Anda di halaman 1dari 8

Laporan Penelitian Kecil Proyek Biologi Sel dan Molekuler

Pengaruh Cypermethrin terhadap Ekspresi Gen caspase-3 pada


Zebrafish (Danio rerio)
M.Alvin Akbar (10614051)1. Dhia Shofi S (1061432). Meilisa (10614046). Bunga Indraswari S
(10614047). Agnia Vibriani (10614067).
1

Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati, Institut Teknologi Bandung (ITB)


Jalan Ganesha No. 10 Bandung 40132 Indonesia
Email: m.alvinkbr@gmail.com

Abstract. Cypermethrin merupakan salah satu pestisida golongan pirethroid yang


banyak digunakan yang bila terpapar akan mengganggu fungsi normal dari sistem saraf
serangga dengan menghambat sodium ion gate tertutup, sehingga neurotransmitter akan
terus diproduksi dan otot menjadi kejang. Apoptosis merupakan proses kematian sel
secara terprogram tanpa adanya respons inflamasi. Zebrafish merupakan salah satu model
organisme yang banyak digunakan dalam penelitian biomedik dan genetika dan
digunakan sebagai model karena memiliki ukuran yang kecil, mudah dikembangbiakkan,
tahap perkembangannya dapat diamati dengan mudah, dan secara genetik mirip dengan
manusia. Penelitian dimulai dari persiapan alat dan bahan, pendedahan cypermethrin dan
pengambilan sampel, isolasi RNA zebrafish, konfirmasi dengan elektroforesis, sintesis
cDNA embryo zebrafish, Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR).
Keywords: Cypermethrin, Danio rerio, Apoptosis, Caspase-3

Pendahuluan
Cypermethrin
(Cyano-(3-phenoxyphenyl)methyl]3-(2,2-dichloroethenyl)-2,2dimethylcyclopropane-1-carboxylate) merupakan
salah satu pestisida golongan
pirethroid yang banyak digunakan. Pestisida ini digunakan untuk membasmi hama
serangga pada pertanian maupun non-pertanian [1]. Cypermethrin akan mengganggu fungsi
normal dari sistem saraf serangga dengan menghambat sodium ion gate tertutup,
sehingga neurotransmitter akan terus diproduksi dan otot menjadi kejang. Penggunaan
cypermethrin yang berlebihan pada lahan pertanian dapat menyebabkan terbawanya
cypermethrin ke ekosistem perairan melalui aliran air pada tanah. Akibatnya,
cypermethrin dapat menjadi toksik bagi hewan akuatik, yang bukan merupakan target
organisme[2]. Untuk menentukan toksisitas cypermethrin terhadap hewan akuatik, dapat
diamati apoptosis yang terjadi pada hewan tersebut.
Apoptosis merupakan proses kematian sel secara terprogram tanpa adanya respons
inflamasi. Apoptosis dapat disebabkan karena penuaan sel atau karena adanya induksi
dari faktor eksternal [1]. Salah satu induktor eksternal adalah adanya pemaparan pestisida.
Apoptosis diperantarai oleh adanya ekspresi caspase dan ekspresi gen Bcl2. Menurut
Laporan Proyek Biologi Sel dan Molekuler 2016

M.Alvin Akbar, Dhia Shofi S, Meilisa, Bunga Indraswari S, Agnia Vibriani

penelitian yang telah dilakukan, pestisida trichlorfon dapat menginduksi apoptosis sel
hepatosit dengan mengaktifkan ekspresi gen caspase-3 [11]. Caspase merupakan
endoprotease yang memiliki sisi aktif Cys (C) dan membelah pada terminal C pada residu
Asp. Gen caspase-3 merupakan salah satu gen yang mengatur apoptosis yang berfungsi
sebagai efektor, yaitu membelah berbagai substrat yang mati dan pada akhirnya
menyebabkan perubahan morfologi serta biokimia pada sel yang mengalami apoptosis. [3].
Zebrafish merupakan salah satu model organisme yang banyak digunakan dalam
penelitian biomedik dan genetika. Alasan penggunaan zebrafsh adalah karena memiliki
ukuran yang kecil, mudah dikembangbiakkan, tahap perkembangannya dapat diamati
dengan mudah, dan secara genetik, mirip dengan manusia. Zebrafish berasal dari Asia
Tenggara dan terdistribusi ke daerah India, Bangladesh, Myanmar, Nepal, dan Pakistan.
Habitat zebrafish memiliki pH air sekitar 8 dan suhu air rata rata 25 0C. Zebrafish
bereproduksi seperti ikan lainnya, yaitu dengan fertilisasi eksternal. Zebrafish biasanya
melakukan reproduksi dimusim hujan, hal ini berkaitan dengan ketersediaan nutrisi dan
kondisi kimia air (pH, salinitas, dll). Telur zebrafish akan menetas selama 4 7 hari
menjadi larva. Makanan zebrafish adalah plankton, crutacean, dan beberapa jenis cacing
serta larva serangga[4]. Oleh karena itu, pada penelitian ini akan dilakukan uji pendedahan
cypermethrin terhadap ekspresi gen caspase-3 pada zebrafish.

Metodologi Kerja
Persiapan Alat dan Bahan
Alat yang digunakan diantaranya adalah mikropipet 10L, 100L, dan 1000 L, Bio-Rad
thermal cycler, sentrifuga, alat elektroforesis, penangas, gelas ukur, tabung falcon, icebox,
timbangan analitik, dan autoclave. Bahan yang digunakan pada penelitian kali ini adalah
Zebrafish, tips, syringe 1 mL, column microtube, akuades, deion, cypermethrin, PBS,
acetone buffer TAE 10x, agarose, microtube 1.5 mL, PCR Tube, GeneJet RNA Purification
Kit, DreamTaq Green PCR Master Mix, dan RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit.
Pendedahan Cypermethrin dan Pengambilan Sampel
Zebrafish diaklimatisasi terlebih dahulu sebelum digunakan untuk penelitian. Setelah
diaklimatisasi, diberikan perlakuan pada Zebrafish. Terdapat tiga perlakuan berbeda. Ketiga
perlakuan tersebut adalah Kontrol (pendedahan dengan akuades), pendedahan dengan 0.3
g/L cypermethrin, dan pendedahan dengan 3 g/L cypermethrin. Tiap perlakuan
menggunakan 9 ekor Zebrafish. Pendedahan dilakukan secara imersi selama empat hari.
Isolasi RNA Zebrafish
RNA yang akan diisolasi berasal dari organ dalam zebrafish. Isolasi RNA Zebrafish
dilakukan menggunakan GeneJet RNA Purification Kit dari ThermoFisher Scientific.

Pengaruh Cypermethrin terhadap Ekspresi Gen Caspase-3 pada


Zebrafish (Danio rerio)
Sampel Zebrafish yang sudah diberikan perlakuan dibedah untuk diambil organ dalamnya.
Setelah itu, organ dalam Zebrafish dimasukkan kedalam microtube 1.5 mL yang berisi lysis
buffer 300 L beserta -merkaptoetanol. Organ diresuspensi menggunakan syringe hingga
tercacah halus. Microtube divortex agar suspensi lebih tercampur. Tambahkan 600 L
Proteinase K yang sudah dicairkan (10 L Proteinase K dicampur dalam 590 L PBS).
Campuran lalu divortex dan diinkubasi pada 15-25oC 10 menit. Setelah itu, campuran
disentrifugasi selama 5 menit; 12000 g. Supernatan diambil dan dimasukkan kedalam
microtube berisi RNAse-free water. Ditambahkan 450 L etanol 96% dan divortex
kembali.
700 L campuran dimasukkan kedalam GeneJET RNA Purification Column. Kolom
disentrifuga selama 1 menit; 12000 g. Buang pengotor dan taruh kembali purification
column ke collection tube. Ulangi langkah ini sampai semua campuran dipindahkan ke
kolom dan tersentrifugasi. Buang collection tube yang berisi larutan pengotor. Taruh RNA
yang sudah dipurifikasi kedalam PCR tube 0.2 mL baru. Ditambahkan 700 L Wash Buffer
1 yang memiliki kandungan seperti tabel 1 kedalam GeneJET RNA Purification Column
lalu disentrifuga selama 1 menit; 12000 g.
Tabel 1. Kandungan Wash Buffer 1 dan 2 [12]

Buang pengotor dan purification column dikembalikan ke collection tube. Ditambahkan


600 L Wash Buffer 2 kedalam GeneJET RNA Purification Column lalu disentrifuga
selama 1 menit; 12000 g. Buang pengotor dan purification column dikembalikan ke
collection tube.
Ditambahkan 600 L Wash Buffer 2 kedalam GeneJET RNA Purification Column lalu
disentrifuga selama 2 menit; 12000 g. Ditambahkan 100 L nuclease-free water kedalam
membran GeneJET RNA Purification Column lalu disentrifuga selama 1 menit; 12000
g. Pellet dibuang, diambil supernatannya. Hasil disimpan pada -70 oC -20oC.
Konfirmasi dengan Elektroforesis
Elektroforesis digunakan sebagai metode konfirmasi kehadiran RNA yang diisolasi. Dalam
elektroforesis, digunakan agarose sebagai mediumnya. Agarose yang digunakan sebanyak 1.4
g. Agarose lalu dicampur dengan Buffer TAE sebanyak 140 mL didalam gelas kimia.
Campuran dipanaskan pada penangas air hingga tercampur. Setelah itu, larutan dimasukkan
kedalam well sambil dipasang comb dan larutan ditunggu hingga dingin. 1 L loading dye

M.Alvin Akbar, Dhia Shofi S, Meilisa, Bunga Indraswari S, Agnia Vibriani

beserta 5 L sampel RNA diambil lalu dicampurkan. Ulangi hingga seluruh sampel RNA
tercampur loading dye. Campuran lalu dimasukkan kedalam well. Pasang alat
elektroforesis dan elektroforesis dijalankan pada arus 70 Volt selama 30 menit. Hasil
elektroforesis dilihat dibawah sinar UV dan diamati.
Sintesis cDNA embryo Zebrafish
Sintesis cDNA merupakan proses pembuatan cDNA dengan RNA sebagai cetakannya
menggunakan enzim reverse transcriptase (RT). Sintesis cDNA yang dilakukan
menggunakan RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit dari ThermoFisher Scientific.
Bahan-bahan terlebih dahulu dicairkan dan disentrifuga sebentar sebelum digunakan.
Reagen-reagen pada tabel 2 ditambahkan pada tabung steril secara berurutan.
Tabel 2. Volume Template RNA, Primer, dan Nuclease-Free Water Digunakan [13]

Lalu ditambahkan reagen-reagen pada tabel 3 secara berurutan


Tabel 3. Volume Reaction Buffer, RiboLock RNase Inhibitor, dan dNTP Mix, dan RevertAid MMuLV RT Digunakan [13]

Setelah semua reagen dicampurkan, campuran diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30


menit. Ditambahkan juga 1 L 50mM EDTA dan diinkubasi pada 65 oC selama 10 menit.
RNA yang telah disiapkan digunakan sebagai bahan reverse transcriptase.

Pengaruh Cypermethrin terhadap Ekspresi Gen Caspase-3 pada


Zebrafish (Danio rerio)
Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)
Teknik Reverse Transcriptase PCR atau RT-PCR merupakan suatu proses amplifikasi
atau memperbanyak materi genetik secara in vitro. RT-PCR dilakukan menggunakan
DreamTaq Green PCR Master Mix. Langkah pertama, DreamTaq Green PCR Master Mix
(2x) divortex setelah dicairkan. Tabung tipis PCR diletakkan pada es dan ditambahkan
reagen seperti tabel 4.
Tabel 4. Kandungan DreamTaq Green PCR Master Mix Digunakan [14]

Setelah itu, sampel divortex lalu di sentrifugasi. Sampel dilakukan PCR menggunakan
thermal cycler dengan kondisi seperti tabel 5.
Tabel 5. Kondisi Temperatur dan Waktu pada saat PCR [14]

Apabila PCR sudah selesai, diambil 5 L campuran PCR lalu ditaruh pada well gel
elektroforesis untuk dilihat hasil sintesis cDNAnya.

Hasil dan Pembahasan


ImageJ merupakan program pemroses gambar yang didesain bersifat open architecture
sehingga dapat digunakan sebagai alat untuk berbagai analisis berbasis visual. Salah satu
aplikasi ImageJ adalah dengan mengkuantifikasi hasil elektroforesis untuk menentukan
tingkat ekspresi gen. Dengan mengukur tingkat fluoresensi dari pita yang dihasilkan,

M.Alvin Akbar, Dhia Shofi S, Meilisa, Bunga Indraswari S, Agnia Vibriani

tingkat suatu ekspresi gen dapat ditentukan [8]. Hasil dari kuantifikasi ekspresi gen -aktin
dan caspase-3 oleh ImageJ dapat dilihat pada gambar 1.
Gambar 1 (a) Hasil Kuantifikasi ImageJ Terhadap Ekspresi Gen -Aktin dan Caspase-3, (b)
Tingkat Ekspresi Caspase-3 relatif terhadap aktin

Hasil kuantifikasi menunjukkan bahwa ekspresi gen dari -aktin cenderung stabil untuk
ketiga perlakuan. Hal ini dikarenakan gen -aktin yang merupakan housekeeping gene.
Housekeeping genes selalu diekspresikan pada sel karena dibutuhkan untuk kelangsungan
hidup sel tersebut. Sehingga sintesis mRNA dari gen tersebut dianggap stabil meskipun
dalam uji perlakuan. Ekspresi gen dari caspase-3 memiliki gradasi peningkatan dari
kontrol hingga perlakuan 3 g/L. Hal ini sesuai dengan literatur di mana aktivitas
ekspresi caspase-3 mengalami peningkatan seiring meningkatnya pendedahan
cypermethrin [9].
Cypermethrin merupakan insektisida golongan pyrethroid yang dapat menginduksi
terbentuknya ROS (Reactive Oxygen Species) yang berlebihan. Konsentrasi ROS yang
tinggi dapat memicu terjadinya oxidative stress. Cypermethrin dapat menginduksi
terjadinya kerusakan oksidatif pada DNA (misalnya strand breaks atau modifikasi
nukleotida). Hal itu terjadi terutama pada organ vital seperti otak, hati dan ginjal [9].
Terbentuknya ROS dan oxidative stress merupakan sinyal apoptosis. Kebanyakan sinyal
apoptosis berhubungan dengan perubahan dari ekspresi p53, Bcl2/Bax dan sitokrom c.
Protein p53 merupakan regulator apoptosis. Aktivasi p53 akan menginduksi transkripsi
dari gen yang mengkodekan protein pro-apoptosis [8]. Famili Bcl-2 merupakan regulator
apoptosis. Saat ini ada 18 anggota famili Bcl-2 yang telah diidentifikasi. Bcl-2 dan BclxL merupakan anggota dari famili Bcl-2 yang berfungsi sebagai anti-apoptosis. Bax, Bak
(Bcl-2 associated killer), Bid dan Bad (the Bcl-2 associated death molecule) merupakan
protein pro-apoptosis. Protein Bcl-2 terletak di membran luar mitokondria. Ketika rasio
antara Bcl-2/Bax menurun, maka apoptosis akan terinduksi, yakni melalui pengeluaran
sitokrom c dari mitokondria. Sitokrom c yang berada di sitosol membantuk kompleks
dengan Apaf-1, ATP, dan caspase-9. Kompleks tersebut disebut apoptosom. Apoptosom
adalah suatu protease yang bertugas memotong protein lain. Salah satunya adalah
mengaktifkan procaspase 9 menjadi caspase-9. Selanjutnya caspase-9 akan
mengaktifkan procaspase 3 menjadi caspase-3. Caspase-3 akan menginduksi terjadinya
apoptosis [10].

Pengaruh Cypermethrin terhadap Ekspresi Gen Caspase-3 pada


Zebrafish (Danio rerio)

Gambar 2 Mekanisme Apoptosis Jalur Intrinsik [9]

Kesimpulan
Cypermethrin dapat meningkatkan apoptosis ditunjukkan dengan meningkatnya ekspresi
gen caspase-3 pada perlakuan 0,3 g/L dan 3 g/L.

Daftar Pustaka
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]

Jin, Yuanxiang; Zheng, Shanshan; dan Fu, Zhengwei. 2010. Embryonic


Exposure to Cypermethrin Induces Apoptosis and Immunotoxicity in
Zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 30: 1049-1054.
Cox, Caroline. 1996. Cypermethrin. Journal of Pesticide Reform, 16 (2) :
15-20.
Alberts, Bruce. , Bray, D., Hopkin, K., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M.,
Roberts, K., dan Walter, P. 2014. Essential Cell Biology 4th edition. New York:
Garland Science.
Lawrence, Christian. 2007. The Husbandry of Zebrafish (Danio rerio): A
review. Aquacuture. 269 : 1-20.
Marchler-Bauer, A. 2007. CDD: a conserved domain database for interactive
domain family analysis. Nucleic Acids Research. 35:. 237-240.
Nam, Kyung Douglas., Lee, Sanggyu., Zhou, Guolin., Cao, Xiaohong., Wang,
Clarence., Clark, Terry., Chen, Jianjun., Rowley, JD., dan Wang, MS. 2002.
Oligo(dT) primer generates a high frequency of truncated cDNAs through

M.Alvin Akbar, Dhia Shofi S, Meilisa, Bunga Indraswari S, Agnia Vibriani

[7]
[8]

[9]

[10]
[11]
[12]

[13]

[14]

internal poly(A) priming during reverse transcription. PNAS. 99 (9): 61526156.


Pollard, T.D. & Cooper, J.A. 1986. Actin and actin-binding proteins. A
critical evaluation of mechanisms and functions. Annu. Rev. Biochem. 55:
987-1035.
Antiabong, J., Ngoepe, M., Abechi, A. 2016. Semi-Quantitative Digital
Analysis of Polymerase Chain Reaction-Electrophoresis Gel: Potential
Aplications in Low-Income Veterinary Laboratories. Vet World. 9(9): 935939.
Jin, Yuanxiang, Zheng, Shanshan, Pu, Yue, Shu, Linjun, Sun, Liwei, Liu,
Weiping., Fu, Zhengwei. 2011. Cypermethrin has the potential to induce
hepatic oxidative stress, DNA damage and apoptosis in adult zebrafish (Danio
rerio). Chemosphere. 82: 398-404.
Widlak, P. 2000. The DFF40/CAD endonuclease and its role in apoptosis.
Acta Biochim Pol. 47(4): 1037-1044.
Xu, WN; Liu, WB; Liu, ZP. 2009. Trichlorfon-induced apoptosis in
hepatocyte primary cultures of Carassius auratus gibelio. Chemosphere.
77:895-901.
Thermo Scientific, "PRODUCT INFORMATION: Thermo Scientific
GeneJET RNA Purification Kit #K0731, #K0732" 2014. [Online]
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0012664_GeneJET_
RNA_Purification_UG.pdf. Diakses 26 November 2016.
Thermo Scientific, "PRODUCT INFORMATION: RevertAid First Strand
cDNA
Synthesis
Kit
#K1622"
2014.
[Online]
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0012716_RevertAid_
FirstStrand_cDNA_Syn_K1622_UG.pdf. Diakses 26 November 2016.
Thermo Scientific, "PRODUCT INFORMATION: DreamTaq Green PCR
Master
Mix
(2X)
#K1081"
2014.
[Online]
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0012704_DreamTaq_
Green_PCR_MasterMix_K1081_UG.pdf. Diakses 26 November 2016.