BAB III

METODOLOGI PENELITIAN
A. Rancangan Penelitian
Jenis rancangan yang akan dilakukan pada penelitian ini
adalah penelitian eksperimental, yang bertujuan untuk mengetahui
aktivitas antioksidan ekstrak daun kecipir dengan metode DPPH (1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl). Sampel yang digunakan adalah daun
kecipir (Psophocarpus tetragonolobus L.) yang di dapat dari kebun
Manoko, Bandung. Sebelum di analisis daun kecipir dikeringkan
terlebih dahulu dan kemudian diekstraksi dengan menggunakan
pelarut etanol 70%. Pelarut etanol 70% merupakan gugus yang
bersifat non polar sedangkan OH adalah gugus yang bersifat polar,
sehingga pelarut etanol dapat menarik senyawa yang bersifat polar
maupun non polar. Kemudian di skrining fitokimia untuk mengetahui
kandungan senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada daun
kecipir (Psophocarpus tetragonolobus L.).
Selanjutnya dibuat larutan DPPH 0,1 mM, larutan blanko,
larutan uji dengan konsentrasi 5, 10, 25, 50, dan 100 ppm dan larutan
vitamin c sebagai kontrol positif dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8, 10 ppm.
Lalu

diukur

nilai

absorbansinya

dengan

menggunakan

spektrofotometer UV-Vis dan ditentukan nilai IC 50 yaitu nilai yang

menunjukan konsentrasi ekstrak (ppm) yang mampu menghambat
proses oksidasi sebesar 50% . Dan terakhir di tentukan temasuk
kedalam kategori sangat kuat, kuat, sedang, lemah/ tidak aktif.

18

19

B. Variabel dan Definisi Operasional

Tabel 3.1 Variabel dan Definisi Operasional
No

Variabel

Definisi

Cara ukur

1.

Konsentra
si ekstrak
daun
kecipir

2.

Absorban
si sampel

3.

IC50

Konsentrasi
larutan
uji
dalam ppm
(1 ppm =
g/mL)
Nilai
absorbansi
pada
masingmasing
sampel
Nilai
konsentrasi
ekstrak
yang
mampu
menghamba
t
aktivitas
proses
oksidasi
sebesar
50%

V1M1=V2M2
(perbandingan
ekstrak
dengan
mL
etanol)
Diukur
panjang
gelombang
dengan
alat
spektrofotome
ter
Persamaan
regresi linier

Alat
ukur
-

Skala
ukur
Numerik

Spektr
ofoto
meter

Numerik

Kategorik
Ordinal

Hasil Ukur
5 ppm
10 ppm
25 ppm
50 ppm
100 ppm
nm

Klasifikasi
Blois:
IC50 < 50
g/mL
=
sangat kuat
IC50 50-100
g/mL = kuat
IC50 101-150
g/mL
=
sedang
IC50 151-200
g/mL
=
lemah
IC50 > 200
g/mL = tidak
aktif

C. Bahan dan Alat yang Digunakan

1. Bahan
Bahan yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah bahan
yang aman dan sudah memenuhi standar.
Table 3.2 Bahan
No
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Bahan
Simplisia daun kecipir
Etanol 70%
DPPH
Reagen Mayer
Reagen Dragendroff
FeCl3 1%

Jumlah
2,5 kg
5L
1,98 mg
2 tetes
2 tetes
3 tetes

20

7.
8
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.

Logam Mg
HCl
HCl pekat
HCl 2N
Follin Ciocalteu 50%
Natrium karbonat 2%
Pereaksi Lieberman-Burchad
NaCl 10%
Garam gelatin
AlCl3 2%
Aquades

0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml
1 ml+1 tetes
0,1 ml
2 ml
1ml
5 tetes
5 tetes
2 ml
36 ml

2. Alat
Alat atau instrument yang digunakan dalam pengumpulan
data pada penelitian ini adalah alat yang terkontrol dan teruji
kualitasnya.
Tabel 3.2 Alat / Instrument
No
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.

Alat / Instrumen
Timbangan analitik
Gelas beaker
Gelas ukur 10 ml
Gelas ukur 50 ml
Gelas ukur 100 ml
Gelas ukur 1000 ml
Erlenmeyer
Corong
Pipet tetes
mikropipet
Pipet skala
Kertas saring
Batang pengaduk
Spatula
Waterbath
Cawan petri
Kaca arloji
Tabung reaksi
Rak tabung
Labu ukur 10 ml
Labu ukur 50 ml
Labu ukur 100 ml
Alat inkubasi
kuvet

Jumlah
1
6
2
2
2
2
6
3
8
6
4
Secukupny
a
5
2
1
5
2
15
1
2
2
2
1
15

21

25.
26.
27.
28.

Spektrofotometer Uv-Vis
Hotplate
Vortex
Aluminium foil

1
1
1
Secukupny
a

D. Pengumpulan Data
1. Teknik Pengumpulan Data
Penelitian ini merupakan penelitian observasional melalui
metode DPPH untuk menguji aktivitas antioksidan dari ekstrak
daun kecipir.
2. Instrument Penelitian
Instrumen yang akan digunakan pada penelitian kali ini
adalah spektrofotometer UV-Vis. Karena pada penelitian kali ini
akan dilakukan pengukuran nilai absorbansi dari sampel, kontrol
positif dan blanko. Sehingga dipilih instrument spektrofotometer
UV-Vis untuk membantu memudahkan dalam mambaca nilai
absorban pada sampel yang akan di uji.
E. Prosedur Penelitian
1. Determinasi Tanaman
Simplisia yang digunakan dalam penelitian ini adalah
simplisia daun kecipir yang diambil dari Kebun Manoko, Bandung.
Determinasi simplisia akan dilakukan di Manoko, Bandung untuk
mendapatkan ketentuan atau klasifikasi dari simplisia daun kecipir.
2. Pembuatan Ekstrak
Simplisia daun kecipir sebanyak 2,5 kg direndam dengan
pelarut etanol 70% selama 3x24 jam, setiap 1x24 jam pelarut
diganti dan dilakukan pengadukan sesering mungkin. Kemudian
filtrat disaring dan dipekatkan dengan Waterbath hingga diperoleh
ekstrak kental.
3. Skrining Fitokimia

22

a. Pemeriksaan Alkaloid
Larutan ekstrak sebanyak 3mL ditambah dengan 1mL
HCl 2 N dan 6mL aquades. Kemudian dipanaskan di atas
penangas air selama 2menit, didinginkan dan disaring.
Sebanyak 3 tetes filtrat dipindahkan pada kaca arloji,
kemudian

diperiksa

adanya

senyawa

alkaloid

dengan

menambahkan pereaksi Mayer dan Dragendroff, masingmasing sebanyak 2 tetes. Adanya alkaloid ditandai dengan
terbentuknya endapan putih dengan pereaksi Mayer dan
endapan merah dengan pereaksi Dragendroff (Marliana, dkk,
2005).
b. Pemeriksaan Flavonoid
Sebanyak 3mL sampel

diuapkan, dicuci

dengan

heksana sampai jernih. Residu dilarutkan dalam 20mL etanol

kemudian disaring. Filtrat dibagi 3 bagian A, B, dan C. Filtrat A
sebagai blanko, filtrat B ditambahkan 0,5mL HCl pekat
kemudian

dipanaskan

pada

penangas

air, jika

terjadi

perubahan warna merah tua sampai ungu menunjukkan hasil

yang

positif

(metode

Bate

Smith-Metchalf).

Filtrat

ditambahkan 0,5mL HCl dan logam Mg kemudian diamati

perubahan warna yang terjadi (metode Wilstater). Warna
merah sampai jingga diberikan oleh senyawa flavon, warna
merah tua diberikan oleh flavonol atau flavonon, warna hijau
sampai biru diberikan oleh aglikon atau glikosida (Harborne,
1987).
c. Pemeriksaan Saponin
Larutan ekstrak sebanyak 1mL ditambahkan 10mL
aquades

dan

dikocok

kuat

selama

10menit.

Hasilnya

dinyatakan positif apabila buih yang terbentuk stabil selama

tidak kurang dari 10menit, setinggi 1cm sampai 10cm. Pada

23

penambahan 1 tetes HCl 2 N, buih tidak hilang (Marliana, dkk,

2005).
d. Pemeriksaan Triterpenoid/ Steroid
Sebanyak 1mL larutan ekstrak kental diuapkan sampai
kering, kemudian ditambah dengan pereaksi LiebermanBurchad. Jika warna berubah menjadi hijau, biru atau ungu,
menandakan adanya senyawa steroid. Jika warna berubah
menjadi merah, menunjukan adanya senyawa terpenoid
(Demirezer, dkk, 2001).
e. Pemeriksaan Fenolik
Sebanyak 2mL ekstrak ditambahkan dengan 10mL
aquades lalu dididihkan selama 10 menit dalam tangas air
mendidih.

Larutan

kemudian

disaring

dan

filtratnya

ditambahkan dengan 3 tetes FeCl 3 1%. terjadinya warna hijaubiru menunjukan adanya fenolik (Demirezer, dkk, 2001).
f. Pemeriksaan Tanin
Sebanyak 3mL ekstrak diekstraksi dengan 10mL
aquades

panas

kemudian

didinginkan.

Setelah

itu

ditambahkan 5 tetes NaCl 10% dan disaring. Kemudian filtrat

ditambah garam gelatin, diamati perubahan yang terjadi.
Terbentuknya endapan menunjukkan adanya tanin atau zat
samak (Harborne, 1987).
g. Penentuan Kandungan Total Fenolik
Kandungan total fenolik ekstrak daun kecipir ditentukan
menggunakan metode Folin Ciocalteu. Sebanyak 0,1mL
larutan ekstrak dengan konsentrasi 1000 ppm dimasukkan
dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 0,1mL reagen Folin
Ciocalteu 50%. Campuran tersebut divortex, lalu ditambahkan
2 mL larutan natrium karbonat 2%. Selanjutnya, campuran
diinkubasi dalam ruangan gelap selama 30 menit. Pembacaan
absorbansi pada panjang gelombang 750 nm menggunakan

24

spektrofotometer. Kandungan total fenol dinyatakan sebagai

mg ekivalen asam galat/kg ekstrak.
h. Penentuan Kandungan Total Flavonoid
Kandungan

total

flavonoid

ekstrak

daun

kecipir

ditentukan menurut metode Meda et al, (2005). Sebanyak

1mL larutan ekstrak dimasukkan dalam tabung reaksi lalu
ditambah dengan 2 mL AlCl 3 2% yang telah dilarutkan dalam
etanol, kemudian di vortex. Absorbansi ekstrak dibaca pada
spektrofotometer visibel dengan panjang gelombang 415 nm.
Kandungan total flavonoid dinyatakan sebagai mg ekivalen
kuesertin/kg ekstrak.
4. Pembuatan Larutan
a. Pembuatan Larutan DPPH 0,1 mM
Sebanyak 1,98 mg DPPH (BM 394,32) dilarutkan
dengan etanol 70% dan dimasukkan kedalam labu ukur 50
mL. Volume dicukupkan dengan etanol hingga tanda batas,
kemudian ditempatkan dalam botol gelap.
b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum DPPH
Sebanyak 2 mL larutan DPPH 0,1 mM dimasukkan ke
dalam tabung reaksi lalu ditambahkan etanol sebanyak 2 mL,
tutup dengan aluminium foil, dihomogenkan dengan vortex
lalu dituang ke dalam kuvet dan diukur pada panjang
gelombang 400-800 nm menggunakan spektrofotometer UVVis (Musfiroh dan Syarief, 2009).
c. Pembuatan Larutan Blanko
Dipipet 2 mL larutan DPPH (0,1 Mm) kedalam tabung
reaksi dan ditambahkan etanol sebanyak 2 mL. Tutup dengan
aluminium foil. Kemudian dihomogenkan dengan vortex dan
diinkubasi dalam ruangan gelap selama 30 menit (Molyneux,
2004).
d. Pembuatan Larutan Uji

25

1) Larutan Induk (1000 ppm)

50 mg ekstrak daun kecipir dilarutkan kedalam 50 mL
etanol.

2) Larutan Seri ( 5, 10, 25, 50, 100 ppm )

a) 100 ppm
1 ml dari larutan induk ditambahkan etanol hingga 10
ml.
b) 50 ppm
0,5 ml dari larutan induk ditambahkan etanol hingga 10
ml.
c) 25 ppm
0,25 ml dari larutan induk ditambahkan etanol hingga
10 ml.
d) 10 ppm
0,1 ml dari larutan induk ditambahkan etanol hingga 10
ml.
e) 5 ppm
0,05 ppm dari larutan induk ditambahkan etanol hingga
10 ml.
e. Pembuatan Larutan Kontrol Positif ( Vitamin C)
1) Larutan Induk (100 ppm)
1 mg Vitamin C murni dilarutkan dalam 10 ml etanol
2) Larutan seri ( 2, 4, 6, 8, 10 ppm )
a) 10 ppm
1 ml dari larutan induk ditambahkan etanol hingga 10
ml
b) 8 ppm

26

0,8 ml dari larutan induk ditambahkan etanol hingga

10 ml
c) 6 ppm
0,6 ml dari larutan induk ditambahkan etanol hingga
10 ml

d) 4 ppm
0,4 ml dari larutan induk ditambahkan etanol hingga
10 ml
e) 2 ppm
0,2 ml dari larutan induk ditambahkan etanol hingga
10 ml
5. Pengukuran Absorbansi
Semua larutan blanko, larutan uji dan larutan kontrol positif
diinkubasi pada suhu 27C selama 30 menit dalam keadaan
gelap, kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan
spektrofotometer Uv-Vis.
Setelah

mendapatkan

nilai

absorbansinya,

persen

hambatan masing-masing larutan dihitung dengan menggunakan

rumus :
%Hambatan = (Abs blanko Abs sampel) x 100%
Abs Blanko
Setelah mendapatkan % aktivitas hambatan, kemudian
dicari nilai probitnya dengan cara melihat table probit. Setelah
mendapatkan nilai probit, dicari nilai IC 50 melalui persamaan
regresi linier.
F. Pengolahan dan Analisis data
1. Hasil ekstrak daun kecipir dengan metode maserasi
Tabel 3.4 Hasil ekstrak daun kecipir dengan metode maserasi

27

No

Ekstrak

1.

Maserasi
70%

Berat
Volume
simplisia
(ml)
(g)

Ekstra
k
kental
(g)

rendeme
n

warn
a

2. Hasil skrining fitokimia ekstrak etanol 70% daun kecipir

Tabel 3.5 Hasil skrining fitokimia ekstrak etanol 70%
daun kecipir
Metabolit
Pereaksi
Hasil
Keterangan
Sekunder
Mayer
Alkaloid
Dragendroff
Flavonoid
Bubuk Mg, HCl pekat
Saponin
Aquades
Triterpenoid/
Lieberman-Burchad
Steroid
Fenolik
FeCl3
Tanin
Gelatin
Keterangan : (+) = ada, (-) = tidak ada
3. Uji kandungan total fenolik dan flavonoid
Tabel 3.6 Uji kandungan total fenolik dan flavonoid
Ekstrak etanol daun
kecipir
Maserasi 70%

Fenolik

Flavonoid

4. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak etanol 70% daun

kecipir menggunakan metode DPPH
Tabel 3.7 Hasil pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak
etanol 70% daun kecipir menggunakan metode DPPH
Konsentrasi
% Aktivitas
Kekuatan
Absorbansi
IC50 (g/mL)
(g/mL)
Antioksidan
Antioksidan
Blanko
10
20

28

25
50
100

5. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan vitamin c menggunakan

metode DPPH
Tabel 3.8 Hasil pengukuran aktivitas antioksidan vitamin c
menggunakan metode DPPH
Konsentrasi
% Aktivitas
Kekuatan
Absorbansi
IC50 (g/mL)
(g/mL)
Antioksidan
Antioksidan
Blanko

G. Lokasi dan Waktu Penelitian

1. Lokasi Penelitian
Lokasi penelitian yang berjudul Uji Aktivitas Antioksidan
pada Ekstrak Daun Kecipir (Psophocarpus Tetragonolobus L.)
dengan Metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) dilakukan di
Laboratorium Stikes Muhammadiyah Ciamis.

29

2. Waktu Penelitian
Table 3.9 Waktu Penelitian
Kegiatan

Penyusu
nan
Proposal
KTI
Ujian
Proposal
KTI
Revisi
proposal
Pengum
pulan
proposal
Pelaksan
aan
Kegiatan
Penelitia
n
Ujian KTI
Revisi
KTI
Pengum
pulan
KTI

Bulan
Oktober

Bulan
Novem
ber
Minggu Minggu
1 2 3 4 1 2 3 4

Bulan
Desem
ber
Minggu
1 2 3 4

Bulan
Januari

Bulan
Februari

Minggu Minggu
1 2 3 4 1 2 3 4

Bulan
Maret

Bulan
April

Bulan Mei

Bulan
Juni

Minggu Minggu
Minggu
Minggu
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4