PERCOBAAN 34C : Denitrifikasi

I. TUJUAN
1. Mengetahui memampuan bakteri Pseudomonas, Bacilllus, Proteus dalam
melakukan proses denitrifikasi.
2. Mengatahui keberadaan bakteri yang membantu proses denitrifikasi dalam tanah
subur dan tanah tidak subur.

II. PRINSIP DASAR

Denitrifikasi merupakan proses reduksi nitrat menjadi gas nitrogen. Medium yang
digunakan pada praktikum ini adalah medium nitrat yang kemudian dimasukkan beberapa
jenis tanah dan bakteri. Ada atau tidaknya gas nitrogen setelah proses penginkubasian akan
terlihat dari gelembung pada tabung durham

III. TEORI DASAR

Proses denitrifikasi merupakan salah satu dari rangkaian siklus nitrogen yang
berperan dalam mengembalikan senyawa nitrat NO3 yang terakumulasi di wilayah perairan,
terutama laut, untuk kembali dipakai dalam gas Nitrogen bebas N2. Di samping itu, reaksi ini
juga menghasilkan nitrogen dalam bentuk lain, seperti dinitrogen oksida atau N2O. Senyawa
tersebut tidak hanya dapat berperan penting bagi hidup berbagai organisme, tetapi juga dapat
berperan dalam fenomena hujan asam dan rusaknya ozon. Senyawa N2O akan dioksidasi
menjadi senyawa NO dan selanjutnya bereaksi dengan ozon (O3) membentuk NO 2- yang
akan kembali ke bumi dalam bentuk hujan asam (HNO2).

Gambar 1. Proses Denitifikasi

Denitrifikasi dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu : kelembapan tinggi, pH netral,

ketersediaan karbon, kadar oksigen terlarut, temperatur, dan ketersediaan bakteri yang
membantu proses denitrifikasi.
Bakteri denitrifikasi adalah kelompok bakteri yang memiliki kemampuan untuk
melakukan reaksi reduksi senyawa nitrat (NO3-) menjadi senyawa nitrogen bebas (N2). Pada
beberapa kelompok bakeri denitrifikasi, dapat ditemukan juga senyawa nitrogen oksida (NO)
sebagai hasil sampingan metabolisme. Proses ini pada umumnya berlangsung secara
anaerobik (tanpa melibatkan molekul oksigen, O2). Contoh bakteri yang mampu melakukan
metabolisme ini adalah Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, Paracoccus
denitrificans.

Gambar 2. Bakteri Pseudomonas

Nitrogen bebas ini kemudian akan berguna bagi tanaman dan mikroorganisme lain
untuk menunjang pertumbuhannya. Selain itu, proses denitrifikasi diperlukan untuk
pengolahan limbah cair. Dengan melepaskan nitrat sebagai nitrogen yang mudah menguap,
denitrifikasi

dapat

meminimasi

fiksasi

nitrogen

sehingga

pertumbuhan alga ketika

pengolahan limbah cair akan dilepaskan ke danau atau sungai.

Akan tetapi di sisi lain denitrifikasi merupakan proses yang merugikan. Contoh dalam
lahan agrikultur yang diberikan pupuk nitrat bila tergenang oleh air, maka akan terjadi
kondisi anoksigenik dan denitrifikasi dapat terjadi sehingga akan melepaskan unsur nitrogen
ke udara. Produksi gas N2O dan NO oleh denitrifikasi dapat menyebabkan konsekuensi pada
lingkungan. N2O dapat dioksidasi menjadi NO diatmosfer. NO dapat bereaksi dengan ozon
membentuk NO2- dan kembali ke bumi menjadi asam nitrit (HNO2). Lalu denitrifikasi
berhubungan dengan rusaknya ozon sehingga sinar ultraviolet dapat masuk ke bumi dan
menyebabkan hujan asam, yang akan membuat tanah menjadi asam. Tanah yang asam akan
mengubah struktur tanah serta komunitas mikrob.

IV. ALAT DAN BAHAN

Alat :
-Tabung reaksi
-Tabung durham
-Pembakar Bunsen
-Jarum inokulasi

Bahan :
-Kultur bakteri Pseudomonas sp.
dan Bacillus sp, Proteus sp
- Sampel tanah subur dan tanah
tidak subur
- Media kaldu nitrat

V. HASIL PENGAMATAN
Praktikum dilaksanakan pada tanggal 3 Maret 2016, pengamatan minggu pertama dilakukan
pada tanggal 10 Maret 2016 dan pengamatan minggu kedua dilakukan tangal 17 Maret 2016.
Jenis tanah/bakteri
Tanah subur

Gambar

Keterangan
Pengamatan hari praktikum

Kelompok 33

Hari Praktikum
Terdapat gelembung gas pada
tabung durham

Pengamatan I

Terdapat gelembung gas pada

tabung durham

Pengamatan II
Tanah Tidak Subur

Terdapat gelembung gas pada

Kelompok 26

tabung durham

Pengamatan I
Terdapat gelembung gas pada
tabung durham

Pengamatan II

Bakteri Bacillus sp

Pengamatan hari praktikum

Kelompok 28

Hari Praktikum
Tidak terdapat gelembung
gas pada tabung durham

Pengamatan I
Tidak terdapat gelembung
gas pada tabung durham

Pengamatan II

Bakteri Pseudomonas sp

Pengamatan hari praktikum

Kelompok 25

Hari Praktikum
Terdapat gelembung gas pada
tabung durham

Pengamatan I
Terdapat gelembung gas pada
tabung durham

Pengamatan II

Bakteri Proteus sp

Pengamatan hari praktikum

Kelompok 32

Hari Praktikum
Tidak terdapat gelembung
gas pada tabung durham

Pengamatan I
Terdapat gelembung gas pada
tabung durham

Pengamatan II

VI. ANALISIS

Pada percobaan menggunakan tanah subur, terdapat gelembung udara pada tabung
durham baik pada pengamatan pertama maupun pengamatan kedua. Gelembung udara ini
diidentifikasikan sebagai gas N2 hasil dari denitrifikasi nitrat yang ada pada media kaldu
nitrat. Kuantitas gelembung udara tersebut dapat terbilang cukup banyak dan juga terdapat
perubahan warna pada media kaldu nitrat menjadi keruh yang menandakan adanya reaksi
kimia yang berlangsung. Oleh karena itu dapat kita ketahui hasil pengamatan menunjukkan
bahwa di dalam tanah subur terdapat bakteri denitrifikasi yang dapat merubah senyawa nitrat
menjadi gas N2 dengan proses reduksi. Bakteri denitrifikasi ini akan aktif pada keadaan
anaerobik atau keadaan tanpa udara yang diciptakan pada saat proses inkubasi.
Pada pengamatan pertama dan kedua percobaan menggunakan tanah tidak subur,
terdapat gelebung udara yang diidentifikasikan sebagai gas N 2 pada tabung durham. Jumlah
gelembung tersebut lebih banyak dibandingkan dengan gelembung yang tedapat pada
percobaan dengan tanah subur. Hal ini disebabkan karena tanah tidak subur mengandung
lebih sedikit gas oksigen dibandingkan dengan tanah subur. Oleh karena itu, bakteri
denitrifikasi yang aktif pada lingkungan anaerob akan berkerja lebih baik pada tanah tidak
subur.
Pada percobaan dengan menggunakan bakteri Pseudomonas sp, didapatkan
gelembung N2 pada pengamatan pertama dan kedua. Hal ini sesuai dengan literatur yang
menyebutkan bahwa bakteri Pseudomonas sp merupakan salah satu bakteri yang dapat
mereduksi nitrat menjadi gas N2 atau proses denitrifikasi. Akan tetapi, jumlah gelembung
yang terdapat pada tabung durham tidak sebanyak pada tanah subur maupun tidak subur. Hal
ini disebabkan karena suhu inkubasi pada percobaan bukanlah suhu optimum bakteri
Pseudomonas sp untuk tumbuh. Menurut referensi yaitu biologiedukasi.com menyebutkan
bahwa suhu optimum bakteri Pseudomonas dalah 35 derajat celcius, sedangkan suhu
lingkungan inkubasi adalah 20 derajat celcius.
Hasil pengamatan menggunakan bakteri Bacillus sp menunjukkan tidak adanya
gelembung pada tabung durham baik pengamatan pertama maupun pengamatan kedua. Hal
ini berbeda dengan referensi yang menyebutkan bahwa bakteri jenis ini merupakan salah satu
bakteri yang dapat membantu proses denitrifikasi. Akan tetapi, perbedaan tersebut dapat
dijelaskan dengan karakteristik dari bakteri Bacillus itu sendiri. Menurut referensi yaitu
repository.usu.ac.id menyebutkan bahwa suhu pertumbuhan bakteri Bacillus adalah berkisar

30-50 derajat celcius. Hal ini menyebabkan bakteri ini tidak tumbuh dan aktif melakukan
proses denitrifikasi dalam suhu inkubasi yaitu 20 derajat celcius.
Hasil percobaan selanjutnya yaitu dengan menggunakan bakteri Proteus menunjukkan
tidak adanya gelembung pada pengamatan pertama, tetapi pada pengamatan hari kedua
terdapar gelembung gas N2 pada tabung durham.

G. KESIMPULAN
1. Dari hasil percobaan, setelah diinkubasi selama 2 minggu dengan suhu 20 derajat
celcius bakteri Pseudomonas dapat mereduksi nitrat menjadi gas nitrogen sedangkan
bakteri Bacillus tidak dapat melakukan proses denitrifikasi tersebut.
2. Dari hasil percobaan, terdapat bakteri denitrifikasi pada tanah subur maupun tanah
tidak subur.

H. DAFTAR PUSTAKA
http://www.biologiedukasi.com/2014/11/mikrobiologi-pseudomonas-aeruginosa.html
diakses pada 30 Maret 2016
http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/40776/4/Chapter%20II.pdf diakses pada
30 Maret 2016
https://id.wikipedia.org/wiki/Denitrifikasi diakses pada 30 Maret 2016

PERCOBAAN 34D : Fiksasi Nitrogen

I.

Tujuan
a. Menunjukkan adanya bakteri Azotobacter pada sampel tanah basa dan karakteristik
bakteri tersebut.
b. Menunjukkan adanya bakteri Rhizobium pada nodul akar dan karakteristik bakteri
tersebut.

II.

Prinsip Dasar
Fiksasi nitrogen merupakan fase siklus nitrogen dimana mikroorganisme mengkonversi

nitrogen atmosfer menjadi senyawa lain yang masih mengandung nitrogen. Dimediasi oleh 2
sistem mikrobial yaitu mikroba simbiotik dan mikroba non-simbiotik. Mikroba simbiotik
seperti pada genus Rhizobium pada akar tanaman kacang-kacangan. Sedangkan mikroba nonsimbiotik seperti genus Azotobacter, Clostridium, Beijerinckia

dan cyanobacteria yang

mampu menggunakan gas nitrogen sebagai sumber nitrogen.

Pada percobaan ini, akan diamati karakteristik dari organism yang mampu melakukan
fiksasi nitrogen. Karakteristiknya antara lain: Berdinding tebal, memproduksi kista dormant
yang resisten terhadap proses pengeringan/radiasi UV, namun sensitive terhadap panas.
Digunakan mikroskop untuk mengamati karakteristik mikroorganisme tersebut.

III.

Teori Dasar
Atmosfer bumi sekitar 79 persen adalah nitrogen, dan sebagian besar nitrogen atmosfer

ada dalam keadaan unsur. Sayangnya, bentuk unsur nitrogen tidak ada harganya langsung
untuk tumbuhan tingkat tinggi; mereka harus memperoleh nitrogen dalam bentuk baik
amonium atau nitrat.
Fiksasi nitrogen adalah proses dimana unsur nitrogen dari atmosfer diubah menjadi
amonium, bentuk ionik nitrogen yang tersedia bagi tumbuhan tingkat tinggi. Nitrogen adalah
unsur yang paling berlimpah keempat dalam sebagian besar organisme, dapat mencapai
sebanyak 4 persen dari berat kering tumbuhan itu.
Mayoritas nitrogen ini hadir sebagai penyusun struktur protein, tetapi juga merupakan
komponen dari berbagai senyawa biologis lainnya, seperti klorofil dan asam nukleat. Dengan
demikian, untuk pertumbuhan tumbuhan normal dan pengembangan, nitrogen harus dijaga
pada tingkat yang cukup tinggi dalam tanah.
Secara kimia, fiksasi nitrogen mensyaratkan bahwa enam elektron dan delapan ion
hidrogen ditransfer ke molekul nitrogen atmosfer. Reaksi ini adalah proses yang

membutuhkan energi; Oleh karena itu, adenosin trifosfat (ATP), bentuk energi sel yang
tersimpan, harus tersedia untuk reaksi berlangsung. Elektron, ion hidrogen, dan ATP
disediakan oleh proses respirasi seluler yang terjadi dalam sel akar.
Tidak semua spesies nitrogen bergerak pada tingkat yang sama. Sejumlah faktor dapat
menjelaskan perbedaan ini. Beberapa tumbuhan membentuk nodul jauh lebih berlimpah
daripada yang lain. Karena pembentukan nodul lebih luas, tumbuhan ini akan memfiksasi
lebih banyak nitrogen daripada mereka yang menghasilkan nodul lebih sedikit.
Bakteri pengikat nitrogen yang ada dalam hubungan simbiosis dengan tumbuhan inang
mereka. Bakteri memasok tumbuhan dengan nitrogen yang sangat dibutuhkan, sedangkan
tumbuhan memasok bakteri dengan karbohidrat dan nutrisi lainnya.
Beberapa energi, berasal dari karbohidrat tumbuhan yang disediakan, digunakan dalam
fiksasi nitrogen, tetapi ada banyak yang tersisa untuk memasok bakteri dengan semua energi
yang diperlukan untuk kelangsungan hidup mereka
Azotobacter
Azotobacter adalah species rizobacteri yang telah dikenal sebagai agen biologis
pemfiksasi nitrogen yang mengkonversi dinitrogen ke amonium melalui reduksi elektron dan
protonisasi gas dinitrogen. Azotobacter memiliki ukuran dan bentuk yang berbeda-beda.
Bentuk sel Azotobacter biasanya berbentuk batang pendek, batang, dan oval serta bentuk
yang lain yang bermacam-macam.

Gambar 1. Bakteri Azotobacter

Dengan bentuk sel yang bermacam-macam seperti ini, bakteri Azotobacter dikenal
sebagai dengan bentuk sel pleomorfik. Ada beberapa jenis bakteri Azotobacter penting,
diantaranya A.Chroococcum,

A.agilis,

A.paspali

dan

A.vinelandii. Kita

dapat

menemukannya bakteri Azotobacter ini pada tempat dengan jenis tanah yang netral sampai
dengan tanah yang basa.
Bakteri Azotobacter mampu menambat kurang lebih 20 mg nitrogen/g gula. Ketika
menambat

nitrogen

ada

enzim

yang

bertanggung

jawab

yaitu

nitrogenase.

Bakteri Azotobacter memiliki struktur nitrogenase yang unik, mengapa unik karena
pada Azotobacter memiliki struktur nitrogenase yang terdiri dari 3 kompleks protein,
yaitu nitrogenase I (Molybdenum nitrogenase), nitrogenase II (Vanidium nitrogenase), dan
nitrogenase

III

(Ferrum

nitrogenase).

Faktor-faktor

yang

mempengaruhi

bakteri Azotobacter dalam penambatan nitrogen adalah faktor lingkungan, terutama ciri
kimia dan fisika habitatnya. Faktor-faktor tersebut meliputi ketersediaan senyawa nitrogen,
kesediaan nutrien anorganik, pH, dan suhu.
Rhizobium
Bakteri Rhizobium merupakan salah satu jenis bakteri penambat nitrogen yang mampu
bersimbiosis dengan tanaman, terutama pada tanaman leguminosae. Untuk memanfaatkan
simbiosis bakteri rhizobium dengan tanaman leguminosae dalam konsep pertanian organik
berkelanjutan, dibutuhkan pemahaman mengenai proses asosiasi antara rhizobium dengan
tanaman inang.
Kebanyakan bakteri rhizobium hidup dalam akar tanaman, terutama tanaman
leguminosae yang menjadikan hubungan ini sebagai bentuk simbiosis mutualisme. Bakteri
melakukan penetrasi ke dalam akar tanaman melalui akar serabut dan kulit akar-akar halus,
kemudian melakukan fiksasi atau penambatan terhadap nitrogen bebas di udara dan
membentuk bintil atau nodul akar. Karena itulah, bakteri ini dalam dunia pertanian disebut
juga sebagai bakteri bintil akar. Nitrogen bebas di udara yang telah diikat oleh bakteri
tersebut kemudian dilepas menjadi bentuk tersedia di dalam tanah.

Gambar 2. Nodul pada akar

Tanaman inang akan mendapatkan tambahan nitrogen yang dihasilkan dari proses
fiksasi tersebut sehingga dapat dimanfaatkan untuk menopang pertumbuhannya. Pada saat

yang sama, tanaman inang juga akan memberikan karbohidrat yang merupakan sumber
energi utama bagi bakteri rhizobium.
IV.

Alat dan Bahan

a. Alat :
1. Cawa petri
2. Erlenmeyer
3. Pembakar bunsen
4. Jarum Inokulasi
5. Kaca preparat
6. Pipet tetes
7. Lampu ultraviolet
8. Mikroskop
9. Inkubator
b. Bahan :
1.
2.
3.
4.
5.

V.

Tanaman kacang-kacangan segar dengan nodul akar

Sampel tanah yang sedikit basa
Aquades
Metilen Biru, kristal violet, iodine gram, etil alkohol & safranin
Kaldu Mannitol Bebas Nitrogen

Hasil Pengamatan
a. Isolasi Rhizobium
Tabel Hasil Pengamatan
Deskripsi : Tanggal: 3 Maret 2016
Sampel : Nodul akar tanaman
Reagen : Metilen blue

Kel.

Foto Pewarnaan Gram

Hasil Pengamatan

Bakteri berwarna merah dan

28

berbentuk bulat sedikit lonjong

b. Isolasi Azotobacter
Tabel hasil pengamatan Minggu ke-1
Deskripsi :Tanggal : 10 Maret 2016
Media : Mannitol Bebas Nitrogen (MBN)
Sampel : 1 gram Tanah tidak subur ( sedikit basa)
Kel.

Foto
Kontrol

Setelah Inkubasi

Hasil Pengamatan

Terdapat lapisan film tipis pada

33

permukaan kaldu

Tabel hasil pengamatan Minggu ke-2

Deskripsi :Tanggal : 16 Maret 2016
Media : Mannitol Bebas Nitrogen (MBN) pada cawan petri
Sampel : Tanah tidak subur (sedikit basa)
Kel

Foto
Preparat dibawah UV

Pewarnaan Gram

Keterangan

-terlihat warna hijau pendar

28

pada preparat
-warna bakteri merah
merupakan bakteri gram negatif

-Tidak ada warna biru kehijauan

muda pada preparat
33

-tidak terdeteksi adanya

Azotobacter sp

VI.

Analisis
Pada praktikum Azotobacter sp pengamatan pertama, yaitu satu minggu setelah

praktikum, sampel tanah basa yang diinokulasukan ke kaldu manitol menunjukkan

perubahan. Pada permukaan kaldu terdapat lapisan film tipis yang mengindikasikan adanya
koloni bakteri yang tumbuh. Hal ini juga menunjukkan bahwa bakteri Azotobacter sp bersifat
aerob karena tumbuh di atas permukaan kaldu untuk mencari oksigen. Kemudian, lapisan
film tersebut diinokulaikan ke cawan petri bermedium agar manitol lalu diinkubasi kembali.
Dari hasil inkubasi kembali dalam waktu 6 hari, bakteri tumbuh mengikuti goresan
streak yang dilakukan.

Lalu koloni bakteri diinokulasi kembali ke kaca preparat lalu di

sinari di bawah sinar UV. Bakteri Azotobacter sp akan melepaskan fluoroscens berupa lysine
dan pigmen berwarna biru di bawah sinar UV. Warna yang dihasilkan ini bisa berbeda
berdasarkan panjang gelombang sinar UV. Pengamatan memberikan hasil bahwa ada yang
bersinar dibawah sinar UV dan ada yang tidak. Kemudian sampel yang menunjukkan
fluorocens dilakukan pewarnaan gram dan menunjukkan gram negatif. Hal ini sesuai dengan
literatur yang menyebutkan bahwa bakteri Azotobacter sp merupakan bakteri gram negatif.
(Digilib.its.ac.id). Sedangkan pada sampel yang tidak menunjukkan adanya fluorocens
setelah pewarnaan gram tidak menunjukkan tanda-tanda adanya bakteri Azotobacter sp.
Tidak adanya kehadiran bakteri Azotobacter sp dapat disebabkan karena sampel koloni
bakteri yang diinokulasikan ke kaca preparat terlalu sedikit.

Pada percobaan pengamatan nodul akar untuk mengetahui adanya bakteri Rhizobium,
dilakukan pewarnaan gram. Nodul akar dihancurkan diatas kaca preparat berujuan untuk
memecah nodul sehingga bakteri Rhizobium dapat terwarnai.
Seteah dilakukan pewarnaan gram, dari hasil pengamatan menggunakan mikroskop
didapatkan bahwa adanya bakteri Rhizobium berwarna merah dan berbentuk sedikit lonjong
karena mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan. Warna merah
tersebut mengindikasikan bahwa bakteri Rhizobium merupakan bakteri gram negatif. Hal ini
sesuai dengan literatur yang menyebutkan bahwa bakteri Rhizobium merupakan bakteri gram
negatif berbentuk bulat sedikit panjang dan dapat memfiksasi nitrogen dari atmosfer.
(sridianti.com)
VII.

Kesimpulan
1. Setelah diinokulasi dan diinkubasi, terbukti bahwa sampel tanah sedikit basa
mengandung bakteri Azotobacter sp karakteristik yaitu bersifat gram negatif
berbentuk sedikit oval, dan mengeluarkan fluorocens sebagai lysin dan pikmen
berwarna biru dibawah sinar UV.
2. Setelah nodul akar dipecah diatas kaca preparat dan dilakukan pewarnaan gram
berbukti bahwa terdapat bakteri Rhizobium yang bewarna merah menunjukkan bahwa

VIII.

Rhizobium merupakan bakteri gram negatif, dan berbentuk bulat sedikit memanjang.
Daftar Pustaka
http://shailamauludia.blogspot.co.id/2013/12/azotobacter-sebagai-bakteri-

pengambat.html diakses 30 Maret 2016

http://kliksma.com/2015/04/pengertian-fiksasi-nitrogen.html diakses 30 Maret 2016
http://www.tanijogonegoro.com/2013/09/peran-bakteri-rhizobium.html
Maret 2016
Digilib.its.ac.id diakses 31 Maret 2016
Sridianti.com diakses 31 Maret 2016

diakses

30