MICROBIOLOGIE

REACTII ANTIGEN ANTICORP:

Generalitati,
Clasificare,
1. Precipitare in mediu lichid principiu,
2. Precipitarea in inel,
3. Precipitarea in gel: reactii calitative si cantitative.
REACTII ANTIGEN ANTICORP
GENERALITATI:
Se bazeaza pe specificitatea reactiilor antigen anticorp (Ag/ Ac).
* Antigen: orice substanta care, patrunsa in organism, produce modificari specifice ale
sistemului imun, traduse prin formarea de Ac cu care reactioneaza specific atat in vivo,
cat si in vitro.
Antigenele poseda pe suprafata lor mai multi determinanti antigenici (sunt
multivalenti), putandu- se combina cu mai multe molecule de anticorpi.
* Anticorpi: factori specifici umorali (imunglobuline, Ig), care apar in organism ca
raspuns la stimularea antigenica.
Poseda pe suprafata lor sedii de recunoastere a Ag- ului, in baza carora se cupleaza
specific cu antigenul corespunzator. In general, Ac au 2 sedii de cuplare cu Ag, deci sunt
bivalenti.
Formarea complexelor Ag- Ac se datoreste stabilirii de legaturi multiple intre
gruparile determinante ale Ag- epitopi si situsurile de combinare ale Ac
corespunzator paratopi, legaturi favorizate de complementaritatea structurala intre
cele 2 elemente ale reactiei.
Dupa cuplarea initiala a Ag cu Ac se produc schimbari in starea fizica a complexelor
formate, acestea putand fi observate in vitro sub forma de precipitate, aglutinate.
Vizualizarea in vitro a reactiilor de precipitare, aglutinare este conditionata de
factori specifici:
- polivalenta Ag si bivalenta Ac,
- existenta unui raport optim intre cei 2 reactanti,
- factori nespecifici (concentratia de electroliti, temperatura, pH etc)
In raport cu natura Ag (suspensie bacteriana, extract bacterian, toxina, enzima etc) si a
tehnicii utilizate, exista mai multe metode de evidentiere a reactiilor Ag/ Ac:
1. Diagnostic bacteriologic direct (identificarea bacteriilor: identificare
antigenica),
2. Diagnostic serologic (indirect: identificarea Ac sintetizati de organism dupa
un contact cu un anumit Ag).

IMUNOCHIMIE
- este disciplina independenta, cu obiective proprii, net delimitate de cele ale
imunologiei.
* Obiectiv: studiul substantelor si proceselor biochimice care determina sau participa la
reactiile imunologice.
* Metodele imunochimice reprezinta contopirea metodelor fizico- chimice de
investigare, cu cele imunologice.
* Aceste reactii poseda precizia metodelor fizico- chimice, impreuna cu sensibilitatea
si specificitatea metodelor imunologice.
* Aplicatii ale metodelor imunochimice:
- histologie,
- genetica,
- citologie,
- microbiologie.
* Aplicabilitatea metodelor imunochimice in microbiologie:
- diagnostic bacteriologic direct: identificarea antigenului bacterian utilizand anticorpi
cunoscuti.
- diagnostic indirect: identificarea anticorpilor sintetizati de organism in urma
contactului imunologic cu un antigen cunoscut.
Reactiile antigen- anticorp sunt practicate in scop de diagnostic etiologic si se
executa cu produse biologice (seruri si antigene) standardizabile.
Reactiile serologice de diagnostic se aplica in urmatoarele situatii:
1. Identificarea unui agent bacterian (antigenul) izolat din produse patologice cu
ajutorul serurilor imune de diagnostic,
identificare de grup (Salmonella),
identificare de specie (S. typhi, Sh. flexneri),
identificare de serotip (Sh. flexneri 2a),
2. Decelarea anticorpilor serici sau a unei imunitati alergice, cu ajutorul
antigenelor standardizate.
* Sensibilitatea metodei: cantitatea cea mai mica de antigen sau anticorp care poate
fi determinata cu metoda respectiva, exprimata in U/ml, g/l, mg/ml.
* Specificitatea metodei: capacitatea metodei de a realiza reactia numai intre
antigenul si anticorpul corespunzator, precum si capacitatea anticorpului de a
discrimina intre determinanti antigenici diferiti.
Din punct de vedere tehnic, serurile si antigenele de diagnostic se utilizeaza in
cadrul a variate sisteme antigen anticorp:
1. reactii de aglutinare in care antigenul este de tip corpuscular,
- calitativa: in tub sau pe lama,
- cantitativa sau semicantitativa: dilutii in tuburi.
2. reactii de precipitare
in mediu lichid, semisolid sau solid,
- precipitare simpla (un singur component antigenic sau anticorp difuzeaza in gel),
- precipitare dubla (migreaza si antigenul si anticorpul),
- mono- , bidimensionala,

3. reactii de fixare a complementului (RFC) de catre complexul antigen anticorp,

cu utilizarea unui sistem revelant (hemolizina hematii),
4. reactia de imunofluorescenta (directa sau indirecta), in care, vizualizarea
antigenului complexat cu anticorpul marcat cu fluorocrom, este posibila in urma
excitarii complexului format, cu raze ultraviolete,
- reactia de electroforeza este combinata cu reactie de precipitare imunochimica,
5. reactia de neutralizare bazata pe neutralizarea de catre anticorp a unei proprietati
(infectante, toxice, litice etc) a antigenului,
6. intradermoreactia (I.D.R.).
REACTIA DE PRECIPITARE
Principiu: prin punerea in contact a unui antigen (sub forma solubila, macromoleculara)
cu anticorpul corespunzator, se formeaza complexe imune antigen- anticorp, care
precipita in momentul in care componentele se afla intr- o anumita proportie.
In reactiile de precipitare, antigenele sau anticorpii se pot utiliza ca atare sau marcati
(fluorocromi, enzime, izotopi).
Reactiile de precipitare pot avea loc in mediu lichid sau in mediu solid (reactii de
difuzie).
Formarea precipitatului imun depinde de o serie de variabile si anume:
- calitatea (greutatea moleculara, numarul determinantilor antigenici etc) si concentratia
antigenului,
- calitatea (tipul, heterogenitatea, aviditatea) si concentratia anticorpului,
- temperatura, pH, volumul de reactie etc,
Compozitia precipitatului imun, proportia de combinare a antigenului cu anticorpii
sunt variabile in functie de zona in care a avut loc precipitarea: exces de antigen,
echivalenta sau exces de anticorp.
Reactia de precipitare este foarte sensibila si specifica, in ceea ce priveste decelarea
antigenului (reactia evidentiaza cantitati foarte mici de antigen, acesta participand la
formarea agregatelor, in cantitati mult mai mici decat anticorpii).
TEHNICA DE PRECIPITARE:
1. MEDIU LICHID:
a) precipitare in amestec (floculare)
- metoda Ramon,
b) precipitare in inel:
- reactia Uhlenhuth,
- reactia Ascoli,
c) precipitarea in tub capilar:
- decelarea proteinei C reactive,
d) pe lama:
- test Ferreira,
2. MEDIU SOLID:
a) difuzie simpla:
- unidimensionala (metoda Oudin),
- bidimensionala (metoda Mancini- Carbonara- Heremans),
b) difuzie dubla:

- unidimensionala (Oakley Fulthorpe),

- bidimensionala:
* radiala (Ouchterloni),
* lineara: - in unghi de 90 (Elek)
c) difuzie combinata cu migrare in camp electric: - imunelectroforeza,
- contraimunelectroforeza,
- electroimunodifuzia.
Aplicabilitate in domeniul imunologiei:
studierea unor antigene de provenienta bacteriana (toxine, componente proteice
sau polizaharidice bacteriene),
antigene virale (antigen HBs),
evidentierea unor antigene (proteine patologice) in serul bolnavilor, cu afectiuni
inflamatorii (proteina C reactiva), neoplazice (alfa feto proteina).
A. Reactia de precipitare in mediu lichid:
1. Reactia de precipitare in amestec (R. de floculare)
* Metoda Ramon:
se pun in contact, in amestec, cantitati fixe de antigen cu cantitati variabile de
anticorp,
metoda se aplica in scopul stabilirii puterii antigenice a unei toxine (titrul),
utilizand cantitati variabile de anticorp cu titrul cunoscut,
Ex.: stabilirea titrului toxinei difterice pentru a fi utilizata in imunizarea cailor, pentru
obtinerea de seruri imune/ antidifterice, in tratamentul difteriei.
Metoda de lucru: titrarea toxinei difterice:
Tub 1

Tub 2

Tub 3

Tub 4

Tub 5

Tub 6

Ser antidifteric
100 UA/mL

0,1 mL

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

NaCl 8,5%

0,9 mL

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

1 mL

Toxina
titrat
-

difterica

de

din ser antidifteric (anticorpi), cu titrul cunoscut (100 UA/mL), se fac dilutii
succesive in ser fiziologic steril, in volum de 1 mL,
peste aceste dilutii se adauga toxina difterica, in cantitate fixa: 1 mL,
se folosesc pipete diferite pentru fiecare reactant,
se agita eprubetele si se introduc in baie de apa la 52C,

se urmareste reactia la fiecare 3 min pentru a prinde momentul pozitivarii ei:

prima eprubeta unde a aparut reactia de floculare: unirea unor cantitati echivalente
de antigen si anticorp,
daca flocularea a aparut in tubul nr. 4, de ex, amestecul reactiei contine 0,4 mL ser
antidifteric, adica 40 UA (unitati antitoxice). In acest tub, 1 ml toxina contine o
cantitate echivalenta (40 U) unitati floculante Limes. Deci titrul toxinei difterice
este de 40 unitati floculante Limes.

2. Reactia de precipitare in inel:

* Principiu: antigenul si anticorpul se pun in contact astfel incat sa nu se amestece; la
interfata intre cele 2 lichide, unde se creeaza o proportie optima intre concentratia de
antigen si anticorp, apare un inel de precipitare.
a) Reactia Uhlenhut:
-

reactia se foloseste pentru identificarea naturii, provenientei unor proteine (rol de

antigen), in medicina legala,
se poate preciza daca o pata de sange este de provenienta umana sau nu,
in industria alimentara, pentru stabilirea provenientei carnii,
antigenul se extrage din sangele recoltat (de pe rufe, haine etc), prin spalare in ser
fiziologic, centrifugare,
intr- o serie de eprubete se repartizeaza antigenul in dilutii diferite si se adauga ser
antiproteina umana, astfel incat cele doua componente sa nu se amestece,
se folosesc tuburi martor: martor sigur (+)/ ser uman si martor sigur (-)/ ser de cal
Tub nr...
Antigen nediluat
Antigen diluat 1/ 100
Antigen diluat 1/ 5000
Ser normal de cal dil 1/
1000
Ser normal de om dil 1/
1000
Ser
precipitant
antiproteina umana

3
0,7
-

4
M(-)
0,7

5
M(+)
-

0,7
-

0,7
-

0,7

0,3

0,3

0,3

0,3

0,3

b) Reactia Ascoli:
- reactia se utilizeaza pentru diagnosticul retrospectiv al antraxului,
- din organele animalului suspectat a fi decedat de antrax se extrage antigenul,
- antigenul este format dintr- o fractiune proteica termostabila, din compozitia bacilului
carbunos (Bacillus anthracis),
*Extragerea antigenului:
- fragment de organ se mojareaza in solutie de ser fiziologic steril, in proportie de 1/ 5,

- se adauga cateva picaturi de acid acetic si se fierbe timp de 5- 10 min,

- se decanteaza si se neutralizeaza supernatantul cu cateva picaturi de NaOH,
- se filtreaza prin hartie de filtru,
- filtratul contine toxina termostabila, care se foloseste drept antigen.
Nr. tub
Ser anticarbunos
Antigen preparat
Ser fiziologic
Ser normal de cal
-

1
0,5
0,5
-

2 M(-)
0,5
0,5
-

3 M(-)
0,5
0,5

se mentin eprubetele 5- 10 min la temperatura camerei, dupa care se face citirea

reactiei:
reactie (+): aparitia unui inel de precipitare in tubul nr. 1,
in eprubetele 2 si 3, ca martori negativi, inelul lipseste.

c) Determinarea grupului streptococic:

Izolarea din exudat faringian (sau alte produse patologice) a altor streptococi beta
hemolitici (test bacitracina negativ) decat streptococul beta hemolitic de grup A (test
bacitracina pozitiv/ Streptococcus pyogenes), necesita o reactie de determinare a
apartenentei de grup, a acestora.
* Metoda Lancefield: extractie acida a antigenului streptococic de grup (fractiunea
polizaharidica specifica de grup), prin tratarea cu HCl a sedimentului culturii in bulion a
tulpinii de testat.
Antigenul preparat se pune in contact (fara sa se amestece) cu antiseruri specifice de
grup (A, B, C, F, G etc/ preparate pe iepuri), in tuburi cu lumen foarte ingust.
Tuburile se mentin la temperatura camerei, timp de 10 min, pana cand va aparea un
inel de precipitare la interfata dintre antigen si anticorpul corespunzator.
Tubul in care va aparea inelul de precipitare va indica apartenenta de grup a
streptococului, cunoscand antiserul respectiv.
3. Reactia de precipitare in tuburi capilare:
* Principiu: reactia se executa punand in contact antigenul cu anticorpul in tuburi
capilare (varfuri de pipete Pasteur).
a) Determinarea tipului M streptococic:
anumite tipuri M de streptococ beta hemolitic grup A, determina complicatii
renale si cardiace, secundare unei infectii acute streptococice,
antigenul proteic M din peretele bacterian se obtine prin tehnica extractiei acide
(HCl) la cald, din sedimentul culturii in bulion glucozat 2%0,
extractul proteic se pune in contact (prin absorbtie) cu cantitati egale de seruri
antistreptococice de tip M (preparate pe iepuri), in tuburi capilare,
capetele se etanseizeaza cu plastilina,

se termostateaza 2 ore la 37C, apoi se lasa peste noapte la frigider,

aparitia unui precipitat abundent la baza unuia din tuburi, indica apartenenta de tip
(antiserul respectiv, cunoscut).

b) Determinarea unor proteine patologice in serul bolnavilor (proteina C reactiva):

In:
faza acuta a unui proces inflamator,
intr- un proces necrotic sau
proces neoplazic,
in serul bolnavilor apare o proteina cu caracter patologic, numita proteina C reactiva.
Aceasta este pusa in evidenta prin reactia de precipitare: se pun in contact, in
tuburi capilare, cantitati egale de ser de bolnav si ser antiproteina C reactiva.
Prezenta unui precipitat indica o reactie pozitiva, cantitatea de precipitat fiind
proportionala cu intensitatea reactiei.
B. Reactii de precipitare in mediu gelifiat (metode cantitative)
* Principiu: reactia are loc intr- un mediu gelifiat (0,8 1,25 g agar %), in care,
moleculele de antigen si anticorp pot migra prin porii gelului, care are un continut mare
de apa.
La locul de intalnire a unor anumite cantitati de antigen si anticorp corespunzator,
apare o linie vizibila de precipitare.
a) Difuzia simpla (metoda Mancini)
Aplicatii:
Imunograma (determinarea cantitativa in serul bolnavilor a unor fractiuni
proteinice, cum ar fi IgA, IgM, IgG),
Determinarea fractiunilor Complementului in ser uman.
Metoda de lucru:
in placi de polistiren cu diametrul de 5 cm, se toarna gel de agar in care a fost
inglobat, intr- o cantitate optima, antiserul (Ac) corespunzator tipului de
componenta proteica (Ag) pe care dorim sa o identificam (ser anti- IgA, antiIgM, anti- IgG, anti- complement),
in agar se efectueaza godeuri de 2 mm (cu un tub metalic) in forma de rozeta,
respectand distanta optima intre ele,
in godeuri se introduc cate 5 l din preparatul proteic de identificat (seruri de
bolnav, ce contin cantitati necunoscute de Ag corespunzator Ac inglobat in gel),
cu ajutorul unei micropipete,
in godeul central se introduc 5 l de ser uman de referinta (cantitate cunoscuta
dintr- un Ag cunoscut, al carui Ac corespunzator este inglobat in gel),
placutele se termostateaza la 37C timp de 24 ore pentru IgG, complement si 48
ore pentru celelalte componente (Ig A, IgM),
din godeuri va migra antigenul (a carui cantitate dorim s- o calculam), care va
intalni anti- serul corespunzator, inglobat in gel,
dupa termostatare, in jurul godeurilor apar cercuri concentrice, de diametre
variabile, formate din linii de precipitare,

se masoara diametrul zonelor de precipitare si se compara cu diametrul dat de

serul standard, cu concentratie cunoscuta, din centrul placii,
astfel se poate stabili cantitatea de Ag (IgA, IgG, IgM sau complement), utilizand
tabele intocmite pe baza unor experimentari pe numeroase seruri, care stabilesc
raportul dintre diametrul zonelor de precipitare si cantitatea de Ig sau complemnt
corespunzatoare.

2. Difuzia dubla:
a) Difuzia dubla radiala (metoda Ouchterlony)
Principiu: antigenul si anticorpul se introduc in godeuri fata in fata, vor migra in gel si la
locul de intalnire se formeaza linii de precipitare vizibile (metoda calitativa nu si
cantitativa)
Metoda de lucru:
gelul de agaroza se aplica pe lame de sticla, bine degresate,
in godeul central se pune Ac cunoscut, corespunzator Ag cunoscut din godeurile
martor, dispuse fata in fata,
in godeurile marginale, dispuse in rozeta, se introduce antigenul (2 martori cu Ag
cunoscut, corespunzator Ac din godeul central si 6 seruri de bolnav, de verificat
daca contin sau nu, acelasi Ag, ca si martorii),
la locul de intalnire (Ag Ac corespunzator) se formeaza linie de precipitare,
este dubla difuzie, deoarece migreaza si Ac (godeu central) si Ag (godeuri
marginale),
godeul care contine serul de bolnav, prezinta sau nu linie de precipitare la mijlocul
distantei fata de godeul central (Ac), daca contine sau nu Ag similar godeului
martor (Ag cunoscut si corespunzator Ac din godeul central).
Aplicatii:
determinarea tipului M streptococic,
proteina C reactiva,
alfa feto- proteina.
b) Difuzia dubla (metoda Elek):
Metoda se aplica in bacteriologie pentru determinarea toxinogenezei bacililor difterici,
izolati din exudate nazo- faringiene,
Mod de lucru:
in placa Petri cu geloza se practica un sant de 6/ 1,5 cm in centrul acesteia,
se scoate geloza, se toarna un strat subtire de geloza calda, se raceste,
se toarna in sant ser anti- toxina difterica,
se acopera santul cu geloza calduta, fara a inactiva termic serul antidifteric, se
raceste geloza,
se insamanteaza tulpini de bacil difteric (Corynebacterium diphteriae)
perpendicular pe directia santului, oprindu- se la 0,5 cm de marginea acestuia,
se insamanteaza si un martor sigur (+): tulpina de bacil difteric sigur producatoare
de toxina difterica (tulpina toxigena),
se termostateaza la 37C, 24 ore,

tulpinile de bacil difteric toxigene, vor sintetiza toxina, la cald, aceasta va difuza
in gel,
din santul practicat in geloza, vor difuza anticorpii specifici anti- toxina difterica,
la locul de intalnire a antigenului cu anticorpul, se formeaza linii de precipitare,
sub forma de mustati/ specific,
aparitia in unghiul format intre tulpina de testat si santul cu ser antitoxina difterica
a liniilor de precipitare, arata ca tulpina este toxigena, la fel cu tulpina martor,
sigur producatoare de toxina difterica.

Imunelectroforeza (IEF):
Principiu: asocierea electroforezei in gel (separarea antigenelor in functie de incarcatura
lor electrica) cu difuzia dubla (precipitarea specifica a antigenelor de catre anticorpi) are
ca rezultat formarea unor arcuri de precipitare specifice, corespunzatoare antigenelor din
proba migrata.
IEF permite:
- separarea si determinarea numarului de constituenti dintr-un amestec de antigene,
- definirea antigenelor pe baza mobilitatii electroforetice,
- izolarea din gel a antigenului urmarit pentru a realiza o analiza imunochimica mai
amanuntita.
Contraimunelectroforeza (CIE):
Principiu: proteinele cu migrare anodica sunt precipitate intr-un camp electric de catre
anticorpii specifici.
CIE reprezinta o dubla difuzie la care deplasarea antigenului si anticorpului este
accelerata de un camp electric.
La pH 8,2 8,6 in gelul de agar, anticorpii incarcati slab negativ se deplaseaza spre
catod, iar antigenele cu sarcina electrica mai mare spre anod. Aceste deplasari se fac in
sens contrar, iar difuzia in alte directii decat cea a campului electric este impiedicata.
Indicatii:
- decelarea sau identificarea unor proteine serice patologice (alfa feto proteina, produsii D
si E de degradare ai fibrinogenului),
- antigene bacteriene, virale, parazitare (antigene meningococice, streptococice,
pneumococice, antigenul HBs etc.