 0,01 N por gramo de grasa
E) Mililitros de tiosulfato sdico 0,002 N por gramo de grasa
F) Milimoles de oxgeno activo por kilogramo de grasa
Operacin a
realizar:
IP 8
IP / 1000
IP 100
IP / 10
IP / 2
IP / 2
PREPARACIN DE REACTIVOS
Cloroformo para anlisis exento de oxgeno
Se hace pasar una corriente de gas inerte, puro y seco a travs del cloroformo para
anlisis en la campana de gases.
cido actico glacial para anlisis exento de oxgeno
Se hace pasar una corriente de gas inerte, puro y seco a travs del cido actico
glacial para anlisis en la campana de gases.
Solucin saturada de yoduro potsico
Se disuelven 36 gramos de yoduro potsico para anlisis en 25 mL de agua destilada
recin hervida. Se mantiene en frasco topacio bien cerrado.
Solucin indicadora de almidn al 1%
Se pesan en un vaso de precipitados de 25 mL 2,5 g de almidn soluble y 0,005 g de
HgI2 (estabilizador) y se mezclan con 15 mL de agua destilada.
Se agrega la mezcla anterior a 250 mL de agua destilada caliente, se mantiene en
ebullicin 3 minutos y se deja enfriar.
La solucin as preparada se conserva largo tiempo sin que se altere en frasco topacio
bien cerrado.
Solucin de tiosulfato sdico 0,002 N
Se prepara por dilucin de una disolucin de tiosulfato sdico 0,1 N de concentracin
exactamente conocida.
20
La disolucin de tiosulfato sdico 0,1 N se prepara disolviendo con agua destilada

recin hervida 24,82 g de Na2S2O35H2O y completando hasta 1 litro. Se aaden 0,001
g/l de HgI2 como conservador. Esta disolucin puede encontrarse comercialmente
lista para su uso.
Para preparar 1 l de disolucin de tiosulfato sdico 0,002 N se toman, con una pipeta,
20 mL de disolucin de tiosulfato sdico 0,1 N exactamente medidos y se ponen en
un matraz aforado de 1 litro, enrasando con agua destilada exenta de oxgeno.
Las disoluciones de tiosulfato sdico son inestables, por lo que su concentracin
puede variar con el transcurso del tiempo. Es conveniente determinar la
concentracin exacta antes de la utilizacin contrastndolas con dicromato potsico,
que es un patrn primario estable. Para ello se puede seguir el siguiente
procedimiento:
Se pesan 0.1200 g de dicromato potsico EQP (especie qumicamente primaria) y se
disuelven en un matraz aforado de 100 ml. Se toman 2 ml de esta disolucin en un
erlenmeyer de 250 ml de boca esmerilada. Se aaden 23 de agua destilada, 15 ml de
un disolucin de KI (2g de KI P.A. en 15 ml de agua destilada) y 0,2 ml de HCl 37%.
La reaccin que tiene lugar es:
Cr2O7= + 14 H+ + 6 I-
2 Cr3+ + 3 I2
+ 7 H2O
Se deja reposar 5 minutos en la oscuridad, y transcurridos estos se aaden 5 mL de

agua destilada, y aproximadamente 1 ml de disolucin indicadora de almidn. La
cantidad de yodo producida, que es exactamente conocida, se hace reaccionar con la
disolucin de tiosulfato sdico 0,002 N (cuya concentracin exacta deseamos
conocer), la cual se adiciona desde una bureta de 25 mL hasta que se produce el
viraje (cambio de color) a transparente, anotndose el volumen de disolucin de
tiosulfato gastado. La reaccin que tiene lugar es:
I2
S2O3=
2 I- +
S4O6=
El factor exacto de la disolucin de tiosulfato sdico 0,002 N se calcula mediante la

expresin:
F = (203,95 P) / V
siendo:
V: volumen de disolucin de tiosulfato sdico gastado, mL.
P: peso de dicromato potsico, g.
Por tanto, normalidad exacta ser:
N = 0,002 F
siendo F el factor de correccin de concentracin determinado anteriormente.
21
EJEMPLOS
1. Determinar la concentracin exacta de una disolucin de Na2S2O3 0,002 N, calcular
el factor de concentracin teniendo en cuenta que el ensayo se ha realizado por
duplicado utilizando K2Cr2O7 como patrn primario obtenindose los siguientes
datos:
Peso de K2Cr2O7 (g)
Volumen de Na2S2O3 0,1 N

Gastado (mL)
0,1201
24.5
0,1217
24.8
Solucin: El factor exacto de la disolucin de tiosulfato sdico se calcula mediante la

expresin:
F= (203,95 x P) / V
siendo P el peso de dicromato potsico en gramos y V el volumen de disolucin de
tiosulfato sdico gastado en la valoracin en mililitros.
Sustituyendo los datos en la frmula:
F = (203,95 x 0,1201) / 24.5 = 1.0002
F = (203,95 x 0.1217) / 24.8 = 1.0008
Haciendo la media entre las dos determinaciones se obtiene que el factor exacto de la
disolucin de tiosulfato sdico es:
F = (1.0002 + 1.0008) / 2 = 1.0005
La concentracin de la disolucin es por tanto:
N = Nteorica x F= 0.002 / 1.0005 = 2.001 x 10-3
2. Determinar el ndice de Perxidos de un aceite de oliva sabiendo que hemos

pesado 1,507 g del mismo y hemos gastado en la valoracin 8,30 mL de disolucin de
tiosulfato sdico 0,002 N con un factor de concentracin F=1.0005. Paralelamente se
ha realizado un ensayo en blanco en el que se han consumido 0,10 mL de la misma
disolucin de tiosulfato.
Solucin: El ndice de Perxidos se calcula mediante la expresin:
IP = (V-V0) N 1000 / P
siendo:
22
V0: volumen de disolucin de tiosulfato sdico gastado en el ensayo en blanco, mL.

V: volumen de disolucin de tiosulfato sdico gastado en la valoracin, mL.
N: concentracin exacta de la disolucin de tiosulfato sdico, eq/l. N=Nterica F
P: peso de la muestra de aceite, g.
Sustituyendo los datos del problema en la frmula:
N = 0,002 1.0005 eq/l
IP = (8,30-0,10) 0,002 1.0005 1000 / 1,507
IP = 10,89 meq O2 activo / Kg de aceite
REFERENCIAS
International Union of Pure and Applied Chemistry Standard Methods for the
Analysis of Oils, Fats and Soaps. 1964. II. D. 13.
Norma Espaola UNE 55.023 (AENOR).
Diario Oficial de las Comunidades Europeas L 248/8 1991.
23
6. MEDIDA ESPECTROFOTOMTRICA EN EL UV
INTRODUCCIN
Los coeficientes de extincin molar en el ultravioleta K270 y K232 son ndices
fisicoqumicos que se utilizan para detectar la presencia de compuestos oxidados que
alteran la calidad del aceite y detectar la presencia de aceites refinados. Su medida se
emplea como criterio de calidad.
El aceite de oliva virgen de buena calidad y almacenado de forma adecuada, contiene
muy pocos productos de oxidacin. Los hidroperxidos formados en las primeras
etapas de la oxidacin de los aceites y los dienos conjugados absorben la radiacin
ultravioleta a longitudes de onda cercanas a los 232 nm. Otros productos ms oxidados
que se forman a partir de los anteriores, tales como aldehdos y cetonas y los trienos
conjugados absorben cerca de los 270 nm. Los aceites refinados tambin tienen
valores ms altos de extincin a 270 nm que los vrgenes.
La espectrofotometra ultravioleta es, por tanto, uno de los medios ms adecuados
para conocer la calidad y el estado de conservacin de un aceite de oliva virgen y
permite adems sospechar posibles adulteraciones con aceite refinado o con aceite de
orujo.
En funcin de los coeficientes de extincin a 232 y 270 nm, comnmente conocidos
como K232 y K270, el aceite de oliva virgen se clasifica en las siguientes categoras
comerciales (Reglamento CEE 61/2011):
CATEGORA COMERCIAL
K232
K270
Virgen "extra"
2,50
0,22
Virgen
2,60
0,25
Virgen "lampante"
Los valores de K no deben sobrepasar el valor de 0,01 para aceites de oliva vrgenes
comestibles, no estando limitado para los lampantes.
Para la determinacin de la pureza, en caso de que el K270 sobrepase el lmite
establecido para la categora correspondiente, deber efectuarse una nueva
determinacin del K270 despus de pasar el aceite por una columna de almina
activada. En este caso, el nuevo coeficiente K270 determinado deber ser 0,10 como
mximo para todas las categoras.
24
FUNDAMENTO
La materia grasa se disuelve en el disolvente requerido y se determina la absorbancia
de la solucin a las longitudes de onda prescritas, respecto al disolvente puro. A partir
de los valores de absorbancia se calculan las extinciones especficas.
Balanza analtica
Espectrofotmetro para medidas de extincin en el UV entre 220 y 360 nm con
posibilidad de lectura para cada unidad nanomtrica
Cubeta/s de cuarzo con tapadera, de 1 cm de paso ptico
Matraces aforados de 25 mL
Pipetas pasteur o varillas
Ciclohexano de calidad para espectrofotometra UV o 2,2,4-Trimetilpentano
(isooctano)
Se homogeneiza la muestra y se filtra en caso de no estar exenta de impurezas en
suspensin (se calienta un poco si no est completamente fundida hasta que funde
completamente).
Se pesan, con una precisin de 0,0001g, unos 0,10 g de la muestra de aceite en un
matraz aforado de 25 mL con la ayuda de pipeta pasteur. (Es importante que la
muestra caiga directamente al fondo del matraz y no impregne la parte esmerilada). Se
enrasa el matraz con isooctano (o ciclohexano) de calidad espectrofotomtrica y se
agita bien para homogeneizar el contenido.
Si la disolucin obtenida presenta opalescencia o turbidez, se filtra rpidamente por un
filtro de papel.
Se llena una cubeta con la disolucin obtenida y se miden las extinciones usando como
referencia el disolvente utilizado, a las longitudes de onda de 232, 270, m-4, m y m+4
nanmetros; siendo m la longitud de onda de mxima absorcin alrededor de 270 nm.
La lectura debe estar comprendida entre 0,2 y 0,8 unidades de absorbancia. En caso
contrario debe repetirse el procedimiento pesando una cantidad de muestra
adecuada.
Notas:
Los aceites de oliva vrgenes que sea necesario purificar para realizar esta
determinacin se sometern al siguiente tratamiento en columna de almina:
Preparar una columna rellenando con una suspensin de 30 g de almina bsica de
actividad I (Brockman) en 100 mL de hexano. Despus de asentarse al adsorbente
25
se elimina el exceso de hexano hasta 1 cm aproximadamente sobre el nivel superior

de la almina.
Se disuelven 10 g de materia grasa, homogeneizada y filtrada, en 100 mL de hexano
y se vierte esta solucin en la columna. Se recoge el lquido eluido y se evapora
totalmente el disolvente en vaco a una temperatura inferior a 25 C.
CLCULOS
Las extinciones especficas o coeficientes de extincin a las diversas longitudes de onda
se pueden calcular mediante la expresin:
K = E / (C
e)
Siendo:
E, extincin medida en el espectrofotmetro a la longitud de onda ;
C, concentracin (g/100 mL) de la disolucin;
e, espesor de la cubeta en cm
Teniendo en cuenta que el espesor de la cubeta es e=1cm y que se utilizan matraces
aforados de 25 mL, (la concentracin en g/100mL es C=(4
P), podemos escribir:
P)
K = E / (4
Donde P es el peso de la muestra en gramos.
El delta-K se determina, segn en el mtodo descrito en el Reglamento CEE, a partir de
la expresin:
K = Km - (Km-4 + Km+4) / 2
Donde Km es extincin especfica a la longitud de onda m de mxima absorcin
alrededor de 270 nm.
REVISIN DEL ESPECTROFOTMETRO

El espectrofotmetro debera revisarse con una periodicidad de 6 meses segn el
procedimiento que figura a continuacin.
Se disuelven 0,2 g de cromato potsico, en un matraz aforado de 1l , con una
disolucin de hidrxido potsico 0,05 N y se enrasa con esta misma disolucin. Se
transvasan 25 mL de la disolucin obtenida a un matraz aforado de 500 mL y se enrasa
con la misma solucin de hidrxido potsico 0,05 N.
Se mide la extincin de la disolucin as preparada a la longitud de onda de 275 nm
utilizando la solucin de hidrxido potsico 0,05 N como referencia.
26
La extincin medida en cubeta de 1 cm de paso ptico debe ser 0,200 + 0,005.

REFERENCIAS
Diario Oficial de las Comunidades
espectrofotomtrica en el ultravioleta.
Europeas.
248/33.
Prueba
27
7. ANLISIS DE STERES METLICOS DE LOS CIDOS GRASOS POR

CROMATOGRAFA DE GASES
INTRODUCCIN
Se describe un mtodo rpido para la formacin de los esteres metlicos de los cidos
grasos que esterifican a los glicridos de los aceites y posterior determinacin de la
composicin porcentual de los mismos por cromatografa gaseosa en columna capilar.
El mtodo es vlido solo para aceites con acidez baja (<2% oleico), ya que en las
condiciones descritas no se produce la metilacin de los cidos grasos libres.
FUNDAMENTO
La tcnica consiste en disolver la muestra de aceite en n-hexano y realizar una
hidrlisis y metilacin en fro de los triglicridos con potasa metanlica. Los steres
metlicos formados pasan a la fase superior, separndose y cuantificndose por
cromatografa gaseosa en columna capilar.
Balanza analtica
Vial transparente de 5 mL con tapn de rosca
Pipeta de 1 ml
n-Hexano (calidad para anlisis)
Metanol (calidad para anlisis)
Hidrxido Potsico (calidad para anlisis)
PROCEDIMIENTO
Pesar entre 0,05 y 0,10 g de aceite en un vial transparente de 5 ml con tapn de rosca.
Aadir 3 mL de n-hexano y agitar para que se disuelva el aceite.
Aadir 0,5 ml de KOH metanlica 2 N (se prepara disolviendo, con ayuda de un
ultrasonidos, 3,3 g de KOH del 85% de pureza en 25 ml de metanol).
Agitar vigorosamente durante 1 minuto para que se produzca la reaccin de
metilacin.
Dejar en reposo hasta que las fases se separan perfectamente (20-30 min).
Pinchar en el cromatgrafo de gases 1 l del sobrenadante.
28
CONDICIONES CROMATOGRFICAS
Gas portador: helio.
Gas auxiliar: nitrgeno.
Horno: modo isotermo, T=210 C.
Inyector: Vinyec=1 l, T=250 C, P=29 psi, modo split (50:1), Fsplit=51,8 ml/min, Ftotal=55,2
ml/min.
Columna: capilar de polietilenglicol acidificado, L=50 m, D=250 m, e=0,25 m, F=1.0
ml/min, v=27 cm/s.
Detector (FID): T=250 C, Fhidrgeno= 30 ml/min, Faire=400 ml/min, Fauxiliar=30 ml/min.
RESULTADOS
La composicin de cidos grasos se expresa en porcentaje de rea de cada uno de los
steres metlicos con una cifra decimal.
REFERENCIAS
AOCS Official Method Ch 1-91. Preparation of Methyl Esters of Long-Chain Fatty
Acids.
AOCS Official Method Ch 2-91. Determination of Fatty Acids in Olive Oils by
Capillary GLC.
Reglamento CEE 2568/91. Anexo X "A". Anlisis de los steres metlicos de los
cidos grasos mediante cromatografa de gases.
Reglamento CEE 2568/91. Anexo X "B". Preparacin de los steres metlicos de
los cidos grasos de conformidad con los puntos I y II del Anexo VI del Reglamento
(CEE) N 72/77 o segn el mtodo que se describe a continuacin.
29
CROMATOGRAMA DE CIDOS GRASOS TOTALES DE UN ACEITE DE OLIVA VIRGEN OBTENIDO A PARTIR DE ACEITUNAS DE LA VARIEDAD CORNICABRA.
20
30
4
6
8
10
12
14

16
B e h n ic o (C 2 2 :0 )
G a d o le ic o ( C 2 0 : 1 )
A r a q u d ic o ( C 2 0 : 0 )
L in o l n ic o ( C 1 8 : 3 )
M a r g r ic o ( C 1 7 : 0 )
H e p t a d e c e n o ic o ( C 1 7 : )
1 0 .3 5 4
1 6 .5 7 2
60
9 .0 9 2
80
6 .9 2 1
P a lm it o le ic o ( C 1 6 : 1 )
E s t e r ic o ( C 1 8 : 0 )
7 .3 4 7
7 .3 8 1
O le ic o ( C 1 8 : 1 )
7 .9 5 8
L in o le ic o ( C 1 8 : 2 )
5 .0 1 7
P a lm t ic o ( C 1 6 : 0 )
100
1 0 .8 9 8
40
5 .2 4 9
pA
5 .8 1 7
6 .0 9 6
5 .2 0 2
0
minmin
8. ESTABILIDAD OXIDATIVA (Mtodo RANCIMAT)

INTRODUCCIN
La estabilidad oxidativa se define como el tiempo necesario para que un aceite o grasa
comience a presentar sntomas de rancidez, proporcionando una buena estimacin de
la susceptibilidad de los mismos a la degradacin oxidativa.
La estabilidad frente a la oxidacin de una grasa aceite depende de su composicin
qumica, es decir, del grado de insaturacin de los cidos grasos, la cantidad de
antioxidantes naturales presentes, la presencia de trazas metlicas. Pero al mismo
tiempo tambin depende de las condiciones en las que se verifique el proceso, sobre
todo de la disponibilidad de oxigeno, la temperatura y la luz.
Medir la estabilidad real de un aceite no resulta prctico, por lo que se recurre a medir
este parmetro en condiciones aceleradas por diversos procedimientos.
FUNDAMENTO Y DESCRIPCIN DEL SISTEMA

El sistema RANCIMAT proporciona un mtodo automtico de determinacin de la
estabilidad oxidativa en condiciones aceleradas que se basa en una medida de la
conductividad, que va aumentando debido a la produccin de cido frmico y otros
productos voltiles a partir de compuestos intermedios de degradacin del aceite. Las
ventajas son su automatismo, la realizacin de determinaciones simultneas en varias
muestras, el bajo consumo de muestra y reactivos y la posibilidad de utilizar un amplio
rango de temperaturas de trabajo.
El sistema RANCIMAT consta de dos bloques separados: la unidad qumica o de
reaccin y la unidad de programacin y control.
La unidad de reaccin permite trabajar con hasta con seis muestras simultneamente.
Su bloque metlico calefactor ofrece un rango de temperaturas entre 50 y 220 C.
Incorpora una bomba de aire y el flujo del mismo puede regularse entre 4 y 25 L/h
mediante vlvulas independientes para cada uno de los 6 canales.
Gracias a un filtro situado en la parte posterior del bloque, se evita la entrada de
partculas de polvo y el aire tambin se seca previamente al pasar por un tubo lleno
con tamiz molecular, garantizndose unas condiciones de trabajo independientes de la
humedad ambiental.
El material de vidrio se compone de los tubos para la muestra o de reaccin, el sifn
de borboteo y los recipientes de medida, que se llenarn con agua destilada y que
soportan las clulas de medida conductimtrica. Las uniones entre las piezas se cierran
bien mediante pinzas de plstico cuando las piezas son de vidrio o juntas estancas y se
31
protegen si es necesario de posibles agarrotamientos con anillos de tefln. El equipo se

completa con un juego de accesorios para la calibracin de la temperatura.
La unidad de control gobierna la unidad de reaccin. Permite programar los
parmetros de trabajo y las condiciones de parada. Dispone de una pantalla de dos
lneas para el dilogo con el instrumento y visualizacin de las condiciones de trabajo,
as como del tiempo de operacin y la conductividad de cada canal. Incorpora una
impresora trmica que permite la impresin de las grficas de oxidacin, resultados,
datos de las muestras, fecha, hora y condiciones de trabajo.
Balanza con una sensibilidad de 0,01 g

RANCIMAT (MetrohmTM)
Pipetas Pasteur desechables
Ultrasonidos (opcional, pero recomendable para la limpieza del material)
Escobillas
Detergente concentrado RBS (FlukaTM) o EXTRAN (MerckTM)
Cantidad de muestra
Es recomendable pesar entre 2,5 y 3,5 gramos de muestra. En productos en que se
puedan producir procesos de evaporacin, como en las emulsiones de mantequillas,
hay que tener en cuenta la prdida de agua al pesar la muestra.
Caudal de aire
Suele trabajarse entre 10 y 20 l/h por canal. Los resultados del ensayo varan poco con
el caudal de aire.
Temperatura
En aceites de semillas se escoge una temperatura de trabajo en el rango entre 100 a
130 C para obtener resultados en 3 a 12 horas preferentemente. Sin embargo, en
aceites de oliva virgen es habitual trabajar a 100-120 C an cuando el tiempo del
ensayo exceda bastante de 12 horas.
Punto final
Es recomendable tomar como punto final el tiempo de induccin, que es el tiempo
necesario para llegar al punto de inflexin de la grfica que representa la
conductividad en funcin del tiempo. El tiempo de induccin queda por tanto definido
como el punto de interseccin de las tangentes a las dos ramas de la grfica.
32
Realizacin del ensayo

Se pone en marcha el equipo, se selecciona el mtodo de trabajo y se introducen los
canales activos y la identificacin de las muestras. Se recomienda poner en marcha el
bloque calefactor con tiempo suficiente, ya que la gran precisin del sistema implica
una cierta lentitud en conseguir la temperatura de trabajo.
Una vez preparados los tubos de reaccin, se introducen en el bloque calefactor y se
espera 10 minutos para estabilizar la temperatura. Se preparan los recipientes de
medida con 60-80 mL de agua desionizada y con las clulas de conductividad. Pasados
los 10 minutos, se conecta el aire con el caudal determinado en cada tubo y se inicia el
anlisis.
En el caso de no analizar las seis muestras, se recomienda introducir tubos de reaccin
en los agujeros vacos para evitar descompensaciones por efecto de la temperatura.
El anlisis se puede parar manualmente o por programacin a punto final o a tiempo
fijo. En todos los casos el instrumento suministra el informe con los datos obtenidos
hasta el momento.
Iniciado el anlisis, el instrumento no requiere ninguna intervencin y puede trabajar
durante la noche sin ningn problema. Por precaucin se aconseja disponer de un
acumulador para evitar que un corte fortuito del suministro elctrico interrumpa el
ensayo en marcha.
RESULTADOS
Los resultados se expresan en horas de estabilidad oxidativa, indicndose las
condiciones en que se realiz el ensayo (cantidad de muestra, caudal de aire,
temperatura del ensayo y el modo de detectar el punto final del anlisis).
REFERENCIAS
F. Gutirrez: Determinacin de la estabilidad oxidativa de aceites de oliva vrgenes:

comparacin entre el mtodo A.O.M. y el mtodo Rancimat. Grasas y Aceites 40
(1989) 1-5.
33
34
9. DETERMINACIN DE COMPUESTOS POLARES EN GRASAS Y ACEITES

POR EXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPE) Y CROMATOGRAFA DE
EXCLUSIN-POR TAMAO.
INTRODUCCIN
La cuantificacin de compuestos polares es el mtodo ms usado para evaluar la
calidad de las grasas de fritura desde su desarrollo a finales de los aos 70. El mtodo
se basa en la separacin de dos fracciones de diferente polaridad en una columna de
slice, a partir de un gramo de grasa, las cuales pueden ser determinadas
gravimtricamente.
La fraccin polar incluye todos los compuestos de alteracin y, en consecuencia,
cuanto mayor es la fraccin polar menor es la calidad de la grasa de fritura. Este
mtodo es simple, exacto y reproducible y adems la eficacia de la separacin puede
ser fcilmente comprobada por cromatografa en capa fina (TLC).
La separacin de los compuestos polares por cromatografa de exclusin ha sido
propuesta (Dobarganes,M.C. et al. 1988) como una evaluacin complementaria de los
principales grupos de compuestos que difieren en el peso molecular como son:
polmeros, monmeros oxidados y diglicridos que se producen por degradacin
trmica, oxidativa e hidroltica respectivamente.
Esta metodologa no solo ha sido aplicada en las grasas de fritura, sino que tambin ha
contribuido al desarrollo de un extenso numero de aplicaciones en estudios de
oxidacin, control de calidad de aceites refinados y caracterizacin de aceites de oliva
virgen.
Hexano
Eter dietlico
Hexano-Eter dietlico (87:13)
Tetrahidrofurano (THF)
Monooleina (P.I.)
Columna SPE silice, 1g/6ml
Columnas cromatograficas de exclusin por tamao conectadas en serie:
HP Plgel 5m 100
HP Plgel 5m 500
Cromatgrafo de Lquidos con Detector de Indice de refraccin (IRD)
Matraces de corazn de 25 ml
Matraces aforados de 5 ml
35
PROCEDIMIENTO
En un matraz aforado de 5 ml se pesan aproximadamente 250 mg con precisin de
0.001 g de la grasa, se aaden 0.5 ml del P.I. (10 mg/ml) disuelto en eter diisoproplico
y se enrasa con hexano.
Se acondiciona la columna de slice con 10 ml de hexano-eter dietlico (87:13) y a
continuacin, siempre sin dejar secar se pasan dos mililitros de muestra.
Seguidamente se lava la columna con 15 ml de hexano-eter dietlico (87:13), y se
desecha esta fraccin ya que contiene los triglicridos no alterados del aceite junto a
otros compuestos.
Por ltimo se eluyen de la columna los compuestos polares de alteracin con 15 ml de
ter dietlico que son recogidos en un matraz de corazn de 25 ml y se evapora hasta
sequedad el disolvente con la ayuda de un rotavapor.
El residuo se redisuelve en 0,5-1 ml de THF, segn el grado de alteracin de la grasa, y
por tanto la concentracin de la muestra. A continuacin se inyectan 20 l de la
solucin en el Cromatgrafo de Lquidos.
El mtodo cromatogrfico de anlisis es el siguiente:
Flujo: 1 ml/min
Disolvente: THF
Temperatura horno: 27 C
Detector IRD: 35 C
CUANTIFICACIN
Compuestos polares totales expresados como porcentaje en peso se calculan a partir
de la siguiente expresin:
CP% =
AP.I. Caceite
100
(A AP.I.) CP.I.
En donde
A = Suma del rea de los picos
AP.I. = rea del pico de P.I.
CP.I. = Concentracin de P.I. en la muestra (mg/ml)
Caceite = Concentracin del aceite en la muestra (mg/ml)
36
Cambiando A por el rea de cada uno de los picos se puede calcular el porcentaje de
cada uno de los grupos de compuestos.
REFERENCIAS
AOCS Oficial Method Cd 20-91. Determination of Polar Compounds in Frying Fats.
Dobarganes, M.C.; Prez-Camino, M.C.; Mrquez-Ruiz, G. High Performance Size

Exclusion Chromatography of Polar Compounds in Heated and Non- Heated Fats.
Fat Sci. Technol. 1988, 90, 308-311.
Mrquez-Ruiz, G.; Jorge, N.; Martn-Polvillo, M.; Dobarganes, M.C. Rapid,

quantitative determination of polar compounds in fats and oils by solid-phase
extraction and size-exclusion chromatography using monostearin as internal
standard. J. Chromatogr. A. 1996, 749, 55-60.
37
ACEITE DE OLIVA VIRGEN IP = 20
nRIU
TG. OX.
ACEITE DE OLIVA REFINADO ALMACENADO 3 MESES A 75 C
80000
DIMEROS
60000
POLIMEROS
DG.
40000
20000
DG.
TG. OX.
0
38
8
10
12
A.4Salvador Moya, 6Facultad de Ciencia
y Tecnologas
Qumicas, UCLM
14
16
min
10. DETERMINACIN DE ALFA-TOCOFEROL EN ACEITES

INTRODUCCIN
Se describe un mtodo para la determinacin del alfa-tocoferol por cromatografa
lquida de alta eficacia (HPLC) empleando un detector de fluorescencia segn el
mtodo AOCS Ce 8-89.
FUNDAMENTO
La tcnica empleada consiste en disolver la muestra de aceite en n-hexano para HPLC y
proceder a su inyeccin en el cromatgrafo y lectura a 292 nm. La cuantificacin se
realiza por una interpolacin del rea del pico en una recta de calibrado obtenida
previamente en las misma condiciones, preparada inmediatamente antes de su uso, en
un intervalo de concentraciones entre 1 y 8 mg/L.
Matraz aforado de 100 ml.
Matraz aforado de 50 ml.
Balanza analtica.
Pipetas pasteur y tetinas.
Matraz esfrico de fondo redondo y boca esmerilada de 100 ml.
Evaporador rotatorio a vaco con termostato (Rotavapor).
Espectrofotmetro y cubeta de cuarzo de 1 cm de paso ptico.
Matraces aforados de 10 ml (8-10).
Viales de 2 ml con tapn de rosca.
Cromatgrafo de lquidos de alta presin (HPLC).
Columna Si-60 de 25 cm. Fase normal.
Guardacolumna.
Reactivos:
Metanol de calidad espectrofotomtrica. Merck 1.06009.1000 (1 l).
Patrn de alfa-tocoferol. Sigma, T-3251 (5g).
n-Hexano de calidad HPLC (95+ %). Sigma-Aldrich 27,050-4 (2,5 l).
2-Propanol de calidad HPLC (99,5 %). Sigma-Aldrich 27,049-0 (1 l).
39
RECTA DE CALIBRADO DEL -TOCOFEROL

Disolucin madre de -tocoferol
En primer lugar se prepara una solucin madre de -tocoferol. Para ello se pesa con
exactitud en un matraz aforado de 100 ml, con ayuda de una pipeta pasteur, una
pequea gota de -tocoferol (en torno a 0,0200 g), procurando que caiga
directamente en el fondo del matraz. Se disuelve con hexano de calidad HPLC y se
enrasa con este mismo disolvente. El -tocoferol se oxida con extremada facilidad, por
lo que se debe operar de forma rpida y guardar tanto el patrn como la solucin
madre obtenida en refrigeracin, atmsfera de nitrgeno y preservados de la luz.
La solucin madre obtenida tendr una concentracin en torno a los 200 mg/l y se
puede utilizar durante toda una semana siempre y cuando se almacene en las
condiciones indicadas.
Disolucin intermedia de -tocoferol

A partir de la disolucin madre de -tocoferol se prepara por dilucin una disolucin
de concentracin intermedia de -tocoferol, de unos 20 mg/l aproximadamente, en un
matraz aforado de 50 ml. Para ello se diluyen en dicho matraz 5 ml de disolucin
madre con hexano de calidad HPLC se enrasa con este mismo disolvente y se
homogeneiza. Esta disolucin debe utilizarse el mismo da que se prepara.
Para conocer de forma exacta la concentracin de -tocoferol en la disolucin
intermedia se opera as:
- Se pipetean en un matraz esfrico de fondo redondo y boca esmerilada de
100 ml 10,0 ml exactos de disolucin intermedia.
- Se evapora a vaci en el rotavapor y a temperatura inferior a 40 C todo el
disolvente.
- Se ponen en el matraz esfrico 10,0 ml exactos de metanol de calidad
espectrofotomtrica y se disuelve bien el residuo de tocoferol.
- Se mide la absorbancia de esta disolucin metanlica frente a un blanco de
metanol solo a la longitud de onda de 292 nm.
La concentracin de tocoferol en la disolucin intermedia se determina mediante la
siguiente expresin:
Ctocof = A292 / 0,0076
Siendo:
Ctocof = concentracin de tocoferol en la disolucin intermedia en mg/l.
A292 = absorbancia de la disolucin metanlica.
40
Preparacin de las disoluciones de la recta de calibrado

Es suficiente con que la recta de calibrado llegue hasta los 8 mg/l de tocoferol.
Las disoluciones de la recta de calibrado se preparan en matraces aforados de 10 ml.
Los puntos de la recta van a ser los que corresponden a las concentraciones que se
consiguen por dilucin hasta 10 ml de los siguientes volmenes de disolucin
intermedia:
V (ml)
Cteor (mg/l)
0,5
1,00
1,0
2,00
2,0
4,00
3,0
6,00
4,0
8,00
En general, la concentracin exacta en mg/l de las disoluciones de la recta de calibrado

se determina por la expresin:
C = Ctocof * V / 10
Siendo:
Ctocof = concentracin de ??tocoferol en la disolucin intermedia en mg/l.
V = volumen en ml de disolucin intermedia, que se pone en cada matraz de 10
ml, para preparar la recta de calibrado.
Preparadas las disoluciones de la recta de calibrado se ponen en viales de 2 ml y se
cierran hermticamente. Cada vial se rotula con la concentracin exacta que contiene.
Obtencin de la recta de calibrado

La cromatografa se desarrolla a temperatura ambiente y utilizando un flujo de 1
ml/min. El eluyente es una mezcla n-hexano-2-propanol (98.5:1.5) v/v.
Se inyectan 20 microlitros de cada uno de los viales en el cromatgrafo de lquidos y se
obtiene la recta de regresin que correlaciona el rea del pico del tocoferol, expresada
en mV*s, con la concentracin de tocoferol en los estndares expresada en mg/l. La
ecuacin general de la recta es:
rea = O.O. + Pte. * CStocof
Cada vez que se inyecta un estndar, aparecer un nuevo punto en la recta de
calibrado. Hay que asegurarse por tanto de que cada da que vamos a obtener una
recta de calibrado borramos la recta anterior, ya que de lo contrario se adicionaran los
nuevos puntos a la recta anterior.
41
PREPARACIN DE LA MUESTRA ANALTICA

En un matraz aforado de 10 ml se pesan con exactitud 0,2000 g de muestra de aceite,
se disuelven con n-hexano de calidad HPLC, se enrasa con este mismo disolvente y se
homogeneiza el contenido del matraz. Es importante que la muestra caiga en el fondo
del matraz y no quede en el esmerilado del cuello para que los resultados sean
correctos y reproducibles.
Preparada as la muestra, se pone en un vial, se cierra hermticamente y se inyecta en
el cromatgrafo de lquidos.
La concentracin de tocoferol en la muestra preparada se obtiene interpolando
directamente en la recta de calibrado el rea de pico obtenida.
RESULTADOS
La concentracin de tocoferol en la muestra de aceite de oliva se determina mediante
la expresin:
CMtocof = CDtocof * Vmatr / PM
Siendo:
CMtocof = concentracin de tocoferol, mg/Kg, en la muestra de aceite de oliva.
CDtocof = concentracin de tocoferol en la muestra preparada, mg/l, que se
obtiene interpolando en la recta de calibrado.
Vmatr = volumen del matraz aforado donde se prepara la muestra analtica,
ml.
PM = peso exacto de la muestra de aceite, g.
Si se utiliza un matraz aforado de 10 ml :
CMtocof = CDtocof * 10 / PM
42

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