Contenido
i.
Lista
ii.
3
Lista
iii.
3
Lista
iv.
3
Resumen
de
ilustraciones
de
tablas
de
ecuaciones
4
1. Introduccin
4
2. Antecedentes
5
2.1
Sntesis
de
la
melanina
5
2.2 La mutacin que causa albinismo oculocutneo OCA1A
5
2.3 Genes asociados al albinismo oculocutneo (OCA)
6
2.4 Mtodos
de
clculo
7
3. Hiptesis
8
4. Objetivos
8
4.1
generales
objetivos
particulares
9
5. Metodologa
9
5.1
mtodo
de
gota
colgante
hanging
drop
9
5.2 Materiales
10
5.3 Desarrollo
del
experimento
10
2
5.4
Obtencin
10
5.5 Difraccin
del
de
rayos
para
cristal
la
obtencin
de
de
la
rayos
11
5.7 Obtencin de datos para generar la estructura de la
protena T373K
11
5.8 Utilizacin del programa PDB Viewer (Deep View)
13
5.9 Manipulacin de la protena T373K mediante Deep
View
6. Modificacin
de
13
la
estructura
T373K
14
7. Conclusiones
14
8. Bibliografa
15 y 16
i.
Lista de ilustraciones
.8
Figura 6. Esquema general del mtodo de gota colgante, que consta de la
obtencin de cristales de suficiente tamaos .
9
Figura 7. Esquema general del mtodo de gota colgante para la solucin a
pipetar.10
Figura 8. Fenmenos fsicos involucrados en la exposicin de un cristal a
los rayos X. Dispersin elstica o de Thomson, inelstica o de compton,
efecto
fotoelctrico
y
generacin
de
especies
radio
lticas
..11
Figura 9. Este proceso es un esquema general que ilustra el proceso de
resolucin de estructuras moleculares y cristalinas mediante la difraccin de
rayos
X,
este
proceso
consta
de
diferentes
pasos
..12
ii.
Lista de tablas
iii.
Listas de ecuaciones
T373K es una de las muchas protenas mutantes producidas en el gen TYR que
codifica para la enzima tirosinasa involucrada en el metabolismo de la
melanina. T373K fue catalogada como una protena con alto efecto perjudicial
ya que afecta considerablemente las propiedades dinmicas de la protena TYR
nativa.
Con el presente anteproyecto se pretende comprender el papel estructural en
la protena T373K que produce la mutacin en la cascada de sealizacin para
la produccin de la melanina en el albinismo de tipo OCA1A, producida por el
gen TYR.
1. Introduccin
El albinismo oculocutneo (OCA) es una enfermedad gnica recesiva que
afecta la biosntesis de la melanina que se caracteriza por una reduccin en la
pigmentacin del cabello, la piel y los ojos [2].
Esta causada por mutaciones que afectan a los melanocitos, clulas
productoras del pigmento melanina que da color a ciertas partes del cuerpo
como el cabello, la piel y los ojos. La melanina es un pigmento que se forma
como producto final del metabolismo de la tirosina el cual es un aminocido.
Una deficiencia en la sntesis de tirosina produce una inhibicin en la sntesis
de melanina y por lo tanto falta de pigmentacin [3].
2. Antecedentes
2.1 Sntesis de la melanina
TYR es una enzima que contiene cobre la cual cataliza los dos primeros pasos
en la va de la biosntesis de la melanina, la conversin de la tirosina en Ldihidroxi-fenilalanina (DOPA) y posteriormente la dopaquinona [6].
2.4
Mtodos de clculo
Los cuales arrojaron los datos de la distribucin de nsSNPs en el gen TYR, las
barras rojas indican el porcentajes de nsSNPs que resulto ser nocivo y las
barras azules indican el porcentaje de nsSNPs que son tolerados (ver figura 5)
[12].
10
5.2 Materiales
Se utilizara el JBS Kit de iniciacin a la cristalizacin proteica que contiene todo
el material necesario partiendo de una protena [13].
Realizacin del Experimento Segn el Mtodo de Gota Colgante
La protena T373K se cristalizara equilibrando la gota de dicha protena diluida
en la solucin de cristalizacin contenida en el pocillo por medio de una placa
de cristalizacin sellada. Para ello se utilizara un sistema de acetato de
sodio/NaCl, teniendo en cuenta que la cristalizacin depender en gran parte
del valor de PH del tampn y la concentracin de NaCl.
El test se realizara con un PH entre 4,0 y 5,2 en combinacin con una
concentracin del NaCl de entre 4% y 9% (Weiss, 2015).
5.3
Figura 7: Esquema general del mtodo de gota colgante para la solucin a pipetar [6].
Se tendr que pipetar 1 l de solucin proteica y 1 l de solucin del pocillo en una
lmina circular. Primero colocaremos una gota de la solucin proteica en una lmina,
despus aplicaremos con cuidado la solucin del pocillo sobre cada gota y con ayuda
de una pinza procederemos a coger las lminas y darles vuelta cuidadosamente con la
gota hacia abajo y colocarlo sobre los pocillos. Presionaremos ligeramente para que la
silicona cierre hemticamente el pocillo.
11
5.5
Difraccin de rayos X para la obtencin de la estructura de
la protena T373K
5.6 Generalidades de la difraccin de rayos X
La cristalografa de rayos X nos proporciona la imagen ms adecuada que
podemos tener de las estructuras cristalinas (el 85% de los depsitos en el PDB
fueron obtenidos por esta tcnica). Los mtodos de difraccin de rayos X
constituyen la herramienta ms poderosa de que se dispone. La mayor parte
de la informacin que poseemos de las estructuras internas cristalinas es
mediante la tcnica de difraccin de rayos X [14].
Los rayos X interaccionan con la materia a travs de los electrones que la
forman y que se estn moviendo a velocidades mucho menores que la luz [14].
Cuando un cristal es expuesto a una fuente de rayos X, estos puedes ser
absorbidos (dispersin inelstica), difractados por los arreglos peridicos y
ordenados de electrones presentes en los tomos de cristal (dispersin
elstica) (2% de interaccin entre los rayos X y el cristal de protena) , o
simplemente pasar de largo por el cristal ( 98% de los rayos X incididos)
(hutch).
El fenmeno de dispersin elstica denominado tambin dispersin de
Thomson corresponde al 0.16% del total de rayos X incididos y es responsable
de la generacin de un patrn de difraccin el cual permite la determinacin
final de la estructura cristalina de la protena (ver figura 8)
12
hx ( j )+ ky ( j ) +lz( j)
2. i
F ( hkl )= jfj e
Ecuacin 1: ecuacin de Fourier para resolver el problema de fases
( xyz )=
1
( h ) ( k ) ( l ) F ( hkl ) cos 2[hx+ ky+ lz ( hkl ) ]
V
n=2 d sin
Ecuacin 3: ecuacin de bragg
afinamiento (el modelo es aceptable para protenas cuando R=0.1), lo cual nos
permitir el anlisis de la estructura T373K y sus implicaciones Biolgicas [11].
14
7. Conclusiones
Mediante el procedimiento de difraccin de rayos X podremos
analizar la estructura tridimensional de la protena mutante T373k y
podremos deducir si dicha mutacin afecta al sitio cataltico del
dominio tirosinasa provocando que la enzima implicada en la
produccin de melanina (tirosinasa) no se exprese.
15
8. Bibliografa
1 revista investigacin y ciencia Raymond Boissy, profesor de dermatologa
2 Review, Oculocutaneous albinism ,Karen Grnskov, Jakob Ek and Karen
Brondum-Nielsen
3 Shin Hae P, Hyojin Ch, Yonggoo K, Myungshin K (2012) Molecular Analysis Of
Korean Patients With Oculocutaneous Albinism.
4 A. Gargiulo, F. Testa, S. Rossi et al., Molecular and clinical characterization of
albinism in a large cohort of Italian patients, Investigative Ophthalmology and
Visual Science. Mutational Analysis of Oculocutaneous Albinism: A Compact
Review
5 C. F.Wildsoet, P. J. Oswald, and S. Clark, Albinism: its implications for
refractive development, Investigative Ophthalmology , B. Kasmann-Kellner, K.
Hille, and B. Pfau, Eye and general illnesses in the public school for the blind
and usually handicapped students in Saarland development in the last 20
years,.
6 C. J. Cooksey, P. J. Garratt, E. J. Land et al., Evidence of the indirect formation
of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation
kinetics of tyrosinase, The Journal of Biological Chemistry.
7 Y. Tomita, A. Takeda, S. Okinaga, H. Tagami, and S. Shibahara, Human
oculocutaneous albinism caused by single base insertion in the tyrosinase
gene, Biochemical and Biophysical Research Communications.
8 B. S. Kwon, A. K. Haq, S. H. Pomerantz, and R. Halaban, Isolation and
sequence of a cDNA clone for human tyrosinase that maps at the mouse calbino locus, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America.
9 Mutational analysis of TYR gene and its structural consequences in OCA1A
10 Wiederstein,M., Sippl,M.J., 2007. ProSA-web: interactiveweb service for the
recognition of
16
Bibliografa de figuras
1 Albinism-Causing Mutations in Recombinant Human Tyrosinase Alter Intrinsic
Enzymatic Activity, figura 6.
2 Two Novel Tyrosinase (TYR) Gene Mutations with Pathogenic Impact on
Oculocutaneous Albinism Type 1 (OCA1), figura 2.
3 Mutational Analysis of Oculocutaneous Albinism: A Compact Review, table 1.
4 Texto de bioqumica para estudiantes de medicina, capitulo 17 pginas 205
5 Albinism-Causing Mutations in Recombinant Human Tyrosinase Alter Intrinsic
Enzymatic Activity
6 Manual JBS kit de iniciacin a la cristalizacin de protenas
7 "Crystallography-Cristalografia" (Departmento de Cristalografa y Biologa
Estructural)
8 Mutational analysis of TYR gene and its structural consequences in OCA1A
9 Tesis preservacin de la informacin cristalogrfica en los centros metlicos
de la oxidase multicobre de thermo thermophilus, Eduardo Rosas Bentez.
10 Presentacin Perspectivas de la Cristalografa Biolgica en Mxico por el Dr.
Enrique Rudio Piera IBT-UNAM
17