PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA

M.T. SIMANJUNTAK
J. SILALAHI

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Jurusan Farmasi
Universitas Sumatera Utara

I. PROTEIN

A. REAKSI UJI PROTEIN

1. PENGENDAPAN PROTEIN OLEH GARAM-GARAM ANORGANIK

Kelarutan protein akan berkurang bila kedalam larutan protein
ditambahkan garam- garam anorganik. Pengendapan terus terjadi karena
kemampuan ion garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara
garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air. Karena garam
anorganik lebih menarik air maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein
akan berkurang.

Pereaksi:
a. ammonium sulfat
b. pereaksi Millon (150 gr/l larutan merkuri sulfat dalam 15% v/v asam
sulfat)
c. pereaksi Biuret

Cara Kerja:
1. Jenuhkan 10 ml larutan protein dengan ammonium sulfat, dengan cara
penambahan ammonium sulfat kristal sedikit demi sedikit, aduk hingga
larut. Tambah dan aduk lagi sehingga sedikit garam ammonium yang
tertinggal tidak larut lagi (terbentuk larutan lewat jenuh). Saring.
2. uji kelarutan endapan dalam pereaksi Millon dan pada filtratnya
tambahkan pereaksi Biuret.

Pengendapan Protein oleh garam anorganik

Tabung Pereaksi Hasil Keterangan

I ( endapan ) Millon ………… ………………..

II ( filtrat ) Biuret ………… …………………

2. UJI KOAGULASI
Protein dengan penambahan asam atau pemanasan akan terjadi
koagulasi. Pada pH iso-elektrik (pH larutan tertentu biasanya berkisar 4 – 4,5
dimana protein mempunyai muatan positif dan negatif sama, sehingga saling
menetralkan) kelarutan protein sangat menurun atau mengendap. Pada
temperatur diatas 60o C kelarutan protein akan berkurang (koagulasi) karena
pada temperatur yang tinggi energi kinetik molekul protein meningkat sehingga
terjadi getaran yang cukup kuat untuk merusak ikatan atau struktur sekunder,
tertier dan kuartener yang menyebabkan koagulasi.
Pereaksi:

©2003 Digitized by USU digital library 1

 a. asam asetat 1M
b. pereaksi Millon

Cara Kerja:
1. ke dalam tabung reaksi yang berisi 5 ml larutan protein ditambahkan dua
tetes asam asetat 1M.
2. letakkan tabung dalam air mendidih selama lima menit.
3. ambil endapan dan ujilah kelarutannya dalam air dan pereaksi millon.

Uji Koagulasi

Tabung Pereaksi Hasil Keterangan

I ( endapan ) Air ………… ………………..

II ( endapan ) Millon ………… …………………

3. PENGENDAPAN DENGAN ALKOHOL

Protein dapat diendapkan dengan penambahan alkohol. Pelarut organik
akan mengubah (mengurangi) konstanta dielektrika dari air, sehingga kelarutan
protein berkurang, dan juga karena alkohol akan berkompetisi dengan protein
terhadap air.

Pereaksi:
a. HCl 0,1 M
b. NaOH 0,1 M
c. Buffer asesat 1M (pH 4,7)
d. Etanol 95%

Cara Kerja:
1. Sediakan 3 tabung reaksi dan isi masing- masing tabung reaksi dengan
5ml larutan protein.
2. Ke dalam tabung I : tambahkan 1ml HCl 0,1M dan 6ml etanol 95%
II : 1ml NaOH 0,1M dan 6ml etanol 95%
III : 1ml Buffer asetat dan 6ml etanol 95%
3. Lihat tabung-tabung mana yang tidak larut.

Pengendapan dengan alkohol

Tabung Pereaksi Hasil Keterangan

I ( 5 ml Protein ) 1 ml HCl 0,1 N ………. ……………

6 ml etanol 95 %

II ( 5 ml Protein ) 1 ml NaOH 0,1 N ………. ……………

6 ml etanol 95 %

III ( 5 ml Protein ) 1 ml buffer asetat ……… ……………

6 ml etanol 95 %

©2003 Digitized by USU digital library 2

4. DENATURASI PROTEIN

Denaturasi dapat diartikan suatu proses terpecahnya ikatan hidrogen,

ikatan garam atau bila susunan ruang atau rantai polipetida suatu molekul
protein berubah. Dengan perkataan lain denaturasi adalah terjadi kerusakan
struktur sekunder, tertier dan kuartener, tetapi struktur primer (ikatan peptida)
masih utuh.

Pereaksi:
a. buffer asetat 1M (pH 4,7)
b. HCl 0,1M
c. NaOH 0,1M

Cara Kerja:
1. Sediakan tiga tabung reaksi masing- masing tabung diisi dengan 9ml
larutan protein.
2. Ke dalam tabung I : tambahkan 1ml HCl 0,1M
II : 1ml NaOH 0,1M
III : 1ml Buffer asetat
3. Tempatkan ketiga tabung dalam air mendidih selama 15 menit dan
dinginkan pada temperatur kamar.
4. Lihat ke dalam tabung mana terjadi endapan.
5. Lanjutkan percobaan di atas terhadap tabung I dan II dengan
menambahkan 10ml buffer asetat.

Denaturasi Protein
a)
Tabung Pereaksi Hasil Keterangan

I ( 9 ml larutan 1 ml HCl 0,1 N ………. ……………

Protein )

II ( 9 ml larutan 1 ml NaOH 0,1 N ………. ……………

Protein )

III ( 9 ml larutan 1 ml buffer acetat ……… ……………

Protein )

b)
Tabung Pereaksi Hasil Keterangan

I ( Hasil a ) 10 ml buffer acetat ………. ……………

II ( Hasil a ) 10 ml Buffer asetat ………. ……………

B. PENENTUAN KADAR CASEIN

Casein merupakan protein yang terdapat dalam susu. Hampir 80% protein
dalam susu terdiri dari casein di samping Laktalbumin dan laktoglobulin.
Pereaksi:
a. Asam asetat 1 N dan 0,25 N
b. NaOH 0,1 N
c. Formaldehide 40%
d. Fenolftalein

©2003 Digitized by USU digital library 3

Cara kerja :
1. 20 ml sampel masukkan dalam beaker glas, panaskan di
penangas air pada suhu 40o C. bila digunakan sampel susu
kental diencerkan dengan aquades perbandingan 1:2 dan susu
bubuk ditambahkan aquades 1:9.
2. Tambahkan 1,5 ml asam asetat 1 N, aduk homogen dan
diamkan selama 20 menit. Tambah lagi 4,5 ml asam asetat
0,25 N (untuk mencapai pH isoelektrik dari casein) aduk dan
diamkan selama 1 jam.
3. Dekanter kedalam corong dengan kertas saring. Cuci endapan
dengan aquades sampai air cucian bersifat netral.
4. Kemudian kertas saring dan endapan masukkan kedalam beker
semula dan tambahkan aquades sampai dengan volume ± 20
ml.
5. Tambahkan 4 ml larutan NaOH 0,1 M, panaskan diatas
penangas air sampai larut seperti susu dan dinginkan sampai
suhu 21-24o C, teteskan 3 tetes fenolftalein.
6. Tambahkan 4 ml formaldehide 40% (warna rose hilang), titrasi
dengan NaOH 0,1 N sampai terbentuk warna rose kembali.
Kadar Casein = ml NaOH 0,1 N × 0,9 %

Catatan:
Protein bersifat amfoter sehingga sulit dititrasi sebagai asam maupun
sebagai basa. Supaya dapat dititrasi sebagai asam, maka sifat basa dari gugus
amino dapat dihilangkan dengan mereaksikannya dengan formaldehide sehingga
ion H +dapat dititrasi dengan NaOH.
Reaksi:
+
H3 N- -COO- + 2 HCOH (HOCH2 )2 NH+ - -COO-
Protein Formaldehide
(HOCH2 )2 NH+ - -COO- + NaOH (HOCH2 )2 NH+ - -COO- + Na+
+ H2 O

Penentuan Kadar Casein

Volume NaOH 0,1 N
V1 = …….. ml
V2 = …….. ml
V3 = …….. ml

V rata – rata = ……… ml

Kadar Casein = Vol rata – rata NaOH 0,1 N x 0,9 %

II. KARBOHIDRAT

C. REAKSI UMUM KARBOHIDRAT

1. Reaksi Molish
Prinsip: ikatan glikosida pada karbohidrat akan terhydrolisa oleh H2 SO4
(pekat) menghasilkan monosakarida yang kemudian dihydrasi membentuk
Furtural. Dan bila direaksikan dengan Alpha Naftol akan memberikan warna
ungu.
Bahan/Alat : - Larutan karbohidrat
- Asam sulfat pekat
- Larutan alpha nafthol 5% dalam etanol.(dibuat baru)
- Tabung reaksi

©2003 Digitized by USU digital library 4

 Cara Kerja : 1. Dalam tabung reaksi yang bersih dan kering
dimasukkan 2 ml larutan karbohydrat dan 3
tetes larutan alpha nafthol
2. Melalui dinding tabung tambah secara perlahan-
lahan larutan asam sulfat pekat sampai
terbentuk cincin coklat.
3. Ulangi percobaan di atas dengan
mempergunakan 2 ml air sebagai pengganti
2 ml larutan karbohydrat. (percobaan blanko).
Amati apa yang terjadi.

Keterangan : Disakarida yang dalam suasana asam akan

terhidrolisa dan menyebabkan reaksi positif.
Reaksi positif. Ditunjukkan dengan adanya
Endapan Cu2 O yang berwarna merah bata.

Reaksi Molish
Tabung Bahan Pereaksi Hasil Keterangan

I 2 ml Karbohydrat H2SO4 P ……… …………..

3 tts alpha napthol
II
2 ml air, 3 tts lar. H2SO4 P ……… ………….
Alpha napthol

2. Reaksi Yodium
Prinsip : Senyawa polisakarida akan memberikan warna yang spesifik
dengan yodium.
Bahan dan alat :
- Larutan amyulum
- Larutan dekstrin
- Larutan Yodium
- Spot plate
Larutan yodium terdiri dari: Kristal yodium
kalium yodida
dan aquades
Cara kerja :
1. Pada plat tetes yang bersih dan kering dimasukkan 3 tetes
larutan yang diperiksa.
2. Campur dengan 2 tetes larutan yodium
3. Terbentuk warna biru untuk amylum dan warna merah
anggur untuk dekstrin.
Reaksi Yodium

Plat tetes Bahan Pereaksi Hasil Keterangan

Lobang I 3 tetes sampel 2 tetes Yodium ……… …………..

Lobang II 3 tetes sampel 2 tetes Yodium ……… …………..

3. Reaksi Benedict
Prinsip: Cu 2 + akan direduksi oleh gula menjadi Cu+. Dalam hal ini
terbentuk endapan Cu2 O. reaksi dinyatakan positif apabila terbentuk
endapan berwarna biru kehijauan sampai merah batu bata. (tergantung
pada kadar gula reduksi yang tersedia).

©2003 Digitized by USU digital library 5

Bahan dan alat:
- Larutan sukrosa (Lar..............................................)
- Larutan laktosa (Lar..............................................)
- Larutan Benedict
- Tabung reaksi

Cara kerja:
1. Ke dalam tabung reaksi yang bersih dan kering dimasukkan 1 ml
larutan yang akan diselidiki kemudian dicampur dengan 2 ml
larutan Benedict. Kocok.
2. Didihkan selama 2 menit atau masukkan dalam air yang mendidih
selama 5 menit.
3. Perhatikan warna reaksi yang terjadi.

Larutan Benedict terdiri dari;

- CuSO4 . 5H2 O...........................
- Na2 CO3 6 H2 O.........................
- Natrium Citrat........................
- Aquades.................................
Reaksi Benedict

Tabung Pereaksi Hasil Keterangan

I (1 ml sampel) 2 ml Benedict …………… ……………

D. PENENTUAN KADAR GLUKOSA

1. Yodimetri
Prinsip:
Glukosa adalah termasuk gula reduksi karena monosakarida yang memiliki gugus
OH laktol bebas dan dapat berobah menjadi glukosa alifatis dengan gugus
aldehide sebagai reduktor lemah dan kemudian dapat dioksidasi oleh oksidator
lemah seperti Yodium membentuk asam glukonat.
Pereaksi:
a. Indikator larutan kanji
b. Larutan natrium karbonat 14,3 %
c. Larutan Yodium 0,1 N
d. HCl encer
e. Larutan natrium tiosulfat 0,1 N

Cara kerja:
Ditimbang seksama sampel padat yang mengandung kira-kira 100 mg
glukosa yang tidak mengandung reduktor lainnya, dilarutkan di dalam 50 ml air
suling di dalam erlenmeyer bertutup. Ditambahkan 25 ml yodium 0, 1 N dan 10
ml larutan natrium karbonat 14,3 %, ditutup dan dibiarkan selama 30 menit
ditemp at gelap. Kemudian ditambahkan 15 ml asam klorida encer dan yodium
yang tersisa dengan larutan natrium tiosulfat 0,1 N sampai terjadi warna kuning
lemah. Ditambahkan lagi indikator kanji dan lanjutkan titrasi sampai warna biru
hilang. Dilakukan titrasi blanko. Tiap ml yodium 0,1 N setara dengan 9,9185 mg
glukosa.

Penentuan Kadar Glukosa

Volume larutan 0,1 N yodium
V1 = …….. ml
V2 = …….. ml
V3 = …….. ml
V rata – rata larutan Yodium = ……… ml

©2003 Digitized by USU digital library 6

 III. LIPIDA

Lipida adalah senyawa organik yang terdapat dalam mahluk hidup yang
larut di dalam pelarut non-polar tetapi tidak larut di dalam air. Lipida terdiri dari
lemak (sekitar 95%), steroida, karotenoida, vitamin yang larut dalam lemak.

E. PEMERIKSAAN KELARUTAN LEMAK

Prinsip:
Jika minyak dikocok kuat dengan air akan terjadi emulsi yang tidak mantap
karena butir-butir minyak kecil akan memisah dari air. Penambahan emulgator
misalnya, protein, gom, sabun akan terbentuk emulsi yang stabil. Lemak larut
dalam pelarut non-polar seperti eter, heksan, bensin, kloroform, tetapi tidak larut
didalam pelarut polar. Lemak dalam larutan NaOH atau KOH akan terjadi
penyabunan.
Bahan dan alat:
- Minyak goreng, mentega
- Bensin, air, eter, alkohol 95%, NaOH 1 N
- Tabung reaksi, pipet ukur
Cara kerja :
1. Siapkan 5 buah tabung reaksi yang bersih dan kering
2. Tanbahkan pada masing- masing tabung reaksi 1 ml minyak goreng,
kenudian dicampurkan dengan bahan sebagai berikut:
- Tabung I : ditambah 1 ml air
- Tabung II : ditambah 1 ml bensin
- Tabung III : ditambah 1 ml alkohol 96%
- Tabung IV : ditambah 1 ml eter
- Tabung V : ditambah 1 ml NaOH 1N
3. Aduk-aduk sampai homogen. Diamkan beberapa menit dan amati serta catat
perubahan yang terjadi.
4. Ulangi percobaan di atas dengan memakai mentega sebagai sumber lipida.

Tabung Minyak Pereaksi Hasil Keterangan

goreng

I 1 ml 1 ml air ……… …………..

II 1 ml 1 ml Bensin ……… ……………
III 1 ml 1 ml alkohol 96% ……… …………..
IV 1 ml 1 ml eter ……… ………….
V 1 ml 1 ml NaOH ……… ………….

F. REAKSI PENYABUNAN DAN SIFAT-SIFAT ASAM LEMAK

Prinsip:
Sabun merupakan garam alkali dari asam lemak rantai panjang yang
bersumber dari minyak atau lemak, dimana jumlah rantai karbon mulai dari asam
lemak pembentuk sabun dari atom C-10-C-16. Kebanyakan sabun dibuat dengan
jalan penyabunan antara lemak dengan suatu basa monovalen seperti natrium
hidroksida melalui reaksi penyabunan.
Bahan dan alat :
- Larutan NaOH 1N, HCl 1N, etanol 96%, bensin
- Beker glas, erlenmeyer, batang pengaduk
- minyak goreng kelapa sawit

©2003 Digitized by USU digital library 7

Cara kerja :
1. 5 gram minyak goreng dimasukkan ke dalam beker glas kemudian
ditambahkan NaOH 1 N sedikit demi sedikit sambil dipanaskan pada suhu
70o C sebanyak 5x 0,142 g = 1,71 g (yang terdapat dalam sekitar 42 ml 1N
NaOH). Pemanasan dilanjutkan sampai terbentuk sabun. Kedalam larutan
sabun yang telah terbentuk ditambahkan HCl 1N kemudian amati apa yang
terjadi.
2. Kedalam campuran yang telah ditambahkan HCl ditambahkan bensin atau
alkohol 96 % dan amati apa yang terjadi.

Reaksi Penyabunan

Tabung NaOH 1 N Pemanasan HCl 1 N Hasil

I 42 ml 30 menit 5 ml …………….
+ bensin
---- >
+alkohol 96%
---- >

G. PENENTUAN KADAR LEMAK SUSU

Metode ini digunakan untuk penetapan kadar lemak susu. Metode ini banyak
digunakan di Eropa sebagai analisa rutin.
Prinsip:
Susu dicampur dengan H2 SO4 dan amil alkohol dalam tabung Gerber
khusus lalu disentrifuse sehingga lemak susu terpisah dan menempati bagian
atas tabung. Lemak yang terpisah ini dapat ditentukan kadarnya dengan melihat
panjang kolom lemak yang terbentuk.
Pereaksi:
1. Asam sulfat 90% (w/w), BJ 1,815
2. Amil alkohol

Peralatan:
1. Tabung butirometer Gerber
2. Sentrifuse Gerber berdiameter 50 cm
3. Pipet volumetri 10,75 ml (lihat catatan 1)
Cara kerja:
1. Masukkan 10 ml H2 SO4 ke dalam tabung butirometer dengan tanpa
membasahi leher tabung.
2. Pipet 10,75 ml susu, masukkan ke dalam tabung butirometer dengan
tanpa membasahi leher tabung.
3. Tambahkan 1 ml amil alkohol. Tutup tabung dengan penutupnya, kocok
merata, sentrifuge selama 4 menit pada 1100 rpm.
4. Tempatkan tabung dalam penangas air 65o C, selama 3 menit.
5. Baca persentase kadar lemak (w/w), sesuai dengan panjang kolom
tabung yang telah dikalibrasi.
Catatan:
1. Jumlah sampel yang diambil untuk analisa ini berbeda-beda untuk setiap
negara, sebagai contoh:
India 10,75 ml
Belanda 10,66 ml
Hongaria 10,80 ml
Inggris 10,94 ml
AS 11,00 ml
2. Jangan tambahkan amil alkohol sedemikiam rupa sehingga kontak
langsung dengan asam.

©2003 Digitized by USU digital library 8

 3. Persiapkan kain dan sodium bikarbonat. Kedua bahan ini berguna jika
tabung butirometer yang berisi H2 SO4 pekat pecah.

H. PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODA LOWRY.

1. Prinsip : Dialam protein terdapat dalam 3 ( tiga ) bentuk, yaitu ;

a. Protein bebas.
b. Protein yang tidak terlarut , terdapat dalam tulang,
otot, rambut dan gumpalan darah.
c. Protein terlarut, terdapat banyak dalam bahan
pangan seperti susu, telur dan daging.

Penentuan kadar protein terlarut ini berdasarkan pada

berbagai metoda , misalnya : titrasi formol,
spektrofotometri dan sebagainya.

2. Tujuan : Untuk menentukan kadar prtein terlarut dalam suatu

bahan secara cepat.

3. Bahan & Alat :

Larutan protein yang diselidiki
Pereaksi Lowry A dan Lowry B.
Larutan buffer asetat pH 5.0
Tabung reaksi 20 ml.
Seperangkat spektrofotometer
4. Cara kerja :

1. Penentuan panjang gelombang maksimum.

a. Siapkan larutan protein dalam konsentrasi tertentu dalam
tabung reaksi yang bersih dan kering.
b. Tambahkan 8 mL pereaksi Lowry A, diamkan selama 10 menit.
c. Kemudian tambahkan 1 mL pereaksi Lowry B, diamkan selama
10 menit. Jumlah seluruh volume 10 mL.
d. Ukur absorbansi sampel dari panjang gelombang 400 nm -
800 nm, pada alat spektrofotometer.
e. Bentuk kurva absorbansi Vs panjang gelombang.

2. Pembuatan kurva kalibrasi larutan protein.

a. Timbang teliti 300 mg albumin ( protein ), larutkan dalam
1liter air ( konsentrasi = 300 mg/ L = 300 µg / mL).
b. Siapkan larutan protein tersebut dalam 10 tabung reaksi
Sehingga kadarnya bertingkat dari 30 – 300 mg / mL
Cara pengenceran dapat dilakukan sebagai berikut :
c. Tambahkan kedalam masing masing tabung reaksi diatas 8
mL pereaksi Lowry A,diamkan selama 10 menit.
d. Kemudian tambahkan 1 mL larutan pereaksi Lowry B, diamkan
selama 10 menit. Volume akhir setiap tabung adalah 10 mL
Sehingga konsentrasi protein perlu diperhitungkan dengan
pengencerannya.
e. Dengan alat spektrofotometer diukur absorbansi masing
masing tbg tersebut pada panjang gelombang maksimum.
( 600 nm )
f. Buat kurva kalibrasi pada kertas grafik dengan menunjukkan
hubungan antara absorbansi dan konsentrasi

©2003 Digitized by USU digital library 9

 Tabung mL larutan protein mL H 20 µg protein / mL
No ( 300 µg / mL )
1 0 1,0 0
2 0,1 0,9 30
3 0,2 0,8 60
4 0,3 0,7 90
5 0,4 0,6 120
6 0,5 0,5 150
7 0,6 0,4 180
8 0,7 0,3 210
9 0,8 0,2 240
10 0,9 0,1 270

3. Pengukuran sampel.
a. Larutan protein yang terlarut dari sampel, misalnya
enzyme,albumin,dan lain lain diendapkan terlebih dahulu
dengan kristal ammonium sulfat ( jumlahnya tergantung pada
jumlah protein dalam sampel, sampai mengendap sempurna ).
b. Larutan disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 15
menit. Supernatan dipisahkan.
c. Endapan berupa protein dilarutkan kembali dalam larutan
buffer asetat pH 5,0 sebanyak 5 ml.
d. Pipet 1 mL dari larutan protein pH 5,0, masukkan kedalam
masing masing tabung reaksi yang bersih dan kering ( 3 buah
). Campur dengan 8 mL larutan pereaksi Lowry A, diamkan
selama 10 menit.
e. Kemudian kedalam tabung tersebut ditambahkan 1 mL larutan
pereaksi Lowry B, diamakan selama 10 menit. Volume akhir
setiap tabung adalah 10 mL, sehingga konsentrasi protein
dalam sampel perlu diperhitungkan dengan pengenceran (
dalam hal ini 1 : 10 ).

5. Data : 1. Kurva Kalibrasi ( 600 nm )

Tabung µg protein / mL Absorbansi

No
1 0 …………….
2 3,0 …………….
3 6,0 …………….
4 9,0 …………….
5 12,0 …………….
6 15,0 …………….
7 18,0 …………….
8 21,0 …………….
9 24,0 …………….
10 27,0 …………….

©2003 Digitized by USU digital library 10

 2. Pengukuran sampel

Tabung Absorbansi
No
1 …………….
2 …………….
3 …………….
4 …………….
5 …………….
6 …………….
7 …………….

6. Perhitungan :

7. Catatan.
a. Pereaksi Lowry A
- Asam phosphotungstat – phosphomolibdat dalam air ( 1 : 1 )
b. Pereaksi Lowry B
- Na2 CO3 2 % 100 mL dalam larutan NaOH 0,1 N, tambahkan 1mL
CuSO4 dan 1 mL K Na Tartrat 2 %
c. Larutan dapar asetat pH 5,0.
- Larutan I : 0,2 M larutan asam asetat
Larutan II : 2 M larutan Na-asetat
Campur larutan I 14,8 mL + larutan II 35,2 mL encerkan sampai
100 mL.

©2003 Digitized by USU digital library 11