Protease abstrak inhibitors adalah protein pertahanan alami yang menghambat kegiatan proteolytic proteases.

Kacang polong protease inhibitors bermacam-macam dalam mekanisme molekuler mereka dan banyak dari
mereka telah berhasil telah ditempatkan di crop tumbuhan untuk memberikan perlawanan serangga terhadap
hama. Sembilan kombinasi merosot primers,dirancang, berdasarkan pada "beberapa sejajar" urutan gen dari
database bank gen NCBI telah digunakan untuk memperkuat protease inhibitor gen pada sepuluh berbeda
tanaman kacang polong (dua variasi setiap)viz.fieldpea,kacang buncis, masakan kacang merah, lathyrus,
pigeonpea , frenchbean,mungbean ,clusterbean , horsegramand cowpea .-kombinasi primer BBF2/BBR2
memperkuatkan expectedamplicon dari 800 bp invarities ofmungbean,horsegramand cowpea. Amplicons ini
diperoleh dari setiap genotipe tersebut semakin ligated ke pJET1.2/ tumpul vector dan berubah menjadi XL1
asal biru E.coli. Dari 41 kembarannya dirangkaikan, dua urutan klon diperoleh dari cowpea (DCS 6)
menunjukkan homologi dengan substilisin-seperti megaphone inhibitor dari Desulfovibria protease yang berat
dan megaphone/treonin protein kinase dari Epichlocfastucae.gen ini dapat diubah ke binari berbasis
Agrobacterium vektor dan digunakan untuk tanaman transformasi. Oleh karena itu temuan-temuan ini
menawarkan gen baru untuk pengembangan pangan transgenik terhadap lepidopteron hama.
Kata Kunci: Tiupan, Cloning, perlawanan serangga, Protease inhibitor, tanaman pulsa.
Pengenalan
tanaman pulsa menduduki posisi penting untuk menjamin
keamanan nutrisi untuk penduduk dunia dan khususnya ke undernourished massa di gersang dan semi-kering
wilayah tropis.Mereka kaya protein dan ditemukan untuk menjadi sumber utama protein untuk orang-orang
yang vegetarian India. Ia adalah unsur penting kedua dari diet India setelah sereal.biji-bijian, sedang kacang
polong, memperbaiki nitrogen atmosfera ke dalam tanah dan memainkan peran penting dalam pertanian
berkelanjutan dengan tetap menjaga kesuburan tanah.Selain meningkatkan produktivitas yang melekat dari
tanaman tanaman, penting untuk meminimalkan kerugian produksi.walaupun menggunakan insektisida, prakerugian tuaian di seluruh dunia karena hama berbeda-beda antara 15 serangga%35% dari total produksi pada
sebagian besar bidang utama (1997) Krattiger tanaman.mekanisme pertahanan alami pabrik memungkinkan
untuk melindungi diri dari hama oleh synthesizing macromolecules tertentu seperti inhibitors, aamylase protease
inhibitor, lectins dan senyawa phenolic. Protein-inhibitors protease yang menghambat kegiatan proteolytic
protease.Protease inhibitors adalah protein yang berhubungan dengan pertahanan alami sering hadir dalam bijibijian dan disimpulkan di jaringan tumbuhan oleh herbivory tertentu atau melukai (Koiwaet al., 1997).
Berdasarkan analisis menyelesaikan urutan genom beberapa, diperkirakan bahwa sekitar 2% dari semua produkproduk gen (protease Barret et al., 1998). Sejumlah besar inhibitors protease telah diisolasi dan ditandai dari
tumbuh-tumbuhan, hewan dan mikroorganisme yang lebih luas dan belajar di kacang polong seperti kacang
polong, tekukur kacang polong, cowpea dan kacang kedelai dan yang ditimbulkan dalam mekanisme pertahanan
terhadap serangan serangga dan antimikroba (Richardson,1977, Valueva dan Mosolov, 2004, Christeller, 2005).
Selama satu dekade terakhir, dengan pengenalan komersial transgenicplants memiliki Btgenes tahan serangga,
keprihatinan utama dengan tanaman tersebut telah perkembangan resistanceby hama dan penerimaan
masyarakat miskin. Oleh karena itu, ada kebutuhan untuk menemukan gen pabrik efektif baru, yang akan
memberikan perlawanan/perlindungan terhadap hama. Protease adalah salah satu inhibitor kandidat utama
dengan sangat terbukti aktivitas penghalang terhadap hama serangga dan juga mengetahui untuk meningkatkan
kualitas gizi makanan. -inhibitors actsspecifically protease terhadap grup khusus protease serangga dan oleh
karena itu sangat penting untuk mengidentifikasi calon yang tepat sebelum pabrik tanaman gen dirubah dengan
gen inhibitor protease
(Johnson et al.,1989). Gen Trypsininhibitor ketika ditransfer dari cowpea untuk tembakau ditunjukkan untuk
memberikan perlawanan terhadap berbagai hama termasuk Lepidoptera serangga seperti Heliothis dan
Spodoptera, coleopterans seperti Diabrotica, Anthonomonus dan Orthoptera asLocusts seperti (Hilderet
al.,1987). Baru-baru ini telah inhibitors protease yang ditimbulkan dalam mekanisme pertahanan terhadap
resistensi antimikrobial dan pengendalian hama serangga. Oleh karena itu studi ini dilaksanakan untuk menilai
kehadiran protease gen inhibitor dalam tanaman pulsa utama dan untuk dan klon mencirikan kacang polong
protease inhibitor gen.
Bahan-bahan dan metode

bahan tumbuhan dan isolasi DNA: Benih-benih dua variasi setiap sepuluh tanaman viz.kacang polong fieldpea
berbeda (HTI HUDP 99-25, 15),kacang buncis(C 235, BG 256), masakan kacang merah (DPL 15,
81),lathyrus IPL(Pusa 24 dan Bio L 212), pigeonpea (Bahar, ketikkan 7),frenchbean (EC 406072, HUR
15),mungbean (Pantmung 3, sentuh 7),clusterbean (HGH 365, 864), horsegram RGC(AK 42, HG 25)dan
cowpea(DCS 6, IC 39890) telah dipilih untuk analisis yang ada sekarang. Bibit tersebut germinated pada karya
handuk direndam dalam disterilisasi air di bawah kondisi etiolated untuk mengurangi kontaminasi kloroplas
DNA. Satu minggu bibit lama adalah tanah di memanaskan CTAB buffer dan incubated pada 60C selama satu
jam. Dalam tahap pelapisan encer berisi DNA adalah dipisahkan dengan menggunakan Chloroform: Isoamyl
alkohol (24:1) (Abdelnooret al., 1995). DNA tersebut telah mengawali dengan chilled food-propanol iso dan
pellet dibubarkan di 100 l dari T10E1 buffer. RNA yang telah dihapuskan oleh menambahkan 0.5 Unit RNase.
Konsentrasi-DNA yang dapat dianggarkan oleh mengukur daya serap kelembaban menggunakan Hoefer Dyna
Quant 200 fluorometer DNA (Amersham Biosciences, Piscataway, kereta NJ, Amerika Serikat) dan sahamsaham dipertahankan pada 25 ng/l.
Primer merancang: Untuk primer, NCBI desain database Genebank telah digunakan dan urutan-urutan Bowman
jenis Birk protease gen inhibitor dari kacang polong dan cowpea tidak di-download dan sejajar dengan
menggunakan parameter default dari perangkat lunak ClustalW (Larkin et. al. 2007). Tiga meneruskan (BBF1,
dan BBF BBF23) dan tiga (terbalik BBR1, BBR2 dan BBR3) primers (Tabel 1) telah dirancang dengan
menggunakan Primer 3.0 dan perangkat lunak dari Teknologi Operon disintesis khusus, USA.
Tabel 1: Primers digunakan untuk amplifikasi terhadap kacang polong protease inhibitor gen
amplifikasi terhadap protease gen inhibitor oleh PCR: sembilan kombinasi berbeda dari tiga pasangan merosot
primers telah digunakan untuk amplifikasi terhadap protease inhibitor dengan suhu annealing gen mulai dari
37C 50 itulah BBF1/BBR1,BBF2/BBR2,BBF3/BBR3,
BBF1/BBR2, BBF1/BBR3,BBF2/BBR1,BBF2/BBR3,BBF3/ BBR1, dan BBF3/BBR2.PCR reaksi mereka
dilakukan dalam 20 l volume yang berisi 25 ng DNA template, 45 pM setiap primers maju dan mundur, 25 M
masing-masing dNTPs (MBI Fermentas, La Jolla, USA) dan 0,6 Unit polimerase Taq (Bangalore Genei,
Bengaluru, India). Program PCR telah dijalankan pada PTC-200 (MJ Research, Amerika Serikat) thermocycler
termal yang terdiri dari dapat terjadi denaturasi awal pada 94C untuk 3 min diikuti oleh 39 kali siklus masingmasing terdiri dari dapat terjadi denaturasi pada 94C untuk 1 min, annealing dan pemanjangan ini pada 72C
selama 2 menit, Tm digunakan untuk annealing adalah sesuai dengan spesifikasi primer (Tabel 1). Langkah
ekstensi akhir termasuk 72C masa inkubasi untuk 7 mnt amplified fragmen-fragmen DNA ini yang
diselesaikan pada ethidium bromide cemar gel agarose (2%) di 1X TBE buffer di 50V. Dalam jeli telah
dilukiskan pada transUV dan difoto di BioRad Gel Doc XR 2.0.
Kloning dan analisa urutan: amplicons dari ukuran diharapkan telah eluted dari gel menggunakan kit QIAGEN
sebagai per memproduksi instruksi. Thefragments ligated-ke pJET1.2/tumpul menggunakan kit Genejet
(Fermentas). Produk ligated yang diubah ke E.coli XL sel-sel yang kompeten 1 blue oleh biologi molekuler
standar prosedur berikut (Sambrook et al. Tahun 1989). Pengemabangan plasmids diisolasi menggunakan kit
miniprep QIAprep spin (QIAgen) sesuai untuk memproduksi protokol instruksi. Pengemabangan kembarannya
ini dikenalpasti oleh analisis pencernaan pembatasan menggunakan Xba1 dan Xho1 enzim pembatasan
(Fermentas).klon positif yang dirangkaikan dengan menggunakan meneruskan primer dari pJET1.2
(5'CGACTCACTATAGGGAGA GCGGC3') (Fermentas), dengan menggunakan metode terminator pewarna
besar oleh sebuah ABI 3100 peralatan analyzer genetik (Diterapkan Biosystem) berdasarkan Sanger metode
yang di Bangalore Genei, Benagaluru. Analisa urutan ini dilakukan dengan menggunakan BLASTx dan
BLASTnprogram dari situs NCBI (http:// www.ncbi.nim.nih.gov).
Hasil diskusi dan
kombinasi yang primer BBF2 dan BBR2 memperkuatkan produk dari 800 bp dalam mungbean (Pantmung 3
dan sentuh 7), horsegram (42) dan cowpea AK (DCS 6 dan IC 39890)
(gbr 1). Ukuran amplicons adalah korelasi dalam ke sebelumnya dilaporkan panjang penuh ukuran protease gen
inhibitor (Datta dan Tiwari, 2006).primer BBF kombinasi1/BBR1 memperkuatkan amplicons 350 bp dalam
fieldpea (HTI 99-25 dan HUDP 15), masakan kacang merah (IPL 81 dan 15) dan lathyrus DPL (BioL Pusa 24
dan 212). Kombinasi yang primer BBF3/BBR1
Lane5:Cowpea IC 39890. Pohon Ara 2: Dibatasi pengemabangan plasmids menunjukkan dirilis

memperkuatkan amplicons 200 bp dalam semua dipilih kacang polong genotip. Kombinasi yang primer
(BBF3/BBR3), (BBF1/
BBR2), (BBF1/BBR3) (BBF2/BBR3) dan (BBF3/BBR2) yang dihasilkan beberapa jalur. Penampilan band
beberapa telah sebelumnya melaporkan sebagai hasil dari amplifikasi terhadap lebih dari onelocusby setiap
kombinasi primer (Holton et al., 2002). Kombinasi primers-BBF1/BBR2, BBF2/
BBR2, BBF2/BBR1, BBF2/BBR3 dan BBF3/BBR2 tidak menghasilkan gerombolan.Dari total 41 kembarannya
dirangkaikan, 16 clone dari mungbean(sentuh 7), 14 kembarannya dari cowpea (DCS 6) dan 11 kembarannya
dari cowpea (IC 39890)menunjukkan urutan panjang baca antara 324-866 bp (gbr 2).
Analisa urutan: TheBLASTx hasil urutan nukleotida nomor klon SD24 menunjukkan homologi kuat dari 50%
query coveragewith subtilisin-seperti megaphone dari Desulfovibria protease yang berat.Lebih dari 200
subtilisin-seperti sekarang ini enzim yang dikenal, Subtilisin-inhibitors sisipan. Lane M: 1 kb tangga DNA.
Lane 1: control (pJET1.2/ tumpul vector, 2974 bp). Lane 2-5:cowpea DCS 6. Lane 6-9:
cowpea IC 39890, Lane 10-13: mungbeanTAP-7.
314 atgtgcggagggagagaacggtgcaattgccccagaccaagtctc
MCGGRERCNCPRPSL
269 atccccctacccctactccaaggggcttcacactctgggagttcc
aku P L P L L Q G sebuah S H S G S S
224 ttctacttgaccagcttattcggatttcaattaccagccccctat
FYLTS LF GFQ LPPY
179 aggtattgtcttccaatcagtgggttcatgccgcacagaaagcga
R Y C L P Aku S G F M P H R K R
134 gacctacttctttctatctcggataactatgaaatttggcctagt
D L L L S saya S D N Y E Aku W P S
89 aataagcttagagtggaagagtcggtgaggaggaggtcatcaaga
NKLRVEESVRRRSSR
44 actgaatcttgctga 30
T E S C * pohon
ara 3: Membuka rangka membaca (285 bp) dan disimpulkan asam Acid
(94) urutan gen inhibitor dari cowpea protease IC 39890.
ditemukan dalam Vignaunguiculata (Vartak et al. Tahun 1980) dan Vignaradiata (Kapuret al., 1989),Subtilisinseperti proteases telah dikenalpasti dan gen cloned dalam beberapa spesies tumbuhan hanya, termasuk
Arabidopsis (Ribeiro et al., 1995).Incase dari cowpea (DCS 6), urutan nukleotida SD 38 menunjukkan homologi
dengan Megaphone/Treonin protein kinase dari Epichloefastucae.Dalam urutan-urutan nukleotida nomor klon
SD24 menunjukkan empat bingkai -1, 2, 3 dan -3. Rangka -1 dimulai di posisi 30 untuk 314 pasang basa dan
berisi 285 bp membuka membaca pengkodean frame sebuah protein diperkirakan dari 94 asam amino (Gbr. 3).
Hasil ini sesuai dengan bukti bahwa inhibitors dari tanaman dicotyledonous terdiri dari satu rantai polipeptida
seukuran dengan massa 8 kDa molekuler (Habib dan Khalid, 2007). Papan-papan 3 dan -3 telah menunjukkan
panjang 37 dan 34 asam acidsrespectively. Papan-papan -1, 3 dan -3 telah menunjukkan codon inisiasi (ATG)
dan penghentian codon (TGA). Gen ini dapat diubah ke binari berbasis Agrobacterium vektor dan digunakan
untuk tanaman transformasi. Oleh karena itu temuan-temuan ini menawarkan gen baru untuk pengembangan
pangan transgenik terhadap lepidopteronpests.
Pohon Ara 1: PCR amplifikasi oleh kombinasi primer BBF2/BBR2 pada 37C suhu annealing. Lane M: 100 bp
tangga DNA
plus, Lane 1: MungbeanPantmung 3, Lane 2: Mungbean sentuh 7, Lane 3: Horsegram AK 42, Lane 4: Cowpea
DCS 6,