Universidad de Oriente

Ncleo Bolvar
Escuela de Ciencias de la Salud
Departamento de Bioanalisis
Virologa

METODOS FISICOS PARA EL

ESTUDIO DE LOS VIRUS

Profesora:

Lcda. Anglica Farrera

Br. (s):
Cherubin Laurimar CI: 22723612
Cordero Osmal

CI: 19622613

Daz Yeksy

CI: 20286938

Gutirrez Nathaly

CI: 18787582

Martnez Liannet

CI: 21109604

Ciudad Bolvar, Abril del 2015

ULTRACENTRIFUGACIN

Es un procedimiento comn en microbiologa y citologa, usado para

separar ciertos orgnulos de su respectiva clula para un anlisis posterior de
partes especficas de las clulas.
En el proceso, primero se homogeniza una muestra de tejido para
romper las membranas celulares y mezclar los contenidos de las clulas.
Luego, esta mezcla homognea es sometida a repetidas centrifugaciones, cada
vez removiendo el precipitado e incrementando la fuerza centrfuga,
finalmente la purificacin debe ser hecha por la sedimentacin de equilibrio y
la capa deseada es extrada para un futuro anlisis.
La separacin est basada en el tamao y la densidad, donde las
partculas ms grandes y densas son precipitadas en centrifugaciones de poca
fuerza. Por ejemplo, las clulas completas no homogenizadas sern
precipitadas en centrifugaciones con poca fuerza y en cortos intervalos como
1,000g por 5 minutos. Los fragmentos ms pequeos de las clulas y los
orgnulos permanecen en el lquido sobrenadante y requieren ms fuerza
centrfuga y ms tiempo para precipitarse. En general, uno puede enriquecer
(separar o concentrar) los siguientes componentes de la clula, en orden de
separacin, con la presente aplicacin:
Clulas completas y ncleos:
- Mitocondria
- Lisosomas
- Peroxisomas;
- Microsomas (vesculas del retculo endoplasmtico)
- Ribosomas
- Citosoles.

La muestra homogeneizada ahora est lista para la centrifugacin en

una ultracentrifugadora.
Ultracentrifugadora: Consiste en una cmara al vaco y refrigerada que
contiene un rotor, el cual es manejado por un motor elctrico capaz de girar a
alta velocidad. Las muestras son ubicadas en tubos que se encuentran dentro
del rotor o sujetos a este. La velocidad rotacional puede alcanzar ms de
100.000 rpm para el modelo floor, 150.000 rpm para el modelo bench-top
(Beckman Optima Max-XP), generando fuerzas centrifugas entre 800.000g y
1.000.000g. Esta fuerza causa la sedimentacin de macromolculas e incluso
puede causar una distribucin no uniforme de molculas pequeas. Como los
diferentes fragmentos de la clula tienen diferentes tamaos y densidades,
cada fragmento se va a depositar en un precipitado con diferentes fuerzas
centrifugas mnimas.
De esta manera, la separacin de la muestra en diferentes capas puede
realizarse mediante un primer centrifugado de la muestra homognea original
bajo fuerzas dbiles, removiendo el precipitado, y posteriormente exponiendo
las subsecuentes fases sobrenadantes a campos centrfugos cada vez mayores.
Cada vez, una porcin de diferente densidad es precipitada a la parte
inferior del tubo y es extrada. La repetida aplicacin de este proceso produce
un rango de capas que incluye diferentes partes de la muestra original.
Algunos pasos adicionales pueden realizarse para refinar an ms cada
uno de los precipitados obtenidos. La sedimentacin depende de la masa, la
forma y el volumen especfico parcial de una macromolcula, as como
tambin de la densidad del solvente, el tamao del rotor y la tasa de rotacin.
La velocidad de sedimentacin puede ser monitoreada durante el
experimento para calcular la masa molecular, as como el coeficiente de
sedimentacin. Valores grandes de sedimentacin corresponden a un mayor
peso molecular. Partculas ms densas se sedimentan a mayor velocidad. Las
protenas largas tienen mayores coeficientes de friccin y se sedimentan ms
lentamente para asegurar mayor precisin.

TIPOS DE CENTRIFUGACIN
Consiste en obtener concentrados vricos para lo cual se aprovecha la
velocidad de sedimentacin en el tubo de los virus y las fuerzas de
centrifugacin.
DIFERENCIAL: Se basa en la diferencia en la densidad de las molculas, esta
diferencia debe ser grande para que sea observada al centrifugar. Las
partculas que posean densidades similares sedimentarn juntas.
Este mtodo es inespecfico, por lo que se usa como centrifugacin
preparativa para separar componentes en la mezcla (por ejemplo, para separar
mitocondrias de ncleos y membrana) pero no es til para separar molculas.
CENTRIFUGACIN ISOPCNICA: Partculas con el mismo coeficiente de
sedimentacin se separan al usar medios de diferente densidad. Se usa para la
separacin de ADN con mucha frecuencia.
CENTRIFUGACIN ZONAL: Las partculas se separan por la diferencia en la
velocidad de sedimentacin a causa de la diferencia de masa de cada una, la
muestra se coloca encima de un gradiente de densidad preformado, por la
fuerza centrfuga las partculas sedimentan a distinta velocidad a travs del
gradiente de densidad segn su masa. Se debe tener en cuenta el tiempo de
centrifugacin ya que si se excede, todas las molculas podran sedimentar en
el fondo del tubo de ensayo.

MICROSCOPIA ELECTRNICA
La microscopia electrnica (ME) ha sido ampliamente utilizada para
identificar las partculas virales presentes en especmenes clnicos, basada en
la morfologa tpica de algunos viriones y sin la necesidad de periodo de
replicacin viral.
Existen dos mtodos para el estudio de especmenes clnicos mediante
la ME:
- El de contraste o tincin negativa en el que la muestra o la pequea
suspensin de partculas se deposita sobre una rejilla de microscopia.

- El segundo mtodo se aplica a tejido o cultivo celulares y requiere un largo

periodo de fijacin e inclusin en resinas epxicas: la muestra es cortada en
pequeas muestras de 70nm, sujeta a colorantes de contraste y observadas en
ME.
La microscopia electrnica es un mtodo rpido que no requiere en
forma sistemtica de reactivos especficos de familia o grupo viral. Los virus
desnudos son lo suficientemente resistente y no alteran su morfologa durante
los procedimientos tcnicos que utiliza la ME resulta muy til.
Para una mejor sensibilidad, es necesario que la muestra contenga
grandes cantidades de antgeno viral del orden de 10 a la 6 A 10 a la 7
partculas por ml, lo que limita este mtodo a entidades con alta excrecin
viral. En caso de un nmero de partculas inferior, es necesario concentrar la
muestra por medio de la ultracentrifugacion o de uso de anticuerpos
especficos (inmunoelectromicroscopia).

SOMBREADO
Consiste en depositar a los virus sobre una rejilla y hacer incidir sobre la
misma un metal, normalmente platino, con un cierto ngulo respecto a la
rejilla. El platino cubre a los virus pero queda en un lado una sombra de color
claro (el platino queda oscuro) entonces en la rejilla, se vern los virus
oscuros y la sombra clara. Se observara una imagen de aspecto tridimencional

TINCIN NEGATIVA
Consiste en mezclar una suspensin donde suponemos estn los virus
con una sal densa a los electrones, por ejemplo: acetato de uracilo,
fosfotunsgtato potsico (cido fosfotungstico), esta mezcla se deposita en una
rejilla de microscopia electrnica y se observa en un microscopio electrnico
de transmisin. Con esta tcnica los virus no se tien en realidad sino lo que se
tie es el medio, esta es la ms usada porque es la ms sencilla.

Los agentes de tincin ms usados son el molibdato amnico, el

fosfotunsgtato sdico y sales de uranio como acetato y formiato. Todos ellos
presentan las siguientes propiedades: interactan mnimamente con la muestra
y son estables en la interaccin con los electrones, son altamente solubles en
agua, presentan una alta densidad que favorece el contraste, tienen un punto
alto de fusin, tienen un tamao de grano pequeo.

TINCIN POSITIVA
El sistema enzimtico inducible por virus usa un sistema de cultivo de
clulas BHK, con un gen clonado (agregado) para Betagalactosidasa que solo
se expresa cuando la clula es infectada por un virus. Existe un sistema
denominado ELVIS-HSV, las clulas BHK diseadas por vas genticas se ven
por placas de micro titulaciones con varios pocillos, despus de las siembras
de las muestras la incubacin durante una noche, el desarrollo del HSV da
como resultado la produccin de Betagalactosidasa por las clulas BHK. La
Betagalactosidasa funciona con molculas Indicadoras cuando las clulas se
fijan y se tien para buscar actividad de galactosidasa una tincin positiva
indica la presencia de HSV-1 o HSV-2. Los pocillos que no contienen HSV no
muestran tincin alguna.

CORTES FINOS
Los cortes finos de tejido incluido en resinas epxicas toman 2 a 3 das
para ser procesados, pueden acompaarse de mtodos de inmunotincion o
tincin negativa y por su demora no hacen parte de las tcnicas rpidas de
diagnstico viral, alternativamente pueden realizarse cortes ultrafinos para
diagnsticos rpidos de 3 a 4 horas a pesar de que la sea un mtodo rpido y
poco costoso en pases subdesarrollados tiene como limitacin que muy pocos
sitios cuentan con las instalacin adecuadas y el personal calificado para
realizar este tipo de estudios.

durante la tincin positiva los iones del metal pesado reccionan con
macromolculas de la muestra incrementando su contraste. En el caso de la
Tincin Negativa (Hall, 1955; Huxley, 1957; Hall y Litt, 1958; Brenner y
Horne, 1959), la macromolcula no es teida sino que es rodeada por el
contrastante electrn-denso (ver figura 1). Como resultado de lo anterior, la
muestra aparece en contraste negativo, es decir electrn-transparente en
contraste con un fondo electrn-denso. Los contrastantes negativos no son
usados sobre muestras seccionadas sino sobre muestras completas e
intactas, p.ej. virus, bacterias, organelos celulares, etc las cuales han sido
colectadas sobre rejillas cubiertas con membrana de soporte.
Frecuentemente las muestras a ser preparadas segn esta tcnica no son
fijadas previamente, obtenindose sin embargo un nivel de resolucin
aceptable y, en ocasiones, mejor que por la tcnica del corte ultrafino. esto
se explica por la ausencia de material plstico alrededor de la muestra a
observar. La tcnica de tincin negativa es muy simple, rpida y slo se
necesita un mnimo de experiencia y equipo para su realizacin. Entre las
sales de metales pesados ms usados como contrastantes negativos se
encuentran: Molibdato de Amonio (1-3% acuoso), Fosfotungstato de Sodio
(producto de la neutralizacin del cido Fosfotngstico -PTA- con NaOH 1N)
1-2% acuoso, Acetato de Uranilo (0.5-2% acuoso), Formato de Uranilo (0.52% pH 4.5-5.2 ajustado con Hidrxido de Amonio).