Una definicin
El genoma no solamente contiene genes, sino
tambin secuencias no codificantes que sin una
funcin especfica definida, pueden ser utilizados
como puntos de marca o de anclaje (marcadores)
cuando stas se encuentran unidas o cercanas a
las secuencias propias de los genes.
Marcadores Genticos
Fenotpicos: los polimorfismos de los genes se detectan a
travs de sus productos
- Morfolgicos: por ejemplo, color de flor
- Bioqumicos: bsicamente perfiles electroforticos de
isoenzimas y de protenas de reserva
Genotpicos o moleculares: Los polimorfismos de genes u
otras secuencias no codificantes se detectan a nivel del DNA
Marcadores morfolgicos
Los primeros en usarse (1960).
Son caractersticas fenotpicas de fcil
identificacin visual tales como forma, color,
tamao o altura. Ejem. Hay alrededor de 50
caracteres de plntula, tallo, hoja, espiga,
espiguilla y cariopside, que se utilizan para
inscribir e identificar variedades de trigo en
Mxico.
Los marcadores morfolgicos presentan
algunas limitaciones (estado fisiolgico,
condiciones ambientales, interacciones, etc.)
no obstante permanecen como caracteres
tiles en la identificacin de materiales
evaluados con mtodos sencillos y a bajo
costo.
Isoenzimas
Despus se paso a los marcadores isoenzimticos o marcadores de protenas.
Ciertos cambios en la secuencia de DNA (mutaciones) que codifica para estas
enzimas pueden resultar en cambios en la composicin de aminocidos.
Si estos cambios se producen, las protenas podran tener la misma actividad
biolgica, pero como su composicin de aminocidos vara, podran tener diferente
carga neta y por tanto diferentes velocidades de migracin en un campo elctrico
(electroforesis).
Deshidrogenasas (alcohol deshidrogenasa ADH,
glutamato dehidrogenasa GDH),
Oxidasas (peroxidasas PRX), hidrolasas
(fosfatasas cidas ACP, esterasas EST),
Isomerasas
(fosfoglucoisomerasa
PGI),
transferasas (fosfoglucomutasas PGM).
Protenas de reserva
El endospermo de los cereales es el principal
componente de la semilla, ya que representa
aproximadamente el 80-90% de su peso seco,
adems que el almidn y protenas son las dos
macromolculas ms importantes.
La clasificacin segn la protenas del endospermo
se basa en la solubilidad relativa en diferentes
solventes: albminas solubles en agua, globulinas
en solucin salina, prolaminas en alcohol y
glutelinas en cidos o lcalis.
El uso de protenas de almacenamiento en estudios
de diversidad gentica sistemtica, se basa en el
hecho que las protenas de diferentes individuos,
poblaciones y especies son homlogas, y que al
separarse en un gel producirn bandas similares o
diferentes.
Marcadores moleculares
Los marcadores moleculares permiten evidenciar variaciones (polimorfismos) en
la secuencia del DNA entre dos individuos, modifiquen estas o no su fenotipo. Esto
se debe a que los marcadores moleculares sealan tanto regiones codificantes
como no-codificantes del genoma.
Para que una porcin de DNA ligada al carcter de inters sea considerado un
marcador gentico debe mostrar una variacin experimentalmente detectable entre
los individuos de la poblacin, y una herencia predecible segn las leyes de Mendel
Marcadores morfolgicos
Influencia del ambiente
Bajo nmero
Baja cobertura del genoma
Bajo nivel de polimorfismo
Menos informativos (dominantes o recesivos)
Caracteres de madurez
Entrenamiento y subjetividad
Marcadores moleculares
Sin influencia ambiental y neutros
Cantidad ilimitada
Amplia cobertura del genoma
Alto nivel de polimorfismo
Ms informativos (en general codominantes)
Anlisis en fases tempranas
Sencillos, rpidos y objetivos
Polimorfismo de DNA
Diversos sucesos pueden causar variantes, ms o menos
complejas, en la secuencia de nucletidos del DNA. Tales
variantes se describen, generalmente como polimorfismos.
El polimorfismo se manifiesta en diferencias del genotipo - lo que
se demuestra en los diversos perfiles de bandas que se detectan
con un procedimiento apropiado - y quizs del fenotipo.
Varios sucesos pueden producir polimorfismos:
Mutaciones puntuales
Inserciones o deleciones
Rearreglos
VNTR
1,5%
8,5%
altamente
repetido
45%
moderadamente
repetido
45%
Importancia
relativa de los
marcadores
Metodologia
1 . Digestion DNA en fragmentos pequeos
2. Separacion de los fragmentos en gel de
eletroforesis
3. Transferencia de fragmentos de DNA para
filtro Nylon o nitrocelulosa.
(RFLP)
Interpretacion de resultados
1
1
2
3
4
Sorgo
Caa
(RAPD)
RAPD
AA
AA Aa aa
Aa
aa
Heterocigoto/
Homocigoto
Interpretacion
DNA genomico
MseI
EcoRI
adaptadores
ligacion
pre-amplificacion
Amplificacion selectiva
MseI
EcoRI
DNA
digestion
ligacion
preamplificacion
primer +1
GAATTCCN
CTTAAGCN
EcoRI
NTTAA
NAATT
ATTCCN
GCN
ATTCCN
TAA GCN
NT
NAAT
NT TA
N AT
A
ATTCCN
TAAGCN
NTTA
NAAT
C
AAC
Amplificacion
primer +3
ATTCCA
TAAGCT
GTTA
CAAT
AAC
MseI
DNA Repetitivo
Microsatlites o Secuencias Simples Repetidas
(Simple Sequence Repeats, SSRs)
- Mono-, di-, tri-, y tetra-nucletidos
Minisatlites o Short Tandem Repeats (STRs)
- 5-10 bp
Variable Number of Tandem Repeats
- 14-100 bp
Microsatlites
Secuencias cortas (1 a 6 bases) repetidas en tandem.
Presentes en procariotos y eucariotos.
Presentes en regiones codificantes y no codificantes.
Mayoria de las repeticiones son dinucleotideos
(AC) n (AG) n (AT)n
Los segmentos cortos DNA tienen secuencias repetidas como
CACACACA, y se presentan en el DNA no codificante.
La unidad repetida CA puede ocurrir 4 veces, o tambin 7 o 2 o 3.
Microsatlites (SSR)
ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG
GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG
TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA
TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC
ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT
CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG
AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC
CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG
Primer FOR
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN
Repeticion CA
Primer REV
Obtencion de secuencias:
a partir del banco de datos de genoma se
busca un cDNA
Hibridacion con biblioteca genomica,
identificacion de clones y secuenciamiento
Construccion de biblioteca enriquecida
por afinidad con secuencia de la matriz
Digestion
Ligacion
Adaptadores
Nicotiana tabacum
Adaptadores
Amplificacion
ssDNA
Sonda biotinilada
ssDNA
Bolilla magnticaestratividina
Enriquecimento y
Seleccion
Columna
Amplificacion
despues del
enriquecimiento
Enriquecimiento y seleccion
95C / 15 min
Sonda biotinilada
ssDNA
Biotina IIIII(CT)8
o
Biotina IIIII(GT)8
Coluna
Magntica
gua
Dna Total
Nicotiana ripanda
N. sylvestris
N. tabacum Coker 176
N. tabacum Ky 14 RMI
Digestion
con RsaI
Ligacion con
adaptadores
Amplificacion
Amplificacion despues
del enriquecimento
N. sylvestris
Problemas
Costo y trabajo involucrados en el
desarrollo de los cebadores
Farmacogentica:
busca
identificar
la
posible
respuesta a las terapias con
drogas.
Metodos para identificar
depende si es un SNP
desconocido o conocido
trigo
Marcadores No Polimrficos
Cdigo de barras de la vida se define como una secuencia corta de DNA de una regin
estndar del genoma, usada en la identificacin de especies (plantas y animales).
Diversidad estimada
10 millones de especies