3

3.1

METODE PENELITIAN

Alat dan Bahan

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah glassware, gelas

ukur, bola hisap, sendok bahan, spatula, rak tabung reaksi, mortar alu, gunting,
erlenmeyer

250

mL,

slow

juicer,

timbangan

digital,

desikator,

oven,

spektrofotometer UV Visible (UV-Vis), glucometer, spry drying, rotary evaporator,

freeze drying, microwave assisted extractor, labu ekstraksi, destilator, degassing,
dan disk mill.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rumput laut coklat
(Sargassum sp) dari kepulauan Talango, Sumenep, Madura, tikus wistar jantan
(Rotus novergicus) 2-3 bulan yang dibeli dari Uniersitas Islam Negeri Malang,
metanol PA, kertas saring, gas N2, reagen Follin-ciocalteu, aquades, Obat
Hipoglikemik Oral (Gliclazida), asam sitrat, natrium sitrat, streptozotocin,
selenium, air, sekam, metanol, obat luka iodine, buffer sitrat, floroglusinol,
maltodekstrin, air, lemak babi, gum arab dan etanol.
3.2

Metode Penelitian
Metode eksperimen. Menurut Jaedun (2011), penelitian eksperimen

adalah penelitian yang dilakukan terhadap variable yang data-datanya belum ada
sehingga perlu dilakukan proses manipulasi melalui pemberian perlakukan
tertentu terhadap subjek penelitian yang kemudian diamati atau diukur
dampaknya.penelitian eksperimen juga merupakan penelitian yang dilakukan
secara sengaja dengan cara memberikan perlakuan tertentu terhadap subyek
penelitian guna membangkitkan suatu kejadian atau keadaan yang akan diteliti
bagaimana akibatnya.
Perlakuan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah perbedaan
dalam pemberian ekstrak Sargassum dengan metode ekstrak yang berbeda

pada tikus yang telah menderita diabetes militus. Penelitian utama disini
dilakukan untuk mengetahui ada atau tidaknya pengaruh perbedaan ekstrak
Sargassum sp dengan metode ekstrak yang berbeda terhadap penurunan kadar
diabetes militus. Selain itu juga pada penelitian ini, akan didapatkan pada dosis
dari setiap metode ekstraksi tersebut mana yang lebih efektif untuk menurunkan
diabetes militus.
3.3

Rancangan Penelitian
Variabel adalah gejala, suatu fakta ataupun data yang sifatnya berubah-

berubah dan tidak tetap. Variabel dibagi menjadi dua yaitu variabel bebas dan
variabel terikat. Variabel bebas (Independent variable) merupakan variabel yang
dilihat pengaruhnya terhadap variable terikat (dependent variable), sedangkan
variabel terikat adalah dampak dari variabel bebas. Variabel terikat ini yang
menjadi tujuan penelitian dan sumber masalah.
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah 12 perlakuan pada tikus dan
lama waktu pengamatan. Sedangkan variable terikat pada penelitian ini adalah
profil lipid/kolesterol pada tikus diabetes militus.
Ada dua macam variabel dalam penelitian, yaitu variabel bebas dan
variabel terikat. Variabel bebas adalah variabel yang diselidiki pengaruhnya,
sedangkan variabel terikat adalah variabel yang diperkirakan akan timbul sebagai
pengaruh dari variabel bebas (Surakhmad,1994).
Rancangan penelitian yang digunakan untuk parameter mikrobiologi
feses dan kadar glukosa darah adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) karena
hanya memiliki 1 faktor yaitu perlakuan yang berbeda pada tikus uji (A, B, C, D,
E, F, dan G). Dalam penelitian ini digunakan lima kelompok ulangan (n=5) untuk
tiap perlakuan. Perlakuan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai
berikut:

A = kontrol negatif + aquades

B = kontrol negatif + ekstrak 200 mg/kg BB
C = kontrol positif + aquades
D = kontrol positif + OHO
E = kontrol positif + ekstrak 200 mg/kg BB
F = kontrol positif + ekstrak 400 mg/kg BB
G = kontrol positif + ekstrak 600 mg/kg BB
Metode analisis yang digunakan adalah sidik ragam yang mengikuti
model sebagai berikut :
Yij = + i + ij
Dimana:
Yij

i
ij

=
=
=
=

Perlakuan ke-i ulangan ke-j

Rataan umum
Pengaruh perlakuan ke-i
Galat percobaan perlakuan ke-i ulangan ke-j

Apabila hasil analisis keragaman (sidik ragam) menunjukkan adanya

pengaruh yang nyata/sangat nyata maka dilanjutkan dengan analisa Duncan 5%
menggunakan program SPSS.

Perlakuan
A
A1

B
B1
B2

Ulangan

Kombinasi
Perlakuan

A1B1
A1B2

A1B1.1
A1B2.1

A1B1.2
A1B2.2

A1B1.3
A1B2.3

A1B1.4
A1B2.4

A1B1.5
A1B2.5

A1B1.6
A1B2.6

A2

A3

A4

B3
B4
B1
B2
B3
B4
B1
B2
B3
B4
B1
B2
B3
B4

A1B3
A1B4
A2B1
A2B2
A2B3
A2B4
A3B1
A3B2
A3B3
A3B4
A4B1
A4B2
A4B3
A4B4

A1B3.1
A1B4.1
A2B1.1
A2B2.1
A2B3.1
A2B4.1
A3B1.1
A3B2.1
A3B3.1
A3B4.1
A4B1.1
A4B2.1
A4B3.1
A4B4.1

A1B3.2
A1B4.2
A2B1.2
A2B2.2
A2B3.2
A2B4.2
A3B1.2
A3B2.2
A3B3.2
A3B4.2
A4B1.2
A4B2.2
A4B3.2
A4B4.2

A1B3.3
A1B4.3
A2B1.3
A2B2.3
A2B3.3
A2B4.3
A3B1.3
A3B2.3
A3B3.3
A3B4.3
A4B1.3
A4B2.3
A4B3.3
A4B4.3

A1B3.4
A1B4.4
A2B1.4
A2B2.4
A2B3.4
A2B4.4
A3B1.4
A3B2.4
A3B3.4
A3B4.4
A4B1.4
A4B2.4
A4B3.4
A4B4.4

A1B3.5
A1B4.5
A2B1.5
A2B2.5
A2B3.5
A2B4.5
A3B1.5
A3B2.5
A3B3.5
A3B4.5
A4B1.5
A4B2.5
A4B3.5
A4B4.5

A1B3.6
A1B4.6
A2B1.6
A2B2.6
A2B3.6
A2B4.6
A3B1.6
A3B2.6
A3B3.6
A3B4.6
A4B1.6
A4B2.6
A4B3.6
A4B4.6

Tabel . Desain Rancangan Penelitian RAL

Keterangan :
A1 = B = tikus normal + ekstrak 200 mg/kg BB
A2 = E = tikus diabetes melitus + ekstrak 200 mg/kg BB
A3 = F = tikus diabetes militus + ekstrak 400 mg/kgBB
A4 = G = tikus diabetes militus + ekstrak 600 mg/kgBB
B1 = Ekstrak dengan Slow Juicer
B2 = Ekstrak dengan Microwave Assisted Ekstractor
B3 = Ekstrak dengan enkapsulasi
B4 = Ekstrak dengan Mikrowave + enkapsulasi
3.4

Prosedur Penelitian

3.4.1 Pembuatan Ekstrak Sargassum sp

Pada penelitian ini rumput laut coklat (Sargassum sp) yang digunakan
diambil dari perairan kepulauan Talango, Madura. Rumput laut coklat yang
diambil dari perairan segera dibersihkan dari kotoran-kotoran yang menempel
dengan menggunakan air tawar yang mengalir untuk menghilangkan garamgaram yang masih menempel pada rumput laut coklat. Rumput laut yang
digunakan berupa rumput laut utuh yang tidak dipisahkan antar bagiannya.
Rumput laut yang telah dicuci dikeringkan, pengeringan yang dilakukan tidak
boleh terkena matahari secara langsung, selanjutnya dihaluskan dengan
menggunakan dishmill.
Metode ekstraksi bahan aktif yang digunakan dalam penelitian ini dibagi
menjadi 4 metode ekstraksi yaitu Slow Juicer, Microwave Assisted Ekstraction,

Enkapsulasi dan Microwave Assisted Ekstraction + Enkapsulasi. Pembuatan jus

Sargassum sp dengan slow juicer dilakukan dengan mengisi Sargassum Sp
kering pada wadah slow juicer kemudian ditambah dengan pelarut air. Kemudian
disaring dengan menggunakan dan dihasilkan filtrat dan residu, Residu yang
didapatkan di jus kembali sedangkan filtrat yang di dapatkan di uji florotaninnya.
Pada pembuatan Enkapsulasi Sargassum sp, maltodekstrin dan gum
aran dengan perbandingan 9:1 dilarutkan dalam aquades. Setelah itu
ditambbahkan ekstraksi Sargassum sp dengan perbandingan 1:5. Kemudian di
aduk hingga homogen dan dikeringkan dengan spry drying.
Pada pembuatan ekstrak Sargassum sp dengan menggunakan MAE,
serbuk Sargassum sp yang didapatkan dari penghalusan dengan dishmill diambil
sebanyak 50 g. Kemudian dimasukkan ke dalam labu ekstraksi dan ditambahkan
pelarut metanol kemudian di ekstraksi dengan daya 450 W selama 8 menit. Hasil
ekstraksi disentrifugasi dan dihasilkan filtrat dan residu Sargassum sp. Residu
yang didapatkan diekstrak kembali sedangkan filtratnya didestilasi dan
dihilangkan senyawa alkoholnya dengan menggunkan rotary evaporator.
Kemudian ekstrak Sargassum sp di uji florotaninnya.
Pada pembuatan Enkapsulasi + MAE prosedur yang digunakan hampir
sama dengan metode MAE biasa namun ekstrak Sargassum sp yang dihasilkan
dilarutkan dalam larutan gum arab dengan pelarut etanol kemudian di
homogenkan dan dikeringkan dengan menggunakan spry drying. Keempat
metode ekstraksi tersebut dapat dilihat pada Gambar .
A. Slow Juicer

Rumput laut coklat (Sargassum sp)

Pembersihan dan pencucian dengan air
Penghalusan dengan Slow Juicer
Penyaringan

Uji

Filtrat

Residu

B. Enkapsulasi
Maltodekstrin dan gum arab (9:1)

Dilarutkan dalam aquadest

Ditambahkan ekstrak Sargassum sp (1:5)
Spry drying*

Enkapsulat

Uji Florotanin

Keterangan = *
- Spry dryer Lab Plant SD-05
- Mulut pipa 1,5 mm
- Ruang semprot utama 500 mm x 2015 mm
- Kecepatan aliran udara 73 m3/jam
- Tekanan udara kompresor 0,06 Mpa
- Kecepatan aliran feed 15 g/menit
- Suhu luar dan dalam ruangan (1102oC dan 842oC)
- Kekentalan bahan suspensi 20%

C. Microwave Assisted Ekstraction (Quan et al., 2006)

Rumput laut coklat (Sargassum sp)

Pembersihan dan pencucian dengan air tawar
Pengeringan dibawah sinar matahari
Dipotong dan digiling menjadi ukuran kecil mengugunakan disk mill
50 g Sargassum sp
Pengisian dalam labu
Penambahan pelarut etanol 60% 400 ml

Ekstraksi dengan MAE pada daya 450 W selama 8 menit

Disentrifuge
Filtrat
Destilasi

Residu

Evaporasi dengan rotary evaporator

Ekstrak Sargassum

Uji

D. Enkapsulasi + Microwave assisted Ekstraction

Rumput laut
(Sargassum
Pembersihan
dan coklat
pencucian
dengan Sp)
air tawar
Pengeringan dibawah sinar matahari
Dipotong dan digiling menjadi ukuran kecil menggunakan disk mill
50 g Sargassum Sp
Pengisian dalam labu
Ekstraksi dengan MAE pada daya 450 W selama 8 menit
PenambahanDisentrifuge
pelarut etanol 60% 400 ml
Filtrat
Destilasi

Residu

Evaporasi dengan rotary evaporator

Maltodekstrin dan gum arab (9:1)
Dilarutkan dalam aquades
Ditambahkan ekstraksi
Sargassum Sp (1:5)

Ekstrak Sargassum Sp

Enkapsulasi Sargassum Sp

Uji Florotanin

Spry drying

3.4.2

Pemodelan tikus coba pada berbagai perlakuan

Pemodelan tikus coba pada berbagai perlakuan diawali dengan

penempatan tikus wistar jantan sebanyak 60 ekor dengan berat 200 g dan usia

2-3 bulan kedalam individual cages dengan masa adaptasi 7 hari untuk
mengkondisikan semua tikus sebelum diberikan perlakuan (Miftahul, 2015).
Tikus coba setiap hari diberi pakan dan minum tanpa batas (ad libitum). Tikus
coba dibagi kedalam 7 perlakuan, pada tiap perlakuannya terdapat 5 ekor tikus
coba. 7 perlakuan ini meliputi :
A = kontrol negatif + aquades
B = kontrol negatif + ekstrak 200 mg/kg BB
C = kontrol positif + aquades
D = kontrol positif + OHO
E = kontrol positif + ekstrak 200 mg/kg BB
F = kontrol positif + ekstrak 400 mg/kg BB
G = kontrol positif + ekstrak 600 mg/kg BB
Preparasi diabetogenik STZ dilakukan dengan melarutkan STZ kedalam
larutan buffer sitrat pH 4,5 mengacu pada penelitian terdahulu (Erwin et al.,
2013). Penggunaan buffer sitrat pH 4,5 bertujuan untuk mempertahankan pH
asam (rongga perut). Buffer sitrat pH4,5 terbuat dari campuran 26,75 mL larutan
asam sitrat dan 23,25 mL larutan natrium sitrat yang dilarutkan dalam 50 mL
akuades. Sebelum tikus coba diinduksi dengan diabetogenik, tikus coba
dipuasakan selama 8 jam bertujuan agar STZ dapat bereaksi maksimal dalam
tubuh. Perlakuan A dan B diinduksi dengan larutan buffer sitrat sebanyak 0,2 mL,
sedangkan perlakuan C hingga G diinduksi dengan diabetogenik STZ dosis 40
mg/kgBB yang telah dilarutkan dalam buffer sitrat. Dosis yang diberikan untuk
DM tipe 2 secara intraperitoneal adalah lebih dari 40 mg/kgBB (Szkudelski,
2001). Sebelum dilakukan penginduksian STZ, tikus coba di beri pakan dengan
campuran lemak babi untuk meningkatkan kadar kolesterol tikus. Penginduksian
buffer sitrat dan STZ dilakukan di daerah intraperitonial di bawah rongga perut.
Hasil dari penginduksian diabetogenik dapat dilihat setelah 7 hari dengan
melakukan pengukuran kadar glukosa darah. Tikus coba yang dinyatakan positif
diabetes harus memiliki kadar glukosa darah sesaat 200 mg/dL (Kustarini et al.,
2012), sedangkan tikus coba yang memiliki kadar glukosa darah 200 mg/dL

tidak digunakan. Tikus coba yang telah dilakukan pemodelan ini dilakukan
treatment sesuai perlakuan tikus coba.Pemodelan tikus coba pada berbagai
perlakuan dapat dilihat pada Gambar .
Tikus Wistar jantan berat badan 200 g
Aklimatisasi selama 7 hari
Tikus perlakuan kontrol
negatif (A dan B)

Tikus perlakuan kontrol

positif (C, D, E, F, dan G)
Penggemukan dengan
penambahan Lemak Babi
pada pakan

Tikus
hiperkolestrol

Tikus nonhiperkolestrol

Tikus coba dipuasakan

selama 8 jam
Penginduksian STZ
40 mg/kg BB yang
dilarutkan dalam
buffer sitrat
Pengukuran kadar glukosa darah pada hari ke-7
setelah penginduksian

Tikus kontrol negatif

Tikus DM (kadar
glukosa darah
sesaat 200
mg/dL)

Tikus tidak DM
(kadar glukosa
darah sesaat <
200 mg/dL)

Tikus kontrol positif / tikus DM

Tidak
digunakan
Treatment pada berbagai kelompok tikus coba

3.4.3

Treatment pada Berbagai Perlakuan Tikus Coba

Treatment pada berbagai perlakuan tikus coba dilakukan pada perlakuan

A yaitu kontrol negatif atau dalam kondisi normal (tidak DM) dan hanya diberi

aquades. Perlakuan B yang disonde dengan penambahan ekstrak Sargassum sp

minimal 200 mg/kg BB. Hal ini dilakukan untuk menunjukka pengaruh dari
ekstrak minimal sargassum Sp. Perlakuan C yaitu kontrol positif atau tikus dalam
kondisi DM dan hanya diberi aquades. Perlakuan D disonde dengan Gliclazid.
Mekanisme kerja Gliclazid adalah merangsang sekresi insulin pada sel
pankreas dan gliklazid memiliki senyawa bioaktif yang dapat menangkap radikal
bebas (Qiang et al., 1998). Perlakuan E, F, dan G disonde dengan ekstrak
Sargassum Sp dilakukan setiap hari selama 28 hari. Untuk pengukuran
penyerapan florotanin ekstrak Sargassum sp.Treatment pada berbagai perlakuan
tikus coba dapat dilihat pada Gambar .

Tikus wistar
jantan berat
badan 200 g
perlakuan A

Tikus wistar
jantan berat
badan 200 g
perlakuan B

Tikus wistar
jantan berat
badan 200g
perlakuan C

Tikus wistar
jantan berat
badan 200
g perlakuan
D

Tikus wistar jantan

berat badan 200
g perlakuan E, F
dan G

Penyondea
n ekstrak
Sargassum
sp 200
mg/kg BB
pada pagi
hari setiap
hari selama
28 hari

Penyondean Gliklazid
pada pagi
hari setiap
hari selama
28 hari

Penyondean
ekstrak
Sargassum sp
berturut-turut
200 mg/kg BB
sekali pada pagi
hari, 400 mg/kg
BB dua kali
sehari pada pagi
dan sore, dan
600 mg/kg BB
tiga kali sehari
pada pgi, siang,
dan sore
dilakukan setiap
hari selama 28

Pengukuran kadar glukosa darah pada hari ke-0, 7, 14, 21 dan 28

Pembedahan tikus coba pada hari ke-29

Uji Profil Lipid tikus diabetes militus