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LABORATORIO DE BIOQUIMICA

1. RESUMEN

La primera prctica tiene como objetivo la comparacin de la actividad


enzimtica con un catalizador no biolgico, usando como enzima a la amilasa
salival y como catalizador no biolgico al HCl, en la hidrlisis del almidn, la
misma que se comprob con el reactivo de Fehling por medio de la reduccin
del Cu 2+ a Cu2O(s) (rojo) por accin de la maltosa (disacrido reductor)
formado en la hidrlisis del almidn. Adems se pudo observar la velocidad de
la hidrolisis mediante la reaccin del almidn con el lugol la cual dio una
coloracin azul que luego va decolorndose por la formacin de la maltosa, lo
que manifest que se produjo la hidrolisis.

2. INTRODUCCIN
ACCION DE LA AMILASA. Comparacin de la -amilasa de la saliva y del cido
clorhdrico sobre la reaccin de la hidrlisis del almidn.

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Las enzimas son polmeros de aminocidos, las cuales se encuentran en


todos los seres vivos y que desde el punto de vista bioqumico son
protenas que poseen una capacidad asombrosa para acelerar reacciones
qumicas de sntesis y degradacin de compuestos. stas se distinguen por
poseer tres caractersticas nicas: poder cataltico, especificidad y
regulacin, lo cual facilita los diferentes procesos biolgicos en todo tipo de
vida, al igual que en procesos industriales. Estos catalizadores biolgicos
tienen numerosas aplicaciones en diversas reas. Por ejemplo, el uso de
procesos biotecnolgicos para producir productos qumicos es cada vez
ms importante. La variedad de productos que se pueden obtener por estos
procesos es muy amplia, as se pueden encontrar productos farmacuticos
(insulina, antibiticos, hormonas), especialidades qumicas (aminocidos,
vitaminas, biopolmeros), alimentos y bebidas (edulcorantes, bebidas
alcohlicas), sin olvidar ciertos productos agrcolas (pesticidas, funguicidas,
herbicidas) y ambientales (lavado de minerales, concentracin metales) etc.
Los procesos biolgicos utilizan, para realizar las transformaciones
necesarias, clulas vivas o enzimas que ellas utilizan en su metabolismo.
Tambin tenemos la obtencin de yogur, o la produccin de cerveza o de
vino, el proceso de fermentacin se debe a las enzimas presentes en los
microorganismos que intervienen en el proceso de produccin. En el caso
de la industria farmacutica tenemos tambin la sntesis enzimtica del
paclitaxel (Taxol), agente antimittico empleado para el tratamiento de
cncer de pulmn, ovario, mama y formas avanzadas del sarcoma de
Kaposi. Otro ejemplo de Biocatlisis en la industria de antibiticos, sera la
utilizacin de enzimas para la obtencin del cido 6-aminopenicilnico (6APA) y cido 7-amino cefalospornico (7-ACA), precursores de antibiticos
-lactmicos semisintticos con propiedades mejoradas.

3. PRINCIPIOS TERICOS
ENZIMAS:
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Las enzimas son protenas especficas que actan como catalizadores de


las reacciones bioqumicas en todos los seres vivos. La actividad enzimtica
puede comprobarse experimentalmente mediante la identificacin y
cuantificacin de los productos formados en las reacciones que ellas
regulan. La accin de estos compuestos proteicos en una reaccin es
afectada por la variacin de factores fsicos y qumicos tales como la
temperatura, la concentracin de la enzima y del sustrato, el pH, etc.

CLASES DE ENZIMAS:
Es necesario contar con una clasificacin para sistematizar las diferentes
enzimas que catalizan los miles de reacciones que ocurren en el organismo.
A todas las enzimas se les asignan un numero de clasificaciones enzimtica
(EC, enzyme classification) de cuatro dgitos. El primer digito indica una de
las seis principales clases de enzimas de la tabla. Los dos dgitos siguientes
sealan subclases y subsubclases de sustrato.

Clase 1: Oxidorreductasas
Cataliza la transferencia de equivalentes de reduccin de un
sistema redox a otro.

Clase 2: Transferasas
Cataliza la transferencia de grupos funcionales de un sustrato a
otro.

Clase 3: Hidrolasas
Catalizan la transferencia de grupo, pero la molcula aceptora es
exclusivamente una molcula de agua.

Clase 4: Liasas
Denominadas tambin Sintasas. Estn relacionadas con la
adicin o extraccin de H2O, NH3 o CO2

Clase 5: Isomerasa
Catalizan las reacciones de isomerizacin recolocando los tomos
de una molcula, por lo que no afectan a la composicin del
sustrato.

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Clase 6: Ligasas
Tambin

llamadas

Sintetasas,

utilizan ATP

para

catalizar

reacciones de sntesis dependientes de energa.


Clase 1: Oxidorreductasas
En las reacciones, catalizadas por las oxidorreductasas, el sustrato que
se oxida se considera como donador de hidrogeno o electrones, y
aceptor pueden ser sustancias naturales (coenzimas, NAD, FAD, NADP,
FMN, CoQ, oxigeno, compuestos orgnicos, citocromos, etc.) y
xenobioticos.
Como ejemplos tenemos a la Peroxidasa y aldehidoxidasa, principales
enzimas en plantas y leche respectivamente.

Peroxidasa:
Esta es una protena grande que consiste de cientos de aminocidos y que
presenta como grupo prosttico un grupo Hem, cuyo tomo central de hierro
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forma complejos con diferentes compuestos, como el cianuro y la


hidroxilamina, inhibiendo su actividad enzimtica.

Se encuentra en los

peroxisomas, en los cloroplastos, en las vacuolas y en la pared celular. La


papa y las races del rbano contienen una gran cantidad de esta enzima.
Adems de estar relacionada en la proteccin de la clula contra daos
oxidativos causados por el H 2O2, tambin interviene en el pardeamiento
enzimtico y en los procesos infecciosos, as como en la elongacin de la
raz y en los procesos de lignificacin de la pared celular.
La funcin normal de la peroxidasa es convertir el perxido de hidrogeno,
producido en ciertas reacciones metablicas, en agua y oxgeno.

La accin de la peroxidasa se puede medir por la formacin del oxgeno. La


cantidad de oxigeno presente despus de la reaccin puede ser medida de
dos formas: mediante la acumulacin de gas en un sistema cerrado a un
manmetro o por la aparicin de oxigeno qumicamente activo.

Algunos tintes reaccionan con el oxgeno reactivo (O -2), cambiando de un


estado incoloro a uno con color. La reaccin catalizada por la enzima forma
un producto que entra en una reaccin secundaria con el tinte. La enzima
no se une o afecta al tinte.
En la prctica se utiliz como agente reductor a la bencidina, dando un color
azul intenso al aadir una solucin de rbano y unas gotas de agua
oxigenada.
Reaccin de la Bencidina con el oxgeno formado a partir de la oxidacin
del perxido de hidrogeno por la enzima peroxidasa:

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Otro agente reductor utilizado es el pirogalol (1,2,3-bencenotriol), en donde


una prueba positiva se manifiesta por la coloracin marrn-pardo de la
solucin de rbano, perxido de hidrogeno y pirogalol.
La prueba de la bencidina sera preferible a la del pirogalol por ser ms
visible el cambio de color.
Aldehidoxidasa:
La leche es bastante rica en aldehidoxidasa; contiene alrededor de 0,12g/l.
Es una flavoprotena, y la molcula de la enzima agrupa dos molculas de
FAD, dos tomos de molibdeno y 8 tomos de hierro. Realiza varias
reacciones de oxidoreduccin. Puede ser puesta en evidencia mediante la
reduccin del azul de metileno en presencia de un aldehdo, el formol por
ejemplo. El colorante se reduce a la forma de un leuco derivado incoloro, y
es oxidado el aldehdo.
Esta oxidasa es bastante resistente al calentamiento, se destruye a 80C
durante 10 segundos. Tiene una curiosa propiedad de aumentar su
actividad tras un tratamiento trmico no desnaturalizante. Este hecho puede
ser consecuencia de la liberacin de la enzima de un complejo poco activo,
o de la desnaturalizacin de un inhibidor.

AMILASA
Accin digestiva:
Est determinada por la AMILASA SALIVAL o TIALINA, sta es una amilasa
que tiene como sustratos:
-

almidn

dextrgeno

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glucgeno.

Sobre el almidn acta produciendo en la etapa final maltosa, pasando por una
etapa intermedia de dextrinas.
AMILASA

ALMIDN

AMILODEXTRINA (azul)

ERITRODEXTRINA (rojo)

ACRODEXTRINA (color yodo, se considera incoloro)

MALTOSA
La AMILASA tiene activadores e inhibidores:
Activadores:

Cloruro
Yoduro
Bromuro
Nitratos
aa (el mejor es la asparagina)

Calidad de la dieta ( rica en HC la estimulan, pero una rica en lpidos y


protenas, no es buen estimulante).
Inhibidores:
Sales de Hg y Ag (plata)
Protena que est en el germen del trigo
La amilasa, denominada tambin ptialina o tialina, es un enzima hidrolasa que
tiene

la

funcin

de

digerir

el

glucgeno y

el almidn para

formar azcares simples, se produce principalmente en las glndulas salivares


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(sobre todo en las glndulas partidas) y en el pncreas. Tiene un pH de 7.


Cuando una de estas glndulas se inflama aumenta la produccin de amilasa y
aparece elevado su nivel en sangre. Fue la primera enzima en ser identificada
y aislada por Anselme Payen en 1833, quien la bautiz en un principio con el
nombre de diastasa.
En pocas palabras, en biologa es una enzima presente en la saliva, que
hidroliza el almidon de todo alimento.
Clasificacin:
-Amilasa:
(Nombre alternativos: 1,4--D-glucano-glucanohidrolasa; glucogenasa)
Las

amilasas

son

enzimas

dependientes

de

cloruro,

completamente

afuncionales en ausencia de iones de cloruro. Actan a lo largo de cualquier


punto de la cadena de los carbohidratos, descomponindolos en dextrina
desde la amilopectina. Dado que puede actuar en cualquier punto de la cadena
es ms rpida que la -amilasa. En los animales es una enzima digestiva
mayor y su pH ptimo est entre 6.7 y 7.2.

-Amilasa:
(Nombres alternativos: 1,4--D-glucano-maltohidrolasa; amilasa sacarognica)
Otra forma de amilasa, la -amilasa es tambin sintetizada por bacterias,
hongos y plantas. Acta desde el extremo no reductor de la cadena,
catalizando la hidrlisis del segundo enlace -1,4, rompiendo dos unidades de
glucosa (maltosa) a la vez. Durante el proceso de maduracin de la fruta la amilasa rompe el almidn en azcar dando lugar al sabor dulce de la fruta. La
amilasa presente en el grano de cereal es la responsable de la produccin
de malta. Muchos microorganismos tambin producen amilasa para degradar el
almidn extracelular. Los tejidos animales no contienen -amilasa, aunque
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puede estar presente en microorganismos saprfitos del tracto gastrointestinal.


Tiene un pH ptimo de 12.
-Amilasa:
(Nombres alternativos: Glucano 1,4--glucosidasa; aminoglucosidasa; Exo-1,4-glucosidasa;

glucoamilasa;

-glucosidasa

lisosmica;

1,4--D-glucano

glucohidrolasa)
Adems de romper el ltimo enlace (1-4) glicosdico en el extremo no reductor
de la cadena de amilosa y amilopectina, liberando glucosa, la -amilasa puede
romper los enlaces glicosdicos (1-6). A diferencia de las otras amilasas esta
forma es ms eficaz en medios cidos y su pH ptimo es de 3. Tambin
colabora en el momento de la excitacin.
Usos:
Las enzimas amilasas son empleadas en la fabricacin de pan para romper
azcares complejos como el almidn (presente en la harina) en azcares
simples. La levadura puede entonces alimentarse de esos azcares simples y
convertirlos en productos de fermentacin alcohlica. Este proceso da sabor al
pan y hace elevar la masa. Las clulas de la levadura contienen amilasas pero
necesitan tiempo para fabricar la suficiente cantidad para romper el almidn.
Este es el motivo de la necesidad de largos tiempos de fermentacin
(especialmente para determinadas masas). Las tcnicas modernas de
elaboracin de masas incluyen la presencia de amilasas para facilitar y acelerar
estos procesos.
Algunas amilasas bacterianas se emplean como detergentes para disolver
almidones en determinados procesos industriales.
En la maduracin de frutas la amilasa es sintetizada en la maduracin,
degradando el almidn de las frutas en azcar, y volvindolas ms dulces.

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4. DETALLE EXPERIMENTAL
4.1. Materiales y reactivos
REACTIVOS

Amilasa (Saliva).
cido Clorhdrico 10%.
Almidn.
MATERIALES

Tubos de ensayo.
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Gradillas.
Pipetas.
Baguetas.
Termmetro

4.2 PROCEDIMIENTO
En tres tubos de ensayo se coloc:

Tubo N 1 : 1 mL

Agua.

Tubo N 2 : 1 mL de cido Clorhdrico.

Tubo N 3 : 1 mL de Saliva Diluda.

A todos los tubos se le aadio 1mL de solucin de almidn (la cual se prepar
con anterioridad diluyendo el almidn starch en agua destilada y calentando
para ayudar a la disolucin) una vez agregada la solucin de almidn se agita
cada uno de los tubos con una bagueta, posterior a esto se coloca los tubos en
bao de agua durante 15 minutos de la siguiente manera:

Tubo N 1 : Bao de agua a 38 C.

Tubo N 2 : Bao de agua hirviendo.

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Tubo N 3 : Bao de agua a 38 C.

Una vez pasado este tiempo se dejan enfriar los tubos, una vez fros los tubos
se aadi 2 gotas de solucin de yodo, observndose un cambio de coloracin
en la muestra. Tal como sigue:

MUESTRA

COLORACION

Tubo N 1

Azul

Tubo N 2

Amarilla

Tubo N 3

Amarilla

Para la determinacin de maltosa se tom 1mL de casa solucin, se le agreg


1mL de reactivo de Fehling, el cual determinar la presencia de maltosa al
formase un precipitado rojo de oxido cuproso.
FORMACION DE

MUESTRA
Tubo N 1

PRECIPITADO
Negativo

Tubo N 2

Positivo

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Tubo N 3

Positivo

5. ANALISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS


El mtodo usado est basado en la velocidad de hidrlisis del almidn a su vez
de sus diferentes tipos de productos por su hidrlisis obtenindose los
siguientes resultados:

Sustrato de la

Producto de

Catalizador

Reaccin

la Reaccin

Sustrato

Producto

Agua

almidn

almidn

-----------

-------------

Saliva

almidn

maltosa

R. Fehling

Oxido de Cu

Ac. Clorhdrico

almidn

maltosa

R. Fehling

Oxido de Cu

Revelacin

Los resultados expuestos en este cuadro se ven en la siguiente imagen:

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En esta imagen podemos apreciar como el tubo N 1 el cual contena agua dio
positivo al indicador de yodo, esto se debe, a que a diferencia de los otros dos
casos, tubo N 2 y tubo N 3, con el agua no se produce la hidrlisis del
almidn, por tanto, el almidn queda intacto dando la coloracin azul del
complejo caracterstico con yodo. En el caso de la amilasa salival y el acido
clorhdrico estos si cambian la coloracin al agregar el yodo, estos toman una
coloracin amarilla la que puede indicar la presencia de acrodextrinas.
Al realizar la prueba con el reactivo de Fehling observamos que esta sera
innecesaria para el tubo N1 (agua) debido a q no existen productos de
hidrlisis y por tanto ausencia de azucares reductores; en los dos casos
siguientes vemos que se produce la formacin de un precipitado rojo de oxido
cuproso debido a la presencia de la maltosa (azcar reductor). Observemos la
siguiente imagen:

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Tubo N 2

Tubo N 3

En esta imagen podemos

observar la formacin

del precipitado de xido cuproso el cual se presenta con mayor abundancia en


el tubo N 2 (amilasa salival) que en el tubo N 3 (cido clorhdrico) este
resultado se debe a que la hidrlisis con la amilasa salival fue mayor que con el
cido clorhdrico debido a que el tubo N 2 estuvo expuesto a una temperatura
mayor que el tubo N 3.

6. CONCLUSIONES

El Las reacciones catalizadas por enzimas son muchos ms rpidas y


ms completas que las correspondientes reacciones no catalizadas.

El incremento de la velocidad en las reacciones catalizadas depende de


la colcacin exacta del sustrato en la proximidad y con la orientacion
adecuada respecto al grupo cataltico.

la -amilasa cataliza la hidrlisis rpida y ordenada de enlaces internos


(1-4) y no hidroliza los enlaces (1-6).

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Los productos finales de la degradacin por hidrlisis del almidn son:


glucosa, maltosa e isomaltosa.
.

7. BIBLIOGRAFIA

Bioqumica: Texto y Atlas, Jon Koolman, Editorial Medica Panamericana,


3ra Edicin, pg. 89.
Bioqumica Mdica, John W. Baynes y Marek H. Dominiczak, Editorial
Elservier, 2da Edicin, pg. 54-56.
http://members.tripod.com/biol_uprponce/images/pdfs/ag04/Lab_06_Pro
p_Enzimas_s.pdf

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