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UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE MORELOS

Ante proyecto en Ciencias Bioqumicas


Estructura T373K como clave para el entendimiento de OCA1A
PRESENTA:
Mara Fernanda Francia Contreras

TUTOR PRINCIPAL: M.C. FRANCISCA VILLANUEVA FLORES


INSTITUTO DE BIOTECNOLOGA-UNAM

CUERNAVACA, MORELOS. JUNIO, 2016

Contenido
i.

Lista

ii.

3
Lista

iii.

3
Lista

iv.

3
Resumen

v.

4
Abstrac

de

ilustraciones
de

tablas

de

ecuaciones

4
1. Introduccin
4
2. Antecedentes
5
2.1

Sntesis

de

la

melanina

5
2.2 La mutacin que causa albinismo oculocutneo OCA1A
6
2.3 Genes asociados al albinismo oculocutneo (OCA)
6
2.4 Mtodos

de

clculo

7
3. Hiptesis
8
4. Objetivos
8
4.1

generales

objetivos

particulares

8
5. Metodologa
9
5.1

Obtencin del cristal de la protena T373K mediante el

mtodo

de

gota

colgante

hanging

drop

9
5.2 Materiales
9
2

5.3

Desarrollo

del

10
5.4 Obtencin
10
5.5 Difraccin

experimento
del

de

rayos

para

cristal
la

obtencin

estructura de la protena T373K


5.6 Generalidades
de
la
difraccin

de

de

la

rayos

10
5.7 Obtencin de datos para generar la estructura de la
protena T373K
6. Conclusiones

11

13
7. Bibliografa
14 y 15

i.

Lista de ilustraciones

Figura 1. Va esquemtica de dos de los primeros pasos de la va de


biosntesis
de
melanina
regulada
por
la
tirosina
..pg. 4
Figura 2. Esquematizacin de la sintesis de la melanina, los pasos 1 y 2
tienen
la
misma
enzima
,
tirosinasa
. 5
Figura
3.
Esquema
de
los
componentes
TYR...6
Figura
4.
Estructura
atmica
de
humana.6

la

del

gen

tirosinasa

Figura 5. Distribucin de nsSNPs previstos en el gen TYR, diagrama de


barras que indican el deletreo y nsSNPs benignos por SIFT, PolyPhen,
mutante I-2.0 y PANTHER.8
Figura
6.
Esquema
general
del
colgante ..9

mtodo

de

gota

Figura 7. Esquema general del mtodo de gota colgante para la solucin a


pipetar.10
Figura 8. Fenmenos fsicos involucrados en la exposicin de un cristal a
los rayos X. Dispersin elstica o de Thomson, inelstica o de compton,
efecto
fotoelctrico
y
generacin
de
especies
radio
lticas
..11
Figura 9.
Esquema general del mtodo de difraccin de rayos
X..12

ii.

Lista de tablas

Tabla 1. Mutaciones detectadas en el albinismo OCA1A asociadas a


su gen..7

iii.

Listas de ecuaciones

Ecuacin
1.
Ecuacin
de
Fourier..
11
Ecuacin 2. Transformada de Fourier, la cual nos dar el mapa de
densidad
electrnica
para
deducir
la
estructura
de
la
molcula.12
Ecuacin
3.
Ecuacin
de
Bragg.
.12

iv. Resumen
El albinismo es una enfermedad gentica responsable de la prdida parcial o
completa de pigmentacin, es decir, del color de la piel, los ojos o el pelo que
es causada por mutaciones en las clulas productoras del pigmento melanina
[0].
4

Con el presente anteproyecto se pretende comprender el papel estructural en


la protena T373K que produce la mutacin en la cascada de sealizacin para
la produccin de la melanina en el albinismo de tipo OCA1A, producida por el
gen TYR.

V. Abstrac
Albinism is a genetic disease responsible for the partial or complete loss of
pigmentation, the color of the skin, eyes or hair that is caused by mutations in
the cells producing pigment melanin [0].
With this draft is to understand the structural role in T373K mutation produces
protein in the signaling cascade for the production of melanin in the OCA1A
albinism type, produced by the gene "TYR".

1. Introduccin
El albinismo oculocutneo (OCA) es un grupo de trastornos hereditarios de la
biosntesis de la melanina que se caracteriza por una reduccin generalizada
en la pigmentacin del cabello, la piel y los ojos [1].
Esta causada por mutaciones que afectan a los melanocitos, clulas
productoras del pigmento melanina que da color a ciertas partes del cuerpo
como el cabello, la piel y los ojos. La melanina es un pigmento que se forma
como producto final del metabolismo de la tirosina el cual es un aminocido.
Una deficiencia en la sntesis de tirosina produce una inhibicin en la sntesis
de melanina y por lo tanto falta de pigmentacin [2].

Figura 1: va esquemtica de dos de los primeros pasos de la va de biosntesis


de melanina regulada por la tirosina [1]
El albinismo afecta a una de cada 20,000 personas en todo el mundo, pero la
prevalencia de los subtipos individuales vara entre los diferentes orgenes
tnicos [3]. Se han definido dos tipos principales de albinismo:

albinismo oculocutneo (OCA)


albinismo ocular (OA)

El albinismo oculocutneo (OCA) es la ausencia total o parcial de pigmento


debido a un defecto en una enzima implicada en la produccin de la melanina.
Este tipo de albinismo se divide en varios subtipos OCA1A, OCA1B, OCA2,
OCA3, OCA4. El albinismo ocular (OA) los ojos padecen del pigmento de
melanina mientras que el cabello y la piel tienen coloracin normal. Los dos
5

tipos de albinismo tienen cierta falta de pigmentacin, pero la cantidad es


diferente dependiendo del tipo [4].
Las actuales opciones de tratamiento para la enfermedad de albinismo se
limitan a intentos de corregir la visin y la orientacin para promover el uso de
protector solar, lo cual cabe destacar que no existe ningn tratamiento con
frmacos que intente corregir de manera integral e interna estos trastornos.

2. Antecedentes
2.1 Sntesis de la melanina
TYR es una enzima que contiene cobre la cual cataliza los dos primeros pasos
en la va de la biosntesis de la melanina, la conversin de la tirosina en Ldihidroxi-fenilalanina (DOPA) y posteriormente la dopaquinona [5].

Figura 2: esquematizacin de la sintesis de la melanina, los pasos 1 y 2 tienen


la misma enzima , tirosinasa [4].
Formacin de DOPA: el primer paso es la hidroxilacin de la tirosina mediante
la tirosinasa. Se usa oxigeno molecular para la reaccin, uno de los tomos es
incorporado en el producto para formar dihidroxifenilalanina o DOPA.
Formacin de DOPAquinona: la tirosinasa acta de nuevo sobre la DOPA para
formar DOPAquinona
Formacin de Indolquinona: la DOPAquinona es convertida en Indolquinona a
travs de una serie de reacciones que implican la descarboxilacin y la
oxidacin de la cadena lateral. La Indolquinona se polimeriza para formar
melanina. La melanina es un grupo de polmeros de estructura variada formada
a partir de Indolquinona.
2.2 La mutacin que causa albinismo tipo OCA1A
El albinismo oculocutneo del tipo 1A se caracteriza por una falta total de la
produccin de la melanina durante toda la vida y es causada en el gen TYR [8].
6

2.3 Genes asociados con el albinismo oculocutneo (OCA)


OCA1 es la forma ms grave de albinismo causada por mutaciones en el gen
de la tirosinasa (TYR) en el cromosoma 11q14.3 [6]. Este gen consta de 5
exones que abarcan alrededor de 65 kb de DNA genmico que codifica una
protena llamada tirosinasa y consiste de 529 aminocidos [7]

Figura 3: Esquema de los componentes del gen TYR [2]

La estructura atmica de la tirosinasa humana no ha sido determinada pero en


base a la secuencia de la enzima, se predice que contiene varios dominios
funcionales (ver figura 4), entre ellos:
EGF ( factor de crecimiento epidermial)
Tirosinasa enzimtico
Los cuales son parte de un dominio globular anclado por la tran-smembrana
que se extiende en el compartimiento vacular de melanosomas, el organelo
intracelular que compartimenta la melanina [10].

Figura 4 [5]

Se han detectado hasta 303 mutaciones en el gen TYR donde casi todas son
conocidas (ver tabla 1).Todas estas mutaciones estn implicadas en la
produccin de albinismo de tipo OCA1A y OCA1B [3].

Tabla1 [3]

2.4

Mtodos de clculo

Se analizaron variaciones genticas que podran cambiar el comportamiento


funcional mediante la alteracin de la estructura TYR. Las consecuencias de la
mutacin sobre la estructura TYR fueron observados por el anlisis de
comportamiento de flexibilidad de la protena tirosinasa nativa y mutante [9].
TYR nativa y TYR mutante fueron analizadas para la prediccin de nsSNPs
mediante los programas:
SIFT
PolyPhen
PANTHER
I-2 mutante

Los cuales arrojaron los datos de la distribucin de nsSNPs en el gen TYR, las
barras rojas indican el porcentajes de nsSNPs que resulto ser nocivo y las
barras azules indican el porcentaje de nsSNPs que son tolerados (ver figura 5)
[11].

Figura 5 [8]
Mediante el programa l-mutante se detectaron que las mutaciones T373K,
N371Y, M370T y P313R tienen un alto efecto perjudicial sobre la protena de
TYR que es responsable de la OCA1A por tener los
parmetros ms
exergonicos (-3 a -4 KJ/mol) [11].
El anlisis de variantes de OCA1A, mostro que T373K tiene el efecto ms
perjudicial al ser la ms exergonica afectando las propiedades dinmicas de la
protena dando lugar al albinismo tipo 1A [11].
Debido a la mutacin en la protena TYR se ampli la estructura geomtrica por
lo tanto T373K tiene ms efecto sobre la geometra estructural que otras
mutaciones.
La mutante T373K tiene los valores ms elevados, lo cual indico que es
responsable sobre la desestabilizacin de la estructura TYR por lo tanto tiene
un alto efecto perjudicial sobre la protena TYR nativa [8].
3. Hiptesis
La mutacin T373K afecta el sitio cataltico del dominio de la tirosinasa
provocando que la enzima tirosinasa no se exprese y por tanto se produzca
OCA1A.
4. Objetivo general
Determinar la estructura de T373K la cual nos ayude a comprender ms el
papel de esta y como puede afectar en sus funciones catalticas a TYR nativa.
4.1 Objetivo particular
1. Analizar los cambios significativos en la estructura de T373K.
2. Determinar las consecuencias del cambio estructural producido
por el cambio de un solo aminocido mediante la tcnica de

difraccin de rayos X la cual nos ayudara a obtener su


estructura para evaluar los cambios conformacionales producidos.
5. Metodologa
5.1 Obtencin de cristal de la protena T373K mediante el mtodo de
gota colgante o hanging drop
Para poder obtener la estructura tridimensional de nuestra protena de inters
T373K utilizaremos el mtodo de cristalografa de rayos x. El primer paso
para poder obtener la estructura T373K por medio de cristalografa ser la
obtencin de cristales de suficiente tamao, este mtodo se conoce como gota
colgante o hanging drop el cual consiste en colocar unos cuantos micro litros
de la solucin de protena en el centro de un cubre objetos y se le aadir
otros micro litros de la solucin de precipitante, al cual previamente se le ha
equilibrado su PH mediante un tampn. El resultado que veremos ser que las
concentraciones de la protena y del precipitante aumentaran lentamente en la
gota, y si utilizamos las condiciones adecuadas, obtendremos nuestra muestra
de cristal para proceder con nuestro objetivo [12].

Figura 6: Esquema general del mtodo de gota colgante [7]

5.2 Materiales
Se utilizara el JBS Kit de iniciacin a la cristalizacin proteica que contiene todo
el material necesario partiendo de una protena [12].
Realizacin del Experimento Segn el Mtodo de Gota Colgante
La protena T373K se cristalizara equilibrando la gota de dicha protena diluida
en la solucin de cristalizacin contenida en el pocillo por medio de una placa
de cristalizacin sellada. Para ello se utilizara un sistema de acetato de

10

sodio/NaCl, teniendo en cuenta que la cristalizacin depender en gran parte


del valor de PH del tampn y la concentracin de NaCl.
El test se realizara con un PH entre 4,0 y 5,2 en combinacin con una
concentracin del NaCl de entre 4% y 9% (Weiss, 2015).
5.3

Desarrollo del experimento

En este estudio experimental, se utilizara un mtodo descrito previamente para


la obtencin de cristales. Aplicamos en los pocillos de cristalizacin silicona
usando una jeringa y esparcindolo uniformemente sobre los bordes circulares
del pocillo de cristalizacin.
Procederemos a pipetar la solucin en el pocillo siguiendo el esquema del
mtodo de gota colgante, el volumen total por pocillo ser de 1ml, y la
concentracin del tampn tras ser mezclado con el precipitante y con agua debe ser 50
mM tal como se muestra en la figura 5.

Figura 7: Esquema general del mtodo de gota colgante para la solucin a pipetar [6].
Se tendr que pipetar 1 l de solucin proteica y 1 l de solucin del pocillo en una
lmina circular. Primero colocaremos una gota de la solucin proteica en una lmina,
despus aplicaremos con cuidado la solucin del pocillo sobre cada gota y con ayuda
de una pinza procederemos a coger las lminas y darles vuelta cuidadosamente con la
gota hacia abajo y colocarlo sobre los pocillos. Presionaremos ligeramente para que la
silicona cierre hemticamente el pocillo.
5.4 Obtencin del cristal
Se conservaran las placas preparadas en una habitacin con una temperatura
constante (20-22C). Se observara a toda profundidad la gota de protena en el
microscopio.

5.5
Difraccin de rayos X para la obtencin de la estructura de
la protena T373K
5.6 Generalidades de la difraccin de rayos X
La cristalografa de rayos X nos proporciona la imagen ms adecuada que
podemos tener de las estructuras cristalinas (el 85% de los depsitos en el PDB
11

fueron obtenidos por esta tcnica). Los mtodos de difraccin de rayos X


constituyen la herramienta ms poderosa de que se dispone. La mayor parte
de la informacin que poseemos de las estructuras internas cristalinas es
mediante la tcnica de difraccin de rayos X [13].
Los rayos X interaccionan con la materia a travs de los electrones que la
forman y que se estn moviendo a velocidades mucho menores que la luz [13].
Cuando un cristal es expuesto a una fuente de rayos X, estos puedes ser
absorbidos (dispersin inelstica), difractados por los arreglos peridicos y
ordenados de electrones presentes en los tomos de cristal (dispersin
elstica) (2% de interaccin entre los rayos X y el cristal de protena) , o
simplemente pasar de largo por el cristal ( 98% de los rayos X incididos)
(hutch).
El fenmeno de dispersin elstica denominado tambin dispersin de
Thomson corresponde al 0.16% del total de rayos X incididos y es responsable
de la generacin de un patrn de difraccin el cual permite la determinacin
final de la estructura cristalina de la protena (ver figura 6)

Figura 8 [9]

5.7 Obtencin de datos para generar la estructura de la protena


T373K
Con la obtencin de nuestros monocristales de >10 m (de la protena mutante
T373K), estos sern exportados a rayos X monocromticos (en un sincrotrn o
usando un generador de nodo rotatorio) del cual obtendremos los patrones de
difraccin que nos lleven al problema de fases, el cual se resolver mediante el
mtodo de transformada de Fourier (ver ecuacin 1 y 2) que nos dar el mapa
12

de densidad electrnica de la protena mutante T373K, es decir, la


representacin tridimensional de la densidad electrnica de la molcula. Este
mapa es la herramienta fundamental que permite deducir la estructura de la
molcula. Tambin a partir de los patrones de difraccin obtenidos por los
rayos monocromticos podremos obtener el afinamiento el cual el
resolveremos mediante la ley de Bragg (ver ecuacin 3) [13].

hx ( j )+ ky ( j ) +lz( j)
2. i
F ( hkl )= jfj e
Ecuacin 1: ecuacin de Fourier

La transformada de Fourier permite rescribir la ecuacin como:

( xyz )=

1
( h ) ( k ) ( l ) F ( hkl ) cos 2[hx+ ky+ lz ( hkl ) ]
V

Ecuacin 2: transformada de Fourier la cual nos da el mapa de densidad


electrnica para deducir la estructura de la molcula T373K.

n=2 d sin
Ecuacin 3: ecuacin de bragg

Esto nos arrojara la densidad electrnica de la cual se obtendrn las


coordenadas de cada tomo en el cristal para la construccin del modelo y
afinamiento (el modelo es aceptable para protenas cuando R=0.1), lo cual nos
permitir el anlisis de la estructura T373K y sus implicaciones Biolgicas [10].

13

Figura 9: Esquema general del mtodo de difraccin de rayos X [10]

6. Conclusiones
Mediante el procedimiento de difraccin de rayos X podremos
analizar la estructura tridimensional de la protena mutante T373k y
podremos deducir si dicha mutacin afecta al sitio cataltico del
dominio tirosinasa provocando que la enzima implicada en la
produccin de melanina (tirosinasa) no se exprese.

14

7. Bibliografa
0 revista investigacin y ciencia Raymond Boissy, profesor de dermatologa
1 Review, Oculocutaneous albinism ,Karen Grnskov, Jakob Ek and Karen
Brondum-Nielsen
2 Shin Hae P, Hyojin Ch, Yonggoo K, Myungshin K (2012) Molecular Analysis Of
Korean Patients With Oculocutaneous Albinism.
3 A. Gargiulo, F. Testa, S. Rossi et al., Molecular and clinical characterization of
albinism in a large cohort of Italian patients, Investigative Ophthalmology and
Visual Science. Mutational Analysis of Oculocutaneous Albinism: A Compact
Review
4 C. F.Wildsoet, P. J. Oswald, and S. Clark, Albinism: its implications for
refractive development, Investigative Ophthalmology , B. Kasmann-Kellner, K.
Hille, and B. Pfau, Eye and general illnesses in the public school for the blind
and usually handicapped students in Saarland development in the last 20
years,.
5 C. J. Cooksey, P. J. Garratt, E. J. Land et al., Evidence of the indirect formation
of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation
kinetics of tyrosinase, The Journal of Biological Chemistry.
6 Y. Tomita, A. Takeda, S. Okinaga, H. Tagami, and S. Shibahara, Human
oculocutaneous albinism caused by single base insertion in the tyrosinase
gene, Biochemical and Biophysical Research Communications.
7 B. S. Kwon, A. K. Haq, S. H. Pomerantz, and R. Halaban, Isolation and
sequence of a cDNA clone for human tyrosinase that maps at the mouse calbino locus, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America.
8 Mutational analysis of TYR gene and its structural consequences in OCA1A
9 Wiederstein,M., Sippl,M.J., 2007. ProSA-web: interactiveweb service for the
recognition of
errors in three-dimensional structures of proteins.
15

10 Human Gene Mutation Database, HGMD professional


11 Wiederstein,M., Sippl,M.J., 2007. ProSA-web: interactiveweb service for the
recognition of
errors in three-dimensional structures of proteins.
12 Manual JBS kit de iniciacin a la cristalizacin de protenas
13 cristalografa- UNAM PDF

Bibliografa de figuras
1 Albinism-Causing Mutations in Recombinant Human Tyrosinase Alter Intrinsic
Enzymatic Activity, figura 6.
2 Two Novel Tyrosinase (TYR) Gene Mutations with Pathogenic Impact on
Oculocutaneous Albinism Type 1 (OCA1), figura 2.
3 Mutational Analysis of Oculocutaneous Albinism: A Compact Review, table 1.
4 Texto de bioqumica para estudiantes de medicina, capitulo 17 pginas 205
5 Albinism-Causing Mutations in Recombinant Human Tyrosinase Alter Intrinsic
Enzymatic Activity
6 Manual JBS kit de iniciacin a la cristalizacin de protenas
7 "Crystallography-Cristalografia" (Departmento de Cristalografa y Biologa
Estructural)
8 Mutational analysis of TYR gene and its structural consequences in OCA1A
9 Tesis preservacin de la informacin cristalogrfica en los centros metlicos
de la oxidase multicobre de thermo thermophilus, Eduardo Rosas Bentez.
10 Presentacin Perspectivas de la Cristalografa Biolgica en Mxico por el Dr.
Enrique Rudio Piera IBT-UNAM

16