RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS

TOTALES
OBJETIVO:
Determinar la presencia de Enterobacterias. Son indicadoras de
contaminacin fecal, por lo que se utilizan para ver la calidad
sanitaria de alimentos procesados. Un nmero elevado indica
elaboracin poco higinica y/o contaminacin despus de fabricacin.
En alimentos no procesados o con tratamientos insuficientes para
eliminar formas vegetativas se emplea como indicador de
contaminacin fecal: coliformes fecales o E.coli
La familia Enterobacteriaceae agrupa a microorganismos con las
siguientes caractersticas: bacilos, gram negativos, aerbios y
anaerbios facultativos, no esporulados, mviles por flagelos o
inmviles, fermetan la glucosa, reducen los nitratos a nitritos, oxidasa
negativo, crecen en medios que contienen sales biliares. Algunos
gneros fermentan la lactosa (Escherichia) y otros no (Salmonella y
Shigella)

FUNDAMENTO:
Identificacin de colonias tpicas en medio de cultivo solido
agar biliado rojo violeta glucosa (VRBG) sembrando en doble
capa. Las sales biliares y cristal violeta del medio inhiben el
crecimiento de flora competitiva. Todas las Enterobacterias fermentan
la glucosa con produccin de cido y esto se pone de manifiesto por
un viraje al rojo violeta y la precipitacin de las sales biliares produce
un halo violeta alrededor de las colonias.

MATERIAL:
-Stomacher,bolsa de Stomacher, pinza

-Balanza analtica

-Micropipeta y puntas estriles

-Autoclave

-12Tubos con VRBG estril

incubacin

-Estufa de

-3 Tubos con Agua de Peptona estril

agitacin

-Placa calefactora con

-6 Placas Petri de plstico estril

corriente en laboratorio

-Material uso

CLCULOS:
Previamente tenemos que preparar medio VRBG y Agua de Peptona
para diluciones.
Vamos a preparar 12tubos de VRBG a razn de 9ml por tubo, por lo
que necesitaremos 108ml. Vamos a preparar 150ml.
Seguimos las instrucciones del fabricante: Suspenda 41,5g del polvo
en 1L de agua purificada y hierva por no ms de 2minutos para
disolver completamente el polvo. No esterilice en autoclave
41,5g/1000ml x 150ml = 6,225g de VRBG y 150ml agua
destilada.
Vamos a preparar 6 tubos de Agua de Peptona(aunque solo vamos a
emplear 3)a razn de 9ml exactos por tubo, por lo que necesitaremos
54ml. Vamos a preparar 60ml.
Seguimos las instrucciones del fabricante: Aadir 15g a 1L de agua
destilada. Mezclar bien y distribuir en recipientes finales. Esterilizar en
autoclave a 121C, 15 minutos
15g/1000ml x 60ml = 0,9ml de agua de peptona y 60ml
agua destilada.

TCNICA:
A) PREPARAR EL VRBG:
1-Pesar 6,225g de
(previamente tarado)

polvo

VRBG

en

un

vaso

de

precipitado

2-Medir 150ml de agua destilada en una probeta

3-En un matraz Erlenmeyer aadir un poco del agua de la probeta y
pasar los gramos pesados de VRBG, y aadir un poco de agua
destilada al vaso de precipitado para arrastrar.
4-Verter toda el agua destilada al Erlenmeyer y colocar en una placa
calefactora y someter a agitacin y calor (aadir un imn).
5-Calentar hasta llevar a ebullicin (tiempo mximo 2minutos).

6-Trasvasar a los tubos Pirex aproximadamente 9ml por tubo, y tapar

con tapn de rosca. Dejar enfriar. (Los tubos deben tener ms de
doble de capacidad 18ml). No se esteriliza en el autoclave.
7-Cuando estn fros conservar en el frigorfico hasta el momento de
su utilizacin. Color del medio VRBG: sangre o prpura rojizo.
B) PREPARAR AGUA DE PEPTONA:
El agua de peptona ya la hemos preparado en prcticas anteriores,
por lo que no detallamos los pasos. Una vez preparada (como es para
diluciones) ponemos 9ml exactos medidos con pipeta estril a cada
tubo. Tapar y esterilizar en autoclave. Despus dejar enfriar, y
guardar en el frigorfico hasta su uso.
C) ESQUEMA DE TRABAJO:

D) PREPARAR DISOLUCIN O SUSPENSIN MADRE DILUCION

1/10, Y APARTIR DE ELLA HACER LA DILUCIN 1/100 Y
1/1000:
Se hace igual que en prcticas anteriores, con alguna diferencia:

Para asegurarnos de que crezcan enterobacterias vamos a

contaminar el alimento (lentejas cocinadas) con Citrobacter (lo
tenemos en un cultivo en medio TSA en pico de flauta). Para ello con
el asa de siembra estril cogemos carga bacteriana e inoculamos en
el tubo de 9ml de agua de peptona estril, y lo aadimos despus a la
bolsa de Stomacher que contiene 1g de lentejas. Todo esto tenemos
que hacerlo manteniendo las condiciones de esterilidad (flameando
cada vez, etc). Lo llevamos al Stomacher durante 60 segundos en
velocidad normal, despus dejamos reposar 20 minutos. Ser la
dilucin 1/10
Las diluciones 1/100 y 1/1000 se hacen igual que en las prcticas
anteriores.
E) AISLAMIENTO EN MEDIO SLIDO DE VRBG: mediante
siembra en doble capa
Previamente sacamos el agua de peptona del frigorfico y dejamos
atemperar, y los tubos con medio VRBG los fundimos y atemperamos
a 45-47C en bao termosttico.
1-Rotular las placas Petri, y poner 1ml de cada una de las diluciones
(1/10, 1/100, y 1/1000) en una placa Petri estril (por duplicado).
Trabajar manteniendo las condiciones de esterilidad.
2-Aadir 9ml de VRBG atemperado a una de las placas (siempre se
aade al lado y nunca encima de la muestra porque est caliente y
quema las bacterias) y mezclar cuidadosamente dando movimientos
circulares a la placa sin levantarla, para distribuir el inculo de
manera uniforme. Dejar solidificar sobre una superficie horizontal sin
tapar del todo y cerca de la llama del mechero.
3-Una vez solidificado aadir otros 9ml del mismo medio VRBG, para
evitar el crecimiento en superficie, y dejar solidificar.
4-Incubar en estufa a 37C, 24h.
5-Contar las colonias tpicas y expresar los resultados como UFC/g o
ml muestra.

RESULTADO:

Han crecido muchas colonias de

color rojo violeta rodeadas de un
halo violeta. Nos quedamos con las
placas procedentes de dilucin
1/1000 que estn ms aisladas,
aun as hay ms de 300UFC, por lo
que decimos que son incontables.

Resultado recuento:>300UFC x
1000(inverso del factor de dilucin) = > 300.000UFC =
Incontables UFC/g muestra contaminada
con Citrobacter
Interpretacin: El nmero elevado indica elaboracin poco higinica o
contaminacin despus de fabricacin.(Es lgico, hemos contaminado
apropsito).Por el color y forma de estas colonias tpicas podemos
decir que las bacterias fermentan la glucosa y consideramos que son
sospechosas de pertenecer a la familia Enterobacteriaceae, pero es
necesario hacer unas pruebas de confirmacin.

PREVIO A LAS PRUEBAS DE CONFIRMACIN:

TINCIN DE GRAM:
Realizamos una Tincin de Gram para ver si son bacilos (las
Enterobacterias son bacilos gram negativos), para ello se coge una
colonia tpica directamente de las placas de VRBG, hay que romper un
poco el agar ya que las bacterias estn en medio del agar.
Al hacer la tincin de Gram y observar al microscopio con el objetivo
de inmersin vemos bacilos rosas y estn aislados. Son bacilos gram
negativos, lo cual es lgico ya que habamos contaminado con
Citrobacter.
RESIEMBRA (DE LAS PLACAS VRBG)
PICO DE FLAUTA:

EN TUBOS DE PCA EN

Se hace para tener cultivos jvenes y en un medio sin color que no

interfiera. Vamos a resembrar 6 tubos de PCA. Cogemos con el asa de
platino previamente flameada una colonia tpica de la placa VRBG
(para ello hay que romper un poco el agar), y la sembramos en el
tubo de PCA haciendo estras muy juntas para obtener masa
bacteriana.

Incubar en estufa a 37C, 48h (mnimo 24h).

Resultado: vemos que ha habido crecimiento en el pico de flauta,
tenemos masa bacteriana de color blanquecino que sospechamos son
Enterobacterias. Con el crecimiento obtenido se realizan las pruebas
de confirmacin.

PRUEBAS DE CONFIRMACIN:
1-PRUEBA DE LA CITOCROMO-OXIDASA.
OBJETIVO:
Diferenciar colonias sospechosas de pertenecer a la familia
Enterobacteriaceae (todas oxidasa - ), e identificar las sospechosas
de pertenecer a otros gneros como Aeromonas, Pseudomonas,
Vibrio (en general +).
FUNDAMENTO:
Se investiga la presencia de la enzima citocromo-oxidasa. La prueba
se basa en la utilizacin de un reactivo (di o tetrametil pfenilendiamina. Reactivo de Kovacs) que en estado reducido es
incoloro, pero en presencia de esta enzima y de oxgeno se oxida y
forma azul de indofenol (azul-violeta)
p-fenilendiamina reducida (incolora) + 02 + citocromoxidasa azul
de indofenol oxidado (azul-violeta)
Esta reaccin acta en el ltimo eslabn de la cadena respiratoria
transfiriendo electrones desde un substrato al oxigeno dando lugar a
la formacin de agua.
MATERIAL Y REACTIVOS:
-Tubo de PCA en pico de flauta con cultivo sospechoso de fam
Enterobacteriaceae
-Asa de siembra estril, de plstico
-Tiras reactivas, pinzas y porta limpio.
TCNICA:
1-Dejar atemperar el tubo de PCA resembrado
2-Leer instrucciones del fabricante. (Cada marca comercial tiene su
tcnica y lectura)

3-Sacar una tira reactiva con ayuda de unas pinzas, cogindola por
el extremo y la colocamos sobre un porta limpio.
4-Con el asa de plstico estril, coger una colonia que est aislada y
depositarla en el otro extremo de la tira reactiva.
5-A los 10 segundos hacer la lectura del resultado: Si cambia
despus de 10 segundos indica oxidasa positivo, y si a los 10 minutos
no cambia de color indica oxidasa negativo.
Todos los pasos se hacen siempre cerca de la llama del mechero. Y la
tira utilizada se tratar como material contaminado por lo que habr
que meterla en una bolsa de autoclave para descontaminar, junto con
las placas, en el autoclave.
RESULTADO: No hay aparicin de color. Es oxidasa ( - )
Interpretacin: Se trata de bacterias que no tienen la enzima
citocromo-oxidasa y podemos afirmar que pertenecen a la familia
Enterobacteriaceae.
OBSERVACIONES:
Para esta prueba son fundamentales algunas precauciones:
-Seguir las instrucciones del fabricante. Guardar las tiras siempre en
su bote y protegidas de la luz.
-Que la colonia se tome de un medio no coloreado, para que no
interfiera en la reaccin (por eso resembramos en PCA que no es
coloreado).
-Utilizar asa de plstico (estril y desechable), porque la de metal
puede interferir en la reaccin.

2-PRUEBA DE FERMENTACIN, GAS Y SH2 SOBRE

AGAR KLIGLER.
OBJETIVO:
Identificacin de Enterobacterias segn su capacidad para fermentar
determinados hidratos de carbono incorporados al medio de cultivo,
con produccin o no de gases, junto con la posible produccin de SH2.
FUNDAMENTO:

Como medio de cultivo se emplea Agar Hierro de Kligler (contiene

glucosa y lactosa).Y se prepara en posicin inclinada en pico de flauta
con una capa basal profunda (zona anaerobia).
Se investigan tres formas bsicas de fermentacin: fermentacin de
glucosa, fermentacin de glucosa y lactosa, no fermentacin de
glucosa ni lactosa. En la fermentacin se producen sustancias cidas
que viran el color del indicador (Rojo Fenol) del medio y adems se
puede producir o no gas (CO2). La produccin de SH 2 viene indicada
por la formacin de sulfuro frrico de color negro al reaccionar con las
sales de hierro (sulfato ferroso) del medio.
Lectura e Interpretacin del resultado:
- Viraje de rojo a amarillo en la lengeta Lactosa positivo
- Viraje de rojo a amarillo en el fondo del tubo Glucosa positivo
- Agar ms o menos roto Produccin de gas en la fermentacin de la
glucosa
- Aparicin de color negro en el medio Produccin de SH 2 (el color
negro puede enmascarar la respuesta cida del medio (amarillo), por
tanto si se produce SH2 es que existe condicin cida, aunque no se
observe).
MATERIAL:
- 11 Tubos ensayo con tapn de rosca
magntico, Autoclave
- Matraz Erlenmeyer 250ml
- Hilo de siembra de platino
corriente en laboratorio.

- Balanza, Agitador
- Mechero Bunsen.
- Material de uso

TCNICA:
1 Vamos a preparar el medio de cultivo Agar Hierro de Kligler (AHK)
en pico de flauta
Grupo 4Preparar 11 tubos. 11tubos x 10ml/tubo = 110ml; Vamos a
preparar 150ml.
Instrucciones del fabricante: Aadir 58g del polvo a 1L de agua
destilada y llevar a ebullicin. Distribuir en tubos y esterilizar a 121C
durante 15 minutos. Dejar solidificar con una corta cua y fondo
abundante.

Por tanto: 58g/1000ml x 150ml = 8,7g pesamos y 150ml agua

destilada.
Los pasos a seguir son similares a la preparacin de otros medios. Al
sacar los tubos del autoclave, los dejamos solidificar de forma
inclinada dentro de la campana, y una vez fros los metemos en el
frigorfico hasta el momento de la siembra.
Color del medio de cultivo: color rojo.
2 Sacar del frigorfico y dejar atemperar los tubos de AHK en pico de
flauta donde vamos a sembrar, y el tubo de PCA de agar inclinado de
la resiembra con posibles colonias de Enterobacterias.
3 Con el hilo de siembra de platino, previamente flameado, cogemos
una colonia del tubo de PCA y lo vamos a sembrar en el tubo Kligler.
4 Siembra en picadura y en estras: flameamos la boca del tubo
Kligler y pinchamos en vertical sin llegar al fondo (para que quede
una cmara anaerobia) y lo sacamos por el mismo sitio que hemos
pinchado. Y sin coger ms masa bacteriana sembramos haciendo
estras en el pico de flauta.
5 Flamear la boca del tubo Kligler y tapar. Flamear el hilo de
siembra.
6 Incubar en la estufa a 37C, 24h. Fecha de siembra: 2/11/16
RESULTADOS:
3 tubos presentan estas caractersticas: lengeta y
fondo han virado a amarillo, el agar est algo roto,
y hay color negro en el medio.
2
tubos
anmalos,
posiblemente
porque
sembramos mucha masa bacteriana y al incubar y
crecer agotan la glucosa del medio y revira el
medio.
LECTURA: A/AG SH2

Fecha de lectura: 3/11/16

Interpretacin: Se trata de bacterias lactosa +,

glucosa +, que producen gas y que producen SH 2.
Se confirma por tanto
que pertenecen
Enterobacteriaceae.

la

familia