CAPTULO 10
10.3 Naturaleza qumica de los genes
Estructura del DNA: Los genes se componen de DNA. La estructura del DNA fue descubierta por James Watson
y Francis Crick en 1953.
Composicin de las bases: La unidad del DNA es un nucletido formado por una desoxirribosa de 5 carbonos,
el cual se une al fosfato en la posicin 5 y una base N en el carbono 1. Las pirimidinas (T y C) poseen un solo
anillo y las purinas (A y G) poseen dos anillos. Los nucletidos se unen de forma covalente unos a otros. La
desoxirribosa se una al fosfato por un enlace 3-5 fosfodiester. El nucletido tiene una estructura polarizada.
El fosfato se localiza en el 5. La distancia entre nucletidos es 3.4 Amstrongs. Erwin Chargaff demostr que
las diferentes especies posen diferentes proporciones de A:G. Y determin que [A] = [T], [G] = [C], [A] + [T]
[G] + [C]
Propuesta de Watson y Crick: Usando la informacin de Rosaline Franklin propusieron el modelo de la doble
hlice, concluyeron que:
1.- Se compone de dos cadenas de nucletidos.
2.- Las dos cadenas se ordenan en espiral una con otra en hlice dextrgira (sentido de m. Reloj)
3.- Las dos cadenas son antiparalelas.
4.- El esqueleto fosfato azcar est hacia fuera y el fosfato le da carga negativa a la molcula.
5.- Las bases son mas o menos perpendiculares al eje longitudinal de la molcula. Las interacciones hidrfobas
y las fuerzas de Van der Waals le dan estabilidad a la molcula.
6.- Las cadenas se unen por puentes de hidrogeno entre las bases de cadenas opuestas.
7.- La distancia entre el tomo de fosforo y el centro de la doble cadena es 1nm. En total la cadena tiene 2nm
de ancho.
8.- Una purina siempre se une a una pirimidina y viceversa.
9.- Los tomos de N se unen al 4to carbono de la citosina y al 6to de la adenina y se encuentran en la forma
amino NH2. Los tomos de O se unen al carbono 6to de la guanina y 4to de la timina y estn en la configuracin
ceto (C=O). As la unin de las bases es A-T, y G-C.
10.- Los espacios en los giros de la hlice forman dos surcos, uno mayor y uno menor. Estos rodean en espiral
la superficie externa de la doble hlice. Las protenas que se unen al DNA se unen en estos surcos.
11.- La vuelta completa cada 10 nucletidos es de 3.4 nm. (conf. B)
12.- La secuencia de nucletidos en una cadena es fija respecto a la otra. Ambas cadenas son complementarias
entre s.
Importancia de la propuesta de W y C: La molcula debe cumplir tres funciones principales: 1.Almacenamiento de la informacin gentica: DNA debe contener la informacin para el orden especfico de
aminocidos de todas las protenas que sintetiza el organismo. Esto determina las caractersticas heredables de
un organismo.
2.- Replicacin y herencia: El DNA debe contener la informacin para la sntesis de nuevas cadenas. Y de esta
forma permitir que la informacin gentica se transporte a otras clulas y a su descendencia.
3.- Expresin del mensaje gnico: El DNA acta como director de la actividad celular, especifica el orden de
los aminocidos en la cadena polipptida. La informacin contenida debe expresarse de alguna forma que
participe en los sucesos internos de la clula.
La informacin en el DNA reside en la secuencia linear de sus bases y a cada gen le corresponde un segmento
de DNA. Un cambio en dicha secuencia produce una mutacin hereditaria en cada gen. La ruptura de los enlaces
de hidrogeno en la doble hlice produce una divisin gradual de la cadena que acta como molde para formar
una cadena complementaria. Y as se obtienen dos cadenas de DNA idnticas entre s e iguales a la cadena
original. Cada doble hlice contiene una cadena original y una cadena nueva.
DNA superenrollado: El DNA est superenrollado cuando se enrolla si mismo como una liga torcida en
direcciones opuestas. Est DNA ocupa menos volumen y se mueve con mayor rapidez en un campo de fuerza
centrfuga o elctrica. Se dice que el DNA est relajado si ocupa un promedio de 10 bases por vuelta de hlice.
El DNA est desenrollado cuando tiene un mayor nmero de bases por vueltas por hlice. Debido a que la
molcula es ms estable con 10 bases por vuelta, tiende a oponerse al esfuerzo para desenrollarla y se tuerce
sobre si misma para adquirir una configuracin superenrollada. Se dice que el DNA est negativamente
superenrollado cuando tiene ms de 10 residuos por vuelta de hlice y positivamente superenrollado cuando
est torcido de manera excesiva. Las molculas de ADN circular se encuentran superenrolladas de manera
negativa. El superenrollamiento tambin ocurre en el DNA lineal de eucariotas. El superenrrollamiento negativo
permite que el DNA de los cromosomas se compacte y llene el ncleo. Tambin, debido a que el
superenrollamiento est distorcido, ejerce una presin que separa las dos cadenas de la hlice, fundamental
para la transcripcin y replicacin. Las topoisomerasas (descubiertas por James Wang) son enzimas cambian
la topologa del DNA, cambiando as el estado de enrollamiento del DNA. Las topoisomerasas tipo 1 cambian
el estado de enrollamiento del DNA tras crear una ruptura transitoria en la cadena del dplex. La enzima corta
solo una cadena y permite que la otra cadena sufra una rotacin controlada la cual relaja la molcula
superenrollada. Impiden que ocurra un superenrollamiento excesivo. Las topoisomerasas tipo 2 rompen de
manera transitoria ambas cadenas de DNA dplex. Entonces otro segmento de la molcula del DNA (o una
molcula separada por completo) se transporta a travs de la rotura y las cadenas se unen de nueva cuenta. las
topoisomerasas de tipo II pueden anudar una molcula de DNA o desanudarla. Tambin pueden ocasionar que
una poblacin de crculos de DNA independientes se una (encadene), o separar crculos conectados en
componentes autnomos. La topoisomerasa II es necesaria para desenredar las molculas de DNA antes que los
cromosomas duplicados puedan separarse durante la mitosis.
10.4 Estructura del Genoma
Todos los individuos de una especie poseen el mismo conjunto de genes, sin embargo los individuos poseen
versiones variables de cada gen (alelos). De esta manera el contenido nico de informacin gentica de una
especie se denomina genoma.
Complejidad del Genoma: El DNA posee la capacidad de separarse en las dos cadenas que lo componen, esto
se denomina desnaturalizacin. El DNA sometido a una solucin salina y calentndose progresivamente
comienza a separarse. El progreso de desnaturalizacin trmica se cuantifica por el incremento de la absorbancia
de la radiacin UV que genera el DNA disuelto. La temperatura que corresponde a la mitad del cambio de
absorbancia se llama temperatura de fusin (Tm). Mayor el contenido de CG mayor Tm debido a que C-G se
unen por 3 puentes de hidrgeno. Si se enfra con lentitud el DNA desnaturalizado por calentamiento, la
molcula adquiere sus propiedades de doble hlice orginales. la renaturalizacin ha llevado al desarrollo de una
metodologa conocida como hibridacin de cidos nucleicos, en la cual las cadenas de nucletidos
complementarias obtenidas de diferentes fuentes pueden mezclarse para formar molculas bicatenarias
(hbridas).
Complejidad de genomas vricos y bacterianos. Son varios los factores que determinan la tasa de
renaturalizacin de una preparacin de DNA, e incluyen (1) la fuerza inica de la solucin, (2) la temperatura
de incubacin, (3) la concentracin de DNA, (4) el periodo de incubacin y (5) el tamao de las molculas que
interactan. Cuanto menor sea el tamao del genoma, mayor ser el nmero de genomas presentes en una masa
particular de DNA y ms probable ser la colisin entre fragmentos complementarios.
Complejidad del genoma eucariota: La renaturalizacin del DNA vrico y bacteriano se adecua a curvas
simtricas y sencillas debido a que todas las secuencias se encuentran en la misma concentracin por lo tanto
todas tienen la misma probabilidad de encontrar a su pareja. El DNA eucariota se renaturaliza a velocidades
muy distintas debido a que las secuencias en los nucletidos se encuentran en concentraciones distintas. Existen
tres clases abundantes de secuencias de DNA, secuencias muy repetidas, secuencias moderadamente repetidas,
secuencias no repetidas.
Secuencia repetidas: Las secuencias repetidas ocupan del 1 al 10% del DNA, por lo general son secuencias
cortas y se presentan en grupos que se repiten una y otra vez sin interrupcin (en tndem) y se dividen en 3.
DNA satlite: Son de secuencias cortas (5 pocos cientos de pb) que forman grupos muy largos, cada uno con
millones de pb. La composicin de bases de estos segmentos es lo suficientemente diferente del resto de DNA
para separarse en bandas satelitales mediante centrifugacin o gradiente de densidad. Tienden a aparecer
rpidamente en el transcurso de la evolucin y varan incluso entre especies estrechamente emparentadas. Se
localizan en los centrmeros. DNA minisatlite: Tamao de 10-100pb de longitud y se encuentran en grupos de
hasta 3000 repeticiones. Tienden a ser inestables y varian de una generacin a otra como resultado de
entrecruzamiento desigual. La longitud de un locus minisatlite especfico es muy variable en la poblacin.
Constituyen la base tcnica de identificacin mediante perfiles de DNA para reconocer criminales o paternidad.
DNA Microsatlite: Secuencias muy cortas (1-9pb) en segmentos pequeos (10-40). Se encuentran esparcidas
uniformemente por todo el DNA. Cambian de longitud a travs de las generaciones debido a que las enzimas
de replicacin del DNA tienen problemas con estas secuencias. Debido a su tamao variable en la poblacin se
usan para analizar diferentes poblaciones tnicas.
La hibridacin in situ se utiliz para localizar el DNA satlite en el genoma. El DNA cromosmico
desnaturalizado (por solucin salina y calor) permanece intacto y reacciona con una preparacin de DNA
marcado. El DNA que no ha reaccionado se lava o digiere y se observan los resultados en el microscopio.
Cuando se utiliza sondas fluorescentes la tcnica se conoce como hibridacin fluorescente in situ (FISH) y se
puede utilizar para mapear la ubicacin de secuencias diferentes la lo largo de fibras individuales de DNA.
Secuencias moderadamente repetidas: Pueden variar del 20 al 80% del DNA segn el organismo. Incluye
secuencias repetidas en cualquier parte del genoma, posee secuencias codificadoras y secuencias no
codificadoras. Secuencia con funciones codificantes: Incluye a los genes que codifican rRNA y genes que
codifican histonas. Las secuencias que codifican cada uno de estos productos son casi siempre idnticas y se
localizan en tndem. Es importante que estas secuencias sean abundantes debido a que sus productos se
requieren en grandes cantidades. Secuencias no codificantes: La mayor parte de secuencias moderadamente
repetidas no codifica. No se encuentran en tndem y se dispersan en el genoma como elementos individuales.
Se pueden agrupar en dos clases: elementos cortos intercalados (SINE) y elementos largos intercalados (LINE).
Secuencias no repetidas: Menos del 1.5 % del genoma. En este grupo se encuentran los genes que poseen
fragmentos de herencia mendeliana. Por la existencia de una sola copia en el genoma. Estas secuencias siempre
se localizan en un sitio especfico de un cromosoma particular. Las fracciones no repetidas contienen casi toda
la informacin gentica (excepto histonas). Los genes que codifican polipptidos son por lo general miembros
de una familia de genes relacionados. Ej: Actinas, miosinas, globinas, colgenos, tubulinas, integrinas y otras
protenas. Una secuencia relacionada, pero diferente codifica cada miembro de una familia multignica.
10.5 Estabilidad del Genoma.
La organizacin de la secuencia del genoma es capaz de sufrir cambios rpidos, de una generacin a la siguiente
o dentro de un organismo individual. Xenopus laevis posee el doble de genoma que X. tropicalis. La
poliploidizacin es un suceso en el cual se produce una descendencia que tiene dos veces el nmero de
cromosomas en cada clula, la descendencia tiene 4 homlogos en lugar de 2. Se puede producir de dos maneras
1.- dos especies se aparean para obtener un organismo hibrido que contiene los cromosomas combinados de
ambos progenitores (ms frecuente en plantas) o 2.- los cromosomas de un embrin unicelular se duplican pero
no se separan y el embrin permanece viable (ms frecuente en animales). La poliploidizacin es un suceso
frecuente en vegetales. Cuando esto sucede en muchos casos vuelve a su nmero diploide normal a travs de la
evolucin. Por esta razn los genomas de las plantas poseen una variacin mucho mayor a la cantidad de genes
que la que se observa en animales distintos. La duplicacin repentina del genoma le da a un organismo un
potencial evolutivo considerable en el caso de que sea viable. Las copias excesivas de un gen pueden eliminarse
por delecin, pueden quedarse inactivas por mutaciones, o pueden evolucionar y formar genes con funciones
nuevas. La informacin gentica adicional es materia prima para la diversificacin evolutiva. Susumu Ohno
propuso la hiptesis 2R, la cual dice que los vertebrados modernos evolucionaron a partir de un ancestro
invertebrado mucho mas simple a travs de dos ciclos separados de duplicacin completa del genoma durante
un periodo evolutivo temprano. La poliploidizacin ocurre con muy poca frecuencia durante la evolucin.
Duplicacin y modificacin de secuencias de DNA: La duplicacin gnica (doblar una pequea porcin de un
cromosoma) sucede con una frecuencia muy alta. Cada gen tiene una probabilidad del 1% de duplicarse cada
milln de aos. A menudo esto sucede por un entrecruzamiento desigual. Casi todos los genes duplicados se
pierden durante la evolucin por delecin o por alguna mutacin, pero en algunos casos la copia funcional extra
adquiere una nueva funcin. Lo mas frecuente es que ambas copias del gen sufran mutaciones y cada una
desarrolla una funcin ms especializada que la del gen original. Aun as tendran secuencias muy similares y
codificarn iso-formas diferentes de un gen en particular (ej, tubulinas a y b). Las duplicaciones sucesivas de
un gen pueden generar familias de genes que codifican polipptidos con secuencias relacionadas.
Evolucin de los genes de la globina: La hemoglobina se compone de 4 subunidades de globina. El gen esta
formado por 3 exones (codificantes) y dos intrones (no codificantes). Sin embargo, en genes de ciertos
polipptidos similares a la globina revela la presencia de 4 exones y 3 intrones. Se cree que la globina surgi a
partir de una forma ancestral del gen, por fusin de dos intrones hace 800M aos. La evolucin de los genes
vertebrados en cuestin ilustra el modo en que la duplicacin gnica suele provocar la generacin de una familia
de genes cuyos miembros individuales tienen funciones especializadas en comparacin con las del gen fundador
individual. Los seudogenes son genes que han sufrido mutaciones a lo largo del tiempo y se han tornado no
funcionales. El genoma humano posee 19.000 seudogenes. Aunque estos no codifiquen protenas funcionales,
pueden ser transcritos lo cual puede tener actividades reguladoras.
Genes saltarines y naturaleza dinmica del genoma: Algunas secuencias repetidas se encuentran en
ordenamientos en tndem y otras veces estn dispersas en el genoma. Se asume que los miembros de una familia
de secuencias repetidas provienen de una sola copia. Esto se debe a que ciertos elementos genticos se pueden
mover de un locus a otro diferente. Estas reconfiguraciones genticas se denominan (gracias a Barbara
McClintock) transposiciones y las entidades genticas mviles, elementos transponibles. Los transposones
codifican una protena o transposasa, la cual cataliza la ruptura de un transposn de un sitio donador del DNA
y su posterior insercin al sitio receptor especfico del cromosoma. Este mecanismo es llevado a cabo por dos
subunidades de transposasa separadas que se unen a secuencias especificas (repetidas e invertidas) localizadas
en los dos extremos del transposn. Las dos subunidades se unen para formar un dmero activo que cataliza una
serie de reacciones que conducen a la escisin del transposn. Luego el complejo transposasa-transposn se une
a un DNA blanco, donde la transposasa cataliza las reacciones necesarias para integrar al transposn en un
nuevo lugar. La inclusin del elemento crea una pequea duplicacin del DNA blanco que bordea al elemento
transpuesto en el sitio de insercin, esto sirve como huella para identificar los lugares que los elementos
transponibles ocupan en el genoma. En el ser humano al menos el 45% de DNA nuclear procede de elementos
transponibles. Y >99% es incapaz de moverse de un lugar a otro debido a mutaciones o por que la clula suprime
su movimiento. En algunos casos los elementos transponibles migran a la mitad de genes primordiales que
codifican protenas. 1 de cada 500 mutaciones patognicas es consecuencia de la insercin de un elemento
transponible. Hay dos tipos de elementos transponibles, los transposones y los retrotransposones. Los
transposones se escinden del DNA en el sitio donador y e insertan en una rea distante. Los retrotransposones
operan por mecanismo de copiado e insercin en los que interviene un RNA intermediario. El DNA del
retrotransposn se transcribe en un RNA, el cual se transcribe de forma contraria mediante la transcriptasa
inversa para generar un DNA complementario. La copia de DNA desarrolla una cadena adicional para crear un
dplex, el cual despus se integra en un sitio blanco del DNA. En la mayora de los casos el retrotransposn
contiene la secuencia que codifica la transcriptasa inversa.
Participacin de los elementos genticos mviles en la evolucin del genoma: La mayor parte de secuencias
moderadamente repetidas estn diseminadas y se generan por transposicin de los elementos genticos mviles.
Las dos secuencias moderadamente repetidas ms comunes en el genoma humano (Alu (SINE) y L1 (LINE))
son elementos transponibles. L1 (6000pb de longitud) codifica una protena nica con dos actividades
catalticas, una transcriptasa inversa que elabora una copia de DNA a partir del RNA que lo codifica y una
endonucleasa que corta el DNA blanco antes de la insercin. El genoma humano posee unas 500.000 copias de
L1 aprox. La mayor parte est formada por elementos inmviles incompletos. Sin embargo, L1 sigue
modificando la evolucin humana. Alu (300pb) es ms abundante que L1. La secuencia Alu es muy similar a
la del RNA pequeo presente en las partculas de reconocimiento de seales adheridas a los ribosomas unidos
a la membrana. Alu solo esta presente en primates y su tasa de transposicin es de una por cada 200 nacimientos.
Esto contribuye a la diversidad gentica humana. Los elementos transponibles es un tipo de parsito gentico
externo que puede invadir el genoma de un hospedador, diseminarse dentro de el y transmitirse a su
descendencia. Sin embargo puede tener contribuciones positivas durante el largo proceso de evolucin. 1.- En
ocasiones los transposones pueden llevar con ellos partes adyacentes del genoma hospedador al moverse de un
sitio a otro. Dos segmentos no unidos del genoma del hospedador se pueden conectar para formar un nuevo
fragmento compuesto. 2.- Las secuencias de DNA que en un principio surgieron de los elementos transponibles
forman parte de genes eucariotas y de segmentos de DNA que regulan la expresin gnica. Ej. Varios factores
de transcripcin. 3.- Los propios elementos transponibles parecen haber dado lugar a genes. La telomerasa,
enzimas involucradas en el reordenamiento de genes de los anticuerpos se pudieron haber derivado de productos
de transposones antiguos. 4.- Las clulas cerebrales de mamferos poseen un nivel elevado de transposicin L1,
se cree que dichos elementos mviles contribuyen a la diversidad de las actividades funcionales de las clulas
nerviosas.
La transposicin ha tenido un profundo impacto en la en la composicin gentica de organismos, los elementos
transponibles tienden a ser ms activos en el reino vegetal.
CAPITULO 13: Replicacin y reparacin del DNA
La maquinaria que realiza la replicacin del DNA y tambin tiene otra capacidad: la reparacin del material
gentico daado. Los portadores tempranos de la informacin gentica fueron quiz las molculas de RNA
capaces de auto replicarse. A pesar de que el DNA contiene la informacin para su propia replicacin, carece
de la capacidad para realizar esta actividad por si misma.
13.1 Replicacin del DNA: las dos cadenas de la doble hlice se mantienen juntas por medio de puentes de
hidrgeno entre las bases. Watson y Crick supusieron que durante la duplicacin, las cadenas se separan, cada
una puede actuar como una plantilla para dirigir la sntesis de la cadena complementaria y restaurar el estado
de la doble cadena.
Replicacin semiconservadora: cada uno de los dplex hijos consiste en una cadena completa heredado del
dplex parental y una cadena completa sintetizada de nueva cuenta. Se dice que es semi conservadora debido
a que cada descendiente contiene una cadena de la estructura parental. Existen otros dos modelos de replicacin
que fueron descartados ms tarde: replicacin conservadora y replicacin dispersiva. En la conservadora. En la
conservadora las dos cadenas parentales permanecen juntas luego de servir de plantillas y de igual manera
sucede con las cadenas hijas. En la dispersiva las cadenas parentales se cortan en fragmentos y nuevas cadenas
se sintetizan en segmentos cortos. Mattew Meselson y Franklin Stahl, usaron bacterias e isotopos 14 y 15 de
Nitrgeno para determinar el modelo de replicacin del ADN. Cultivaron bacterias en un medio con N15 y
como resultado sus bases solo tenan nitrgeno 15. Luego se traspasaron a un medio con N14. Se extrajo el
DNA y se someti a centrifugacin de equilibrio de gradiente de densidad. Despus de una generacin las
molculas fueron hibridas y su densidad de flotacin fue la mitad entre las cadenas pesadas y ligeras. Conforme
pasaron las generaciones, las cadenas fueron en su mayora ligeras y existieron an unas pocas hibridas. De esta
manera determinaron que la replicacin es semiconservadora. Los experimentos realizados por Hebert Taylor
demostraron que la replicacin en eucariotas es semiconservadora y que pueden sufrir entrecruzamiento durante
la mitosis. Para esto se cultiv clulas en bromodesoxiuridina (BrdU), un compuesto que se incorpora en el
DNA el lugar de la timidina.Luego de la primera replicacin las cadenas eran hibridas BrdU y timidina y en la
segunda existan cadenas hibridas y cadenas con BrdU pura.
Replicacin en clulas bacterianas: Se realizaron tcnicas genticas y bioqumicas como el aislamiento de
mutantes sensibles a la temperatura (ts) los cuales no puedan replicar su cromosoma a una temperatura elevada
(no permisiva/restrictiva) pero si lo pueden hacer a una temperatura mas baja (permisiva). A esta temperatura
las clulas pueden continuar su crecimiento y divisin. El desarrollo de sistemas in vitro en los cuales la
replicacin se puede estudiar mediante componentes celulares purificados. En E. coli se requieren al menos 30
proteinas para su replicacin.
Horquillas de replicacin y replicacin bidireccional: Empieza en una regin del cromosoma bacteriano
denominada como el origen en el cual se unen diferentes protenas para iniciar el proceso de replicacin. En E.
coli se denomina oriC. La replicacin se aleja del origen en forma bidireccional, y los puntos donde se unen los
segmentos replicados y los no replicados se conocen como horquillas de replicacin. En cada horquilla, la doble
hlice parental se separa y los nucletidos se incorporan en las cadenas complementarias resintetizadas. Las
horquillas se mueven en direcciones opuestas hasta un punto donde la replicacin concluye. Las cadenas se
separan y se dividen en dos clulas diferentes.
Desenrollamiento del dplex y separacin de las cadenas: Las cadenas sufren un proceso de Desenrollamiento
par que se pueda llevar a cabo la replicacin. La separacin de las cadenas del DNA dplex tiene diferentes
problemas, especialmente por la acumulacin de la tensin. La separacin de dos cadenas de una molcula de
DNA circular es anloga a tener un extremo de la molcula fijo a una pared. El problema est a que el DNA en
este caso adquirira un superenrollamiento positivo por delante de la horquilla de replicacin. En este caso, las
topoisomerasas cambian el estado de superenrollamiento del DNA, especficamente la DNA girasa
(topoisomerasa II). sta libera la tensin que se crea durante la replicacin en E. coli. La girasa se desplaza a lo
largo del DNA por delante de la horquilla de replicacin y elimina los superenrollamientos positivos. Para ello
corta las dos cadenas del DNA, un segmento pasa a travs de la rotura de la doble cadena hacia el otro lado y
se ligan los cortes de nuevo. Este proceso se lleva a cabo usando la energa del ATP.
Propiedades de las DNA polimerasas: Las DNA polimerasas son las enzimas que sintetizan el DNA. Para que
se de lugar esta reaccin se necesita una plantilla de DNA y los cuatro trifosfatos de desoxirribonuclesido. El
DNA monocatenario no sirve como plantilla, porque la polimerasa solo puede agregar nucletidos al extremo
3 de una cadena preexistente. La cadena que provee el OH 3 terminal se denomina iniciador. Todas las
polimerasas tienen dos requerimientos bsicos: Una cadena plantilla, y una cadena iniciadora en la cual se
de reparacin de aparamiento errneo que opera despus de la replicacin y corrige as las uniones errneas que
se escapan del paso lectura y correccin.
En E. coli la velocidad de replicacin del DNA es 1000 nucletidos/seg. (1 fragmento de okazaki en un
segundo), y la bacteria replica todo su DNA en 40 min.
Replicacin en eucariotas: El genoma eucaritico se demora horas en replicarse debido a que poseen amplios
genomas y estructuras complejas de cromosomas. Para el estudio de la replicacin se han aislado levaduras
mutantes incapaces de crear productos gnicos especficos para la replicacin. El anlisis de la estructura y los
procesos de las Polimerasas en arqueas, las cuales son homlogas a las de eucariotas y el desarrollo de sistemas
in vitro para que la replicacin pueda llevarse acabo en extractos celulares. El mas usado es el de la rana
Xenopus, cuyo huevo contiene todas las protenas requeridas para llevar a cabo mas de una docena de ciclos de
divisin celular. Los oocitos de esta rana replican cualquier DNA que se agregue y pueden mantener la
replicacin y divisin mittica de ncleos celulares de mamfero.
Inicio de la replicacin: Las clulas eucariticas tienen mltiples sitios de inicio de la replicacin. En los
humanos existen de 10,000 a 100,000 sitios de replicacin. Las clulas eucariotas replican su genoma en
pequeas porciones denominadas replicones. Aprox del 10 al 15% de replicones se dedican a la duplicacin
activa del DNA durante la fase S. Los replicones que se encuentran muy cerca entre s tienden a efectuar la
replicacin de manera simultanea. La presencia de histonas acetiladas (eucromatina), relacionada con la
transcripcin de genes, es un factor en la determinacin de la replicacin temprana de loci de genes activos. Las
regiones ms compactas que estn empaquetadas en la
heterocromatina, y que son las menos acetiladas son las ultimas en
replicarse. Por consiguiente la heterocromatina del cromosoma X
inactivo en hembras de mamfero se replica al final de la fase S. La
diferencia en el tiempo de replicacin no se relaciona con la
secuencia de DNA. Las secuencias que promueven la replicacin
del DNA se conocen como secuencia de replicacin autnoma
(ARS). El elemento central de una ARS es una secuencia conservada
de 11pb que funciona como un sitio de unin especfico para un
complejo multiprotenico llamado complejo de reconocimiento de
inicio (ORC). Si la ARS muta de modo que no se pueda unir al
ORC, no es posible el inicio de la replicacin. A diferencia de las
levaduras, el DNA de vertebrados no posee secuencias especficas
como el ARS en los cuales inicia la replicacin. Sin embargo
estudios in vivo sugieren que la replicacin comienza en sitios
especficos a lo largo del DNA y no aleatoriamente como es el caso
de los oocitos de la rana. Una molcula de DNA contiene muchos
sitios donde la duplicacin se puede iniciar, pero solo una pequea
parte de esos sitios se usa en un momento dado de una clula dada.
Las clulas que tienen ciclos celulares ms cortos, utilizan una
mayor cantidad de los sitios como orgenes de replicacin. La
eleccin real de los sitios se rige por factores epigenticos reales,
como las posiciones de nucleosomas, los tipos de modificaciones
de histonas, el estado de metilacin del DNA, el grado de
superenrollamiento y el nivel de transcripcin.
La replicacin se restringe a una por ciclo celular: Es importante
que el genoma se replique solo una vez durante el ciclo celular. En
consecuencia existen mecanismos que evitan el reinicio de la
replicacin en sitios donde este ya se ha duplicado. 1) Al origen de
replicacin lo une un complejo llamado ORC, que se relaciona con
el origen a travs del ciclo celular. En este ORC se unen las
protenas en los pasos subsecuentes. 2) Factores permisivos se unen
al ORC para ensamblar un complejo protenico-DNA de 6 protenas
MCM de forma anular llamado complejo de prerreplicacion (preRC), el cual es permisivo para iniciar la replicacin y posee
actividad helicasa (anloga a la DnaB en procariotas). Las MCM
son cargadas en el punto de origen de la replica con la ayuda de factores accesorios que se ligaron al ORC con
anterioridad. Cada punto de origen posee un doble complejo hexamrico MCM, es decir dos helicasas completas
as cuales se desplazarn en direcciones opuestas una vez que inicia la replicacin. Este ensamblado marca el
sitio en el genoma como un origen potencial de replicacin, pero no garantiza que comience la replicacin. 3)
Antes de comenzar la fase S del ciclo celular, la activacin de cinasas de protenas ocasiona la fosforilacin del
complejo MCM y otras protenas, y el comienzo de replicacin en sitios escogidos del genoma. Una de estas
cinasas es la cinasa dependiente de ciclina Cdk, la cual suprime la formacin de nuevos complejos de
prereplicacin. En consecuencia, cada origen slo puede activarse una vez por cada ciclo celular. 4) Al iniciarse
la replicacin las MCM se mueven con la horquilla de replicacin. Despus de la replicacin, en mamferos las
MCM se desplazan del DNA y no se pueden volver a relacionarse con un origen de replicacin ya utilizado.
La horquilla de replicacin eucariota: Todos los sistemas de replicacin requieren helicasas, protenas de unin
con el DNA monocatenario, topoisomerasas, primasa, DNA polimerasa, ligasa, pinza deslizante y cargador de
la pinza. Al igual que en bacterias, el DNA de eucariotas se sintetiza de manera semidiscontinua, y los
fragmentos de Okazaki de la cadena retrasada son ms pequeos que en bacteria (150 vs 1000pb). La polimerasa
que replica el DNA eucariota est presente en un dmero, y las cadenas adelantada y retrasada se sintetizan de
manera coordinada formando un complejo de replicacin o replisoma. Existen 5 polimerasas en las clulas
eucariotas: , , 7, y . La replica el DNA mitocondrial, la interviene en la reparacin del DNA y las otras
3 tienen funcin de replicacin.
La polimerasa se relaciona con la primasa e inician
la sntesis de cada fragmento de okazaki. La
polimerasa se une al DNA monocatenario cubierto
por una protena de unin RPA (Anloga a SSB). La
primasa ensambla el iniciador corto de RNA y
posteriormente la polimerasa aade 20
desoxiribunocletidos. Luego, la polimerasa
continua la construccin del fragmento de okazaki en
la cadena retrasada. La polimerasa es la enzima que
sintetiza el DNA en la cadena adelantada. Las
polimerasas y necesitan una pinza deslizante que
mantenga unida la enzima al DNA y le permita mover
continuamente a lo largo de la plantilla. Esta pinza se
conoce como PCNA (se le denomina cinturn de
herramientas moleculares) y el cargador de esta pinza
se conoce como RFC. Despus de la sntesis del iniciador de RNA (por la primasa)-DNA (por la DNA pol ),
la DNA pol se sustituye por el complejo PCNA-polimerasa , el cual completa la sntesis del fragmento de
Okazaki. La polimerasa al alcanzar el extremo 5 del iniciador de RNA anterior, lo desplaza y una
endonucleasa (FEN-1) corta el DNA recin sintetizado en el espacio del iniciador desplazado. Posteriormente
una ligasa sella la muesca resultante entre el DNAE recin sintetizado y el DNA sintetizado con anterioridad.
Las polimerasas , y tienen adems una actividad exonucleasa 3 5.
Replicacin y estructura nuclear: La horquillas de replicacin activas no estn distribuidas al azar, en realidad
se localizan en 50 a 250 sitios conocidos como lugares de replicacin. Este agrupamiento provee un mecanismo
para la coordinacin de la replicacin del los replicones adyacentes en cromosomas individuales.
Estructura y replicacin de la cromatina: Los cromosomas eucariticos consisten en DNA unido en complejos
de histonas las cuales se presentan en forma de nucleosomas. Los nucleosomas estn constituidos por una
mezcla de histonas heredadas y de histonas recin sintetizadas. El octmero central de histona de un nucleosoma
consiste en un tetrmero (H3H4)2 con un par de dmeros H2A/H2B. Los tetrmeros se distribuyen en forma
aleatoria entre las dos parejas hijas durante la replicacin. Los tetrmeros antiguos y nuevos se mezclan en la
molcula de DNA de cada hija. Otro modelo sugiere que el tetrmero (H3H4)2 se divide en los dos dmeros
H3/H4 y cada uno de ellos se puede mezclar con otro dinero complementario que despus se ensambla con
dmeros H2A/H2B. Existen varias protenas que facilitan el ensamblaje de los nucleosomas, entre ellas varias
chaperonas de histona capaces de aceptar histonas parentales o recin sintetizadas y transmitirlas a las cadenas
hijas. La chaperona CAF-1 se atrae a la horquilla de replicacin en movimiento mediante una interaccin con
la pinza deslizante PCNA. El estado transcriptivo de una clula depende en gran medida del estado epigentico
de la cromatina celular heredada de una generacin a la siguiente. Esta informacin est codificada en el perfil
de los residuos de citosina metilados en el DNA de la clula y en el perfil de las modificaciones
postraduccionales de las histonas centrales vinculadas con el DNA. En consecuencia, es esencial que estos
perfiles se transmitan desde la cromatina de origen a la cromatina de las clulas hijas. Los perfiles de metilacin
del DNA son transmitidos por medio de las actividades de la metiltrasnferasa de DNA. Dicha enzima agrega
grupos metilos a los
residuos citosnicos de
cadenas de DNA recin
sintetizadas usando el
patrn
de
tales
modificaciones en las
cadenas de DNA plantilla.
Reparacin del DNA: El DNA es una de las molculas ms susceptible al dao ambiental. Cuando es afectada
por radiacin ionizante, el esqueleto del DNA sufre roturas con frecuencia. Cuando se expone a diversos
reactivos qumicos, las bases pueden alterarse de forma estructural. Cuando se somete a radiacin UV, las
pirimidinas adyacentes en las cadenas de DNA interactan y forman dmeros. La energa producto del
metabolismo puede eliminar bases de adenina y guanina del esqueleto de DNA. Un mamfero puede perder
10000bases por da. Las clulas procariotas y eucariotas poseen protenas que recorren el DNA y buscan
alteraciones. En algunos casos, el dao se puede reparar directamente. Pero la mayora del tiempo, la reparacin
requiere que la cadena daada se elimine de manera selectiva. Gracias a la complementariedad del DNA si un
nucletido se elimina de una cadena, se puede sintetizar de nuevo usando la cadena molde.
La Reparacin de la escisin de nucletidos (NER) opera por mecanismos de corte y pegado. Acta para reparar
los dmeros de pirimidina y nucletidos en los cuales distintos grupos qumicos se han unido. Existen dos vas:
1. Va acoplada a la transcripcin, en la cual el ADN de los genes activos poseen prioridad y ocurre a medida
que el gen se transcribe debido a que la RNA polimerasa detecta el dao. 2. Va genmica global la cual corrige
los daos en el resto del genoma. Un componente clave de la reparacin NER es el factor TFIIH el cual tambin
participa en el inicio de la transcripcin. TFIIH posee dos subunidades (XPB y XPD) con actividad helicasa.
Estas enzimas separan ambas cadenas. Luego un par de endonucleasa corta la cadena daada a ambos lados de
la lesin y el segmento de DNA daado se elimina. Una vez hecho esto, la DNA polimerasa (/) rellena el
espacio y finalmente la ligasa liga las cadenas.
La Reparacin por escisin de bases (BER) lo inicia una DNA glucosidasa la cual reconoce la modificacin y
realiza un corte del enlace glucosdico entre la base y la desoxirribosa, eliminando as la base. Cada DNA
glucosidasa es especfica para un tipo de base alterada entre ellas el uracilo, la 8-oxoguanina y la 3-metiladenina.
Cuando la enzima detecta una base alterada, inserta una cadena lateral de aminocido en la hlice de DNA y
hace que el nucletido rote 180 grados fuera de la hlice y quede dentro del cuerpo de la enzima, si la base se
encuentra efectivamente modificada esta se ajusta al sitio activo de la enzima donde se divide de su azcar
relacionado. Si no lo est, la base es devuelta a su sitio original. Cuando la base se elimina, el remanente sin la
base se elimina por la accin de una endonucleasa (AP) y una DNA polimerasa B. La AP corta el esqueleto de
DNA y la actividad fosfodiesterasa de la polimerasa B elimina el azcar-fosfato remanente. La polimerasa
inserta un nucletido complementario y la cadena se liga por la accin de la DNA ligasa III. Una citosina se
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puede convertir en uracilo, es por ello que el uracilo no est presente en el DNA (pero est en el RNA) porque
generara dificultades en los sistemas de reparacin.
Reparacin de la unin deficiente: Es el proceso en el cual se eliminan las bases mal apareadas por la DNA
polimerasa durante la replicacin del DNA. Este proceso no es al azar porque si lo fuera se cometera errores el
50% de las veces. En E. coli, la cadena parental se distingue por la presencia de residuos de adenosina metilados.
En eucariotas el sistema MMR reconoce a la cadena parental, pero aun no se conoce el mecanismo.
Reparacin de la rotura de doble cadena (DSB): La radiacin ionizante (rayos X, gama) y ciertos productos
qumicos pueden generar roturas en la doble hlice del DNA. Una rotura en la doble cadena puede causar
anomalas cromosmicas serias. Las DSB se reparan en mamferos por la unin de extremos no homlogos
(NHEJ). Un complejo de protenas (Ku + DNA-PKcs) se une a los extremos rotos del dplex de DNA y cataliza
reacciones que unen de nuevo al DNA. Otro mtodo de reparacin de DSB es la recombinacin gentica y es
mucho mas compleja. Es similar al proceso que ocurre durante la recombinacin en la profase I de meiosis, sin
embargo en este ultimo el proceso es controlado y ocurren menos errores. Este proceso de reparacin del DNA
solo puede ser usado durante la fase S tarda o G2 del ciclo celular.
Entre la replicacin y la reparacin: Existe una enfermedad hereditaria llamada xeroderma pigmentoso XP que
provoca la incapacidad de reparar ciertas lesiones consecutivas a la exposicin a la radiacin ultravioleta. Los
enfermos con XP tienen un defecto en uno de los 7 genes que intervienen en la reparacin de la escisin de
nucletidos. Los individuos que padecen de XP son susceptibles a desarrollar cncer de piel. Cuando la
maquinaria de replicacin llega a un sitio daado en la cadena plantilla, permanece ah y una seal recluta una
polimerasa especializada que sintetiza la cadena complementaria a la lesin, luego de esto la polimerasa original
prosigue con la replicacin. La polimerasa no puede incorporar nucletidos de tipos opuestos en las lesiones de
la DNA plantilla. Este mecanismo se conoce como sntesis translesional (TLS). Las polimerasas TLS tienen un
sitio activo mas espaciosos de lo usual, capaces de recibir a los nucletidos alterados. Sin embargo no son
procesivas y no tienen la capacidad de lectura y correccin.
CAPTULO 11: Transcripcin y traduccin.
Relacin entre genes, protenas y RNA: Archibald Garrod investig la alcaptonuria y observ que en los
pacientes con esta enfermedad no poseen una enzima que oxida el cido homogentsico. Conforme se acumula,
se excreta en la orina y adquiere un color oscuro debido a la oxidacin del cido. Garrot haba descubierto la
relacin entre un gen, una enzima y una enfermedad metablica y llam a estas enfermedades como
metalopatas congnitas. George Beadle y Edwar tatum investigaron al hongo Neurospora, el cual crece en
medios muy simples y con la capacidad de sintetizar todos los metabolitos requeridos, por ende son sensibles a
deficiencias enzimticas. Radiaron las esporas del moho y las analizaron en busca de mutaciones que causaran
que las clulas carecieran de alguna enzima. Si las esporas no podan crecer en un medio mnimo pero si en un
medio complementado con alguna coenzima particular, los mohos eran mutantes. Estos mutantes posean
deficiencias enzimticas que impedan a la clula catalizar una reaccin metablica particular. Los resultados
fueron que un gen especfico portaba la informacin para elaborar una enzima particular. El concepto formal de
gen es un segmento de DNA que contienen la informacin para uno o varios polipptidos o para un o ms RNA
funcionales.
Sinopsis del trnsito de la informacin dentro de las clulas: La informacin contenida en el DNA se torna
asequible para las clulas gracias a la formacin de los RNA. Este proceso se denomina como transcripcin. En
este proceso se reescribe la informacin codificada en los cuatro desoxirribonucletidos de DNA en un lenguaje
de 4 ribonucletidos de RNA. El intermediario entre un gen y su polipptido es el RNA mensajero (mRNA). Un
mRNA se ensambla como una copia complementaria de las dos cadenas de DNA que constituyen un gen. Por
esta razn se describe a este RNA como una molcula de sentido. Los mRNA de organismos eucariotas no se
sintetizan en su forma final, sino que deben ser procesados a partir de precursores de mRNA de mayor tamao.
El uso de mRNA permite a la clula separar la informacin almacenada de la informacin que utiliza. El mRNA
es capaz de llegar al citoplasma y puede servir de plantilla para controlar la incorporacin de aminocidos en el
orden especifico codificado por la secuencia de nucletidos de DNA. El uso de mRNA tambin permite a la
clula incrementar de manera considerable su actividad ya que una molcula de DNA puede servir como
plantilla para la formacin de muchas molculas de mRNA.
Las protenas se sintetizan en el citoplasma mediante un proceso complejo conocido como traduccin, lo cual
requiere docenas de componentes diferentes, entre ellos los ribosomas. Los ribosomas contienen protena y
RNA. El RNA de un ribosoma se conoce como RNA ribosmico (rRNA). Estos rRNA en lugar de funcionar
como un portador de informacin, brinda soporte estructural y catalizan la reaccin qumica en la que los
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aminocidos se unen entre si. Los RNA de transferencia (tRNA) son necesarios para traducir la informacin
codificada en los nucletidos del mRNA. Los rRNA y los tRNA poseen complejas estructuras secundarias y
terciarias. Muchos RNA se pliegan para adoptar formas tridimensionales complejas, en consecuencia el RNA,
al igual que las protenas, puede llevar diversas funciones por que adoptan una gran variedad de formas. El
plegamiento del RNA ocurre gracias a la integracin de regiones que tienen pares de bases complementarios.
Las regiones donde se aparean las bases se denominan tallos, los cuales se conectan a asas monocatenarias. Los
RNA contienen a menudo pares de bases no comunes y bases nitrogenadas modificadas. Estas regiones sirven
como sitios de reconocimiento para protenas y otros RNA, promueven el plegamiento de la molcula y
estabilizan su estructura. Las clulas eucariotas contienen otros RNA con funciones vitales en el metabolismo.
Entre ellos estn los RNA nucleares pequeos (snRNA), RNA nucleolares pequeos (snoRNA), RNA
interferentes pequeos (siRNA), RNA asociados a piwi (piRNA), micro-RNA (miRNA) y otros RNA no
codificadores.
Transcripcin en clulas procariotas y eucariotas: Las enzimas encargadas de la transcripcin se denominan
RNA polimerasas dependientes de DNA o RNA polimerasas. Estas enzimas incorporan nucletidos en una
cadena de RNA cuya secuencia es complementaria a una de las cadenas de DNA que acta como molde. El
primer paso de la transcripcin es la vinculacin de la polimerasa con el DNA plantilla. El sitio de la molcula
de DNA donde se adhiere la RNA polimerasa se denomina promotor. Las RNA polimerasas no son capaces de
reconocer a los promotores por si mismas y requiere la ayuda de factores de transcripcin. El promotor
contienen la informacin que determina cual de las dos cadenas de DNA se transcribe y el sitio donde inicia la
transcripcin. La RNA polimerasa se mueve en la plantilla en direccin 35. Conforme la enzima avanza el
DNA se desenrolla y la enzima sintetiza RNA en direccin 53. La RNA polimerasa cataliza la siguiente
reaccin RNAn + NTP (trifosfato de ribonuclesido) RNAn+1 + PPi. Las reacciones que llevan la sntesis de
cidos nucleicos deben ocurrir en condiciones en las que la reaccin no sea reversible. Durante la transcripcin
se da a cabo la siguiente reaccin favorable PPi2Pi catalizada por la pirofosfatasa. La hidrlisis del pirofosfato
(PPi) se hidroliza a un fosfato inorgnico lo que genera energa libre y hace irreversible la reaccin. Un
nucletido solo se agrega a la cadena de RNA si es capaz de formar un para de bases apropiado con el nucletido
de la cadena de DNA que se transcribe. Una vez que la RNA polimerasa ha pasado por un segmento de DNA,
la doble hlice de DNA se vuelve a formar, en consecuencia la cadena de RNA no permanece vinculada como
un hbrido DNA-RNA a excepcin de unos nueve nucletidos localizados detrs del sitio de la polimerasa. Las
RNA polimerasas incorporan de 20 a 50 nucletidos por segundo y muchos genes son transcritos de forma
simultanea por 100 o mas polimerasas. La frecuencia con la que se transcribe un gen est regulada de manera
estricta y varia dependiendo del gen y de la situacin prevalente. Las RNA polimerasas son enzimas procesivas
y son capaces de formar cadenas de RNA muy largas. Aunque las polimerasas son motores relativamente
poderosos, no se encuentran en un estado de movimiento continuo, sino que pueden detenerse n ciertos puntos
a lo largo de la plantilla de DNA e incluso
retroceder antes de avanzar. Si ocurre la
insercin de un nucletido incorrecto, una
polimerasa debe retroceder, digerir el extremo
3 y regenerar la porcin faltante. A esta
capacidad se la conoce como edicin y esta
funcin la desempea el mismo sitio de la
enzima encargado de la incorporacin de
nucletidos.
Transcripcin en bacterias: Las bacterias contienen RNA polimerasa de un
solo tipo, compuesta por 5 subunidades en estrecha relacin para formar un
ncleo enzimtico. En condiciones in vitro, si se coloca la RNA polimerasa,
DNA plantilla y los trifosfatos de ribonuclesido, el ncleo de la enzima se
une de manera aleatoria al DNA. Si se agrega un factor sigma, la transcripcin
comienza en sitios especficos. La unin de dicho factor al ncleo de la enzima
incrementa la afinidad de esta para unirse a los promotores de DNA. La RNA
polimerasa bacteriana es una molcula con forma de tenazas de cangrejo con
un par de pinzas mviles que rodean un conducto interno con carga positiva.
Cuando el factor sigma interacta con el promotor, las pinzas de la enzima
fijan el dplex de DNA en direccin 3. La enzima separa las dos cadenas de
DNA en la regin que rodea al sitio de inicio. La separacin de las hebras
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torna a la plantilla accesible al sitio activo de la enzima. El inicio de la transcripcin es un proceso difcil de
activar, una vez que 10 nucletidos se han incorporado satisfactoriamente a un transcrito en crecimiento, la
enzima sufre un cambio conformacional y se transforma en un complejo transcripcional de elongacin y puede
moverse de modo procesivo. La formacin de este complejo es segudo por la liberacin del factor sigma. Los
promotores bacterianos se localizan en la regin de una cadena de DNA que precede a la al sitio de inicio de la
sntesis del RNA. El nucletido en el cual comienza la transcripcin se conoce como +1 y el nucletido anterior
a este como -1. Las porciones anteriores al sitio de iniciacin (hacia el 3 de la plantilla) se encuentran en
direccin 5 o corriente arriba del sitio de inicio. Las porciones despus del sitio de inicio (hacia el 5 de la
plantilla) se encuentran en direccin 3 o corriente abajo. En los genes bacterianos dos secuencias de DNA son
similares entre los diferentes genes, una de estas est en la posicin -35 y casi siempre presenta la secuencia
TTGACA. A esta secuencia se el denomina secuencia de consenso, lo que significa que esta secuencia puede
variar pero es la versin comn mas conservada. La segunda secuencia (TATAAT) se localiza en la posicin 10. sta secuencia se denomina la caja de
Pribnow y en este punto el promotor se
encarga de identificar el nucletido en el
cual inicia la transcripcin. Conforme el
factor sigma reconoce la caja de Prinbnow,
residuos de aminocidos dentro de la
protena interactan con cada uno de los seis
nucletidos de la secuencia TATAAT de la
cadena que no funciona como plantilla. Dos
de estos nucletidos se separan y son llevados al centro de la protena. Dicha funcin inicia la fusin DNApromotor y la formacin de la burbuja de transcripcin.
Las clulas bacterianas poseen diferentes factores sigma que reconocen diferentes versiones de la secuencia
promotora. La protena sigma 70 se conoce como factor sigma de mantenimiento por que inicia la transcripcin
de la mayor parte de los genes. Factores sigma alternativos comienzan la transcripcin de un pequeo de numero
de genes especficos que participan en una respuesta comn. La transcripcin termina cuando alcanza una
secuencia de nucletidos especfica. En la mitad de los casos se requiere una protena con forma de anillo
llamada rho, la cual separa el RNA transcrito del DNA. En otros casos la RNA polimerasa detiene la
transcripcin al alcanzar una de las secuencias de terminacin. Esta secuencias se pliegan en forma de horquilla,
lo que hace que la polimerasa libere la cadena de RNA sin ayuda.
Transcripcin y procesamiento del RNA en
eucariotas: Las clulas eucariotas tienen tres
enzimas (5 en plantas) de transcripcin
distintivas en sus ncleos. Cada una de ellas
sintetiza un grupo diferente de molculas de
RNA. Las enzimas entre arquea y eucariotas
son ms similares que las de bacteria y
arquea. Las subunidades de las RNA
polimerasas son homlogas comparadas con
las respectivas polimerasas de arquea,
bacteria y eucaria. A diferencia de las procariotas, las eucariotas necesitan una gran variedad de factores de
transcripcin para producir el RNA. Estas protenas actan en cada proceso de la transcripcin. La sntesis del
mRNA se lleva a cabo por la RNA polimerasa II. Los mRNA, rRNA y tRNA se derivan de molculas
precursoras de RNA mucho mas grandes que el producto final. Este precursor es de igual longitud de su cadena
complementaria de DNA y se denomina transcrito primario o pre-RNA. El segmento de DNA molde de un
transcrito primario se conoce como unidad de transcripcin. Los transcritos primarios se vinculan con protenas
incluso al sintetizarte. Los pre-RNA tienen una vida corta y se procesan en RNA pequeos por medio de
reacciones de corte y empalme.
Sntesis y procesamiento del rRNA y tRNA: Una clula eucariota puede contener millones de ribosomas, por
ende el 80% del RNA en la mayora de las clulas es rRNA. Por lo tanto las secuencias de DNA que codifican
rRNA se repiten cientos de veces. Estas secuencias se conocen como rDNA y se localizan agrupados en una o
varias regiones del genoma. En una clula en interfase, los grupos de rDNA estn unidos y forman una o ms
estructuras nucleares conocidas como nuclolos, los cuales participan en la generacin de ribosomas. La mayor
parte de un nuclolo se compone de subunidades ribosmicas nacientes que le confieren una apariencia granular.
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Sntesis de los precursores de rRNA: Los oocitos son modelos ideales para el estudio de la sntesis de rRNA y
su procesamiento. Oscar Miller desarroll tcnicas para visualizar genes activos por medio de microscopa
electrnica. Las micrografas electrnicas y los dibujos interpretativos revelan diferentes aspectos de la
actividad nucleolar. 1.- Los genes de rRNA se localizan en tndem. 2.- El segmento de DNA rodeado de fibrillas
de RNA corresponde a una sola unidad de transcripcin. El promotor se encuentra en la direccin 5 del sitio
de inicio de la transcripcin. 3.- Los transcritos nacientes contienen partculas asociadas que consisten en RNA
y protenas, las cuales trabajan en conjunto para convertir los precursores en sus productos finales. 4.- Las
regiones de DNA localizadas entre unidades de transcripcin no se transcriben, estas regiones se conocen como
espaciadores no transcritos y estn presentes entre varios tipos de genes repetidos en tndem como los que
codifican el tRNA y las histonas.
Procesamiento del rRNA precursor: Los ribosomas eucariotas poseen cuatro rRNA diferentes, tres en la unidad
grande y uno en la pequea. La subunidad grande consta de los rRNA 28S, 18S y 5.8S y la pequea de 18S.
Los rRNA 28s, 18s y 5.8s se sintetizan en un solo transcrito primario o pre-rRNA. La subunidad 5s se sintetiza
a partir de un RNA precursor fuera del nuclolo. El pre-rRNA contiene un gran nmero de nucletidos metilados
y de residuos de sudouridina. Estas modificaciones ocurren despus de que los nucletidos se incorporen al
RNA naciente de manera post-trasncripcional. Los nucletidos modificados se localizan en posiciones
especficas, se agrupan en porciones definidas de la molcula y se conservan en todos los organismos. Los
nucletidos modificados en el pre-rRNA se conservan en los productos finales. Estos nucletidos modificados
pueden proteger partes del pre-rRNA de un corte enzimtico, promover el plegamiento del rRNA y promover
interacciones del rRNA con otras molculas. El transcrito primario de rRNA (45s) posee unos 13000
nucletidos, este se corta y se convierte las molculas de rRNA 28s, 18s y 5.8s cuya longitud combinada es de
7000 nucletidos.
Funcin de los snoRNA: El procesamiento de los prerRNA se completa con la ayuda de un gran nmero de
RNA nucleolares pequeos (snoRNA), los cuales se
adhieren a molculas protenicas particulares para
formar partculas llamadas ribonucleoprotenas
nucleolares pequeas (snoRNP). Los snoRNP se
relacionan con los pre-rRNA antes de que estos se
transcriban por completo. Algunos de los cortes
enzimticos los cataliza un exosoma, el cual es una
mquina que degrada RNA y que posee alrededor de
una docena de exonucleasas diferentes. Los miembros
de un grupo (snoRNA de caja C/D) determinan que
nucletidos en el pre-rRNA metilan sus residuos de
ribosa y los miembros de otro grupo (snoRNA de caja
H/ACA) determinan que uridinas se convierten en
pseudouridinas. Los grupos de snoRNA contienen
segmentos que son complementarios a las secciones de
transcrito de rRNA. Cada snoRNA se une a una porcin
especfica del pre-rRNA para formar un dplex de RNA. El snoRNA gua a una enzima dentro del snoRNP
para modificar un nucletido en particular en el pre-rRNA. Mas de 200 protenas distinas se relacionan con el
rRNA en su fase de ensamblaje y se dividen en 2 grupos. Protenas ribosmicas que permanecen en las
subunidades y protenas accesorias que interaccionan con los intermediarios y se requieren para el
procesamiento. En este ultimo grupo se encuentran helicasas del RNA que separan al snoRNA de el pre-rRNA.
Sntesis y procesamiento del rRNA 5s: Un rRNA 5s de 120 nucletidos de largo es parte de la subunidad
ribosmica grande en procariotas y eucariotas. Esta subunidad se transporta al nuclolo para unirse con los
dems componentes que participan en el ensamblado de los ribosomas. Los genes del 5S son transcritos por la
RNA polimerasa III. Esta polimerasa tiene la capacidad de unirse a un sitio promotor situado dentro de la
porcin transcrita del gen.
RNA de transferencia: Las clulas de plantas y animales poseen 50 especies de RNA de transferencia, y cada
uno de estos se codifica por una secuencia repetida. El grado de duplicacin de estas secuencias vara en
diferentes organismos. Los genes del tRNA se encuentran en pequeos agrupamientos diseminados en el
genoma. Un solo agrupamiento contiene mltiples copias de diferentes genes de tRNA. Una secuencia que
codifica tRNA especfico por lo general se halla en ms de un agrupamiento. Las secuencias codificantes para
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tRNA se encuentran ordenadas en tndem y poseen secuencias espaciadoras no transcritas. Los tRNA se
transcriben por medio de la polimerasa III y la secuencia promotora se localiza dentro de la regin codificante
del gen. Al igual que en el rRNA, el pre-tRNA es una molcula mas grande que el transcrito final. Una de las
bases que interviene en el procesamiento del pre-tRNA es una endonucleasa llamada ribonucleasa P, la cual se
forma por RNA y subunidades proteicas.
Sntesis y procesamiento de mRNA en eucariotas: Los RNA poseen las siguientes propiedades: 1.- muestran
pesos moleculares altos, 2.- se representan como grupo por RNA diversos (heterogneos) con distintas
secuencias de nucletidos y 3.- se encuentran en el ncleo. Por estas razones dichos nucletidos se conocen
como RNA nucleares heterogneos (hnRNA). Estos hnRNA son los precursores de los mRNA citoplasmticos
ms pequeos. Los hnRNA y los mRNA son solo una pequea fraccin de RNA total en las clulas eucariotas
y se degradan en lapsos relativamente leves.
Maquinaria para la transcripcin del mRNA: Todos los precursores de mRNA eucariotas lo sintetiza la RNA
polimerasa II. Dicha polimerasa requiere varios factores generales de transcripcin (GTF) para formar un
complejo de preiniciacin (PIC). Las protenas GTF son necesarias para la iniciacin precisa de la transcripcin
de un conjunto diverso de genes en una gran variedad de
organismos. Los promotores que fomentan la nucleacin del
ensamble de PIC se encuentran en el lado 5 de cada unidad de
transcripcin. Una parte importante de la regin promotora se
encuentra entre el -24 y el -32 del inicio del sitio en el que se inicia
la transcripcin. Esta regin posee una secuencia consenso 5TATAAA-3 y se conoce como caja TATA. La mayora de los
promotores eucariotas carecen de una caja TATA reconocible y se
han identificado muchos otros elementos promotores.
El primer paso en el ensamblaje del complejo de preiniciacin es
la unin de la protena de unin a la secuencia TATA (TBP,
TATA-binding protein), que reconoce la caja TATA de los
promotores eucariotas. La TBP es una subunidad de un complejo
protenico mucho mas grande llamado factor de transcripcin para
la polimerasa II, fraccin D (TFIID). La unin de la TBP al
promotor de la polimerasa II causa una distorsin en la
conformacin del DNA. La TBP se inserta en el surco menor y
pliega la molcula mas de 80. Otras subunidades de TFIID se unen
a regiones del DNA distintas. La unin del TFIID permite el
ensamblaje del complejo de preinicio completo. La interaccin de
los tres GTF (TBP de TFIID, TFIIA y TFIIB) con el DNA
promueve una plataforma para la unin posterior de la enorme
multisubunidad de RNA polimerasa con su TFIIF adherido. Una
vez que el complejo RNA polimerasa-TFIIF se encuentra en
posicin, TFIIE y TFIIH se unen al complejo y convierten a la
polimerasa en una mquina de transcripcin. El TFIIH es el nico
que posee actividad enzimtica. Una subinidad de esta acta de
cinasa para fosforilar a la RNA polimerasa mientras que otras 2
actan de helicasa para separar las cadenas de DNA. Una vez que
inicia la transcripcin, algunos de los GTF (entre ellos TFIID)
permanecen en el promotor, mientras que otros se liberan del
complejo. La permanencia de TFIID en el promotor facilita que
ms molculas de RNA polimerasa se unan y realicen nuevos
procesos de transcripcin.
El dominio carboxilo terminal (CDT) de la subunidad grande de la
RNA polimerasa II posee una secuencia de siete aminocidos que
se repite en mltiples ocasiones. Estos aminocidos pueden
modificarse por medios enzimticos. La RNA polimerasa que se
ensambla en el complejo de preiniciacin no est fosforilada. La
fosforilacin del CDT se puede catalizar con 4 cinasas de protenas
diferentes, entre ellas el TFHII, el cual fosforila los residuos de
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Serina en la posicin 5. Esta fosforilacin desencadena el desacoplamiento de la polimerasa de los GTF, del
promotor de DNA o de ambos, lo que permite que la enzima escape del complejo preiniciacin y se desplace
por la plantilla de DNA. En las primeras fases de la transcripcin el CTD es fosforilado en la Serina 5, con lo
cual se dispone de los sitios de unin para protenas que intervienen en las fases tempranas del procesamiento
del mRNA. Conforme la RNA polimerasa se desplaza por el gen que se transcribe, otra cinasa (P-TEFb)
fosforila el CTD en la Serina 2. Este cambio en el patrn de fosforilacin facilita el reclutamiento de factores
protenicos adicionales implicados en el corte y empalme de RNA y la adicin de la cola poliA. De esta forma
el CTD acta como plataforma para la ganancia y prdida dinmica de los factores necesarios para la formacin
de un mRNA maduros.
En eucariotas no hay una secuencia de terminacin de la transcripcin definida, y la RNA polimerasa II puede
viajar mas all despus del punto que genera el extremo 3 en el mRNA procesado. A diferencia de las
procariotas, en las eucariotas el extremo 3 se forma por procesamiento. Factores de transcripcin especficos
son capaces de unirse a numerosos sitios en las regiones reguladoras de DNA y determinan si un complejo de
preiniciacin se ensambla y la velocidad en la que la polimerasa inicia nuevos ciclos de transcripcin desde
dicho promotor.
Estructura de los mRNA: Los mRNA contienen secuencias de nucletidos que codifican un polipptido
especfico, se encuentran en el citoplasma, se unen a los ribosomas cuando se traducen y poseen regiones no
codificantes. Dichas regiones tienen funciones
reguladoras de importancia. Los mRNA eucariotas
poseen modificaciones en los extremos 3 y 5. El
extremo 3 posee una cola poliA y el extremo 5 posee
un casquete de guanosina metilado.
Genes interrumpidos: Los hnRNA son varias veces mas
grandes que los mRNA finales. Los mRNA se
transcriben a partir de segmentos de DNA separados
unos de otros a lo largo de la plantilla. Estudios en el adenovirus encontraron que la secuencia lder 5 no es
complementaria de una secuencia repetida ni de un tramo continuo de nucletidos en la plantilla de DNA, sino
que se transcribe a partir de 3 segmentos de DNA distintos y separados. A las secuencias ubicadas entre estos
segmentos se las conoce como secuencias interpuestas. Alec Jeffrys y Richad Flavell descubrieron una
secuencia interpuesta de unas 600 bases situadas dentro de una parte del gen de la globina. Pronto se supo que
las secuencias interpuestas estn presentas en los genes, y que los genes interrumpidos es la regla y no la
excepcin. Las partes de un gen que contribuyen a la formacin de un mRNA maduro se llaman exones, y las
secuencias interpuestas intrones. Los intrones estn en todos los genes, incluidos los que codifican tRNA, rRNA
y mRNA. Estudios han demostrado que los exones individuales tienen un tamao promedio de 165 nucletidos
y los intrones cerca de los 3500 nucletidos. La formacin del mRNA en clulas eucariotas sucede por la
eliminacin de secuencias internas de ribonucletidos de un pre-mRNA mucho mas largo.
Procesamiento de los mRNA eucariotas: La polimerasa II genera un transcrito primario complementario al
DNA de toda la unidad de transcripcin. Estos transcritos se vinculan con protenas y partculas mas grandes
incluso mientras se sintetizan. Estos son agentes encargados de convertir al transcrito primario en un mRNA
maduro. Este proceso requiere la adicin de un casquete 5, una cola poliA al 3 y la eliminacin de las
secuencias intrnicas.
Casquetes 5 y colas poliA 3: Todos los RNA en el segmento 5 poseen un trifosfato derivado del primer
nuclesido trifosfatado que se incorpor en el sitio de
iniciacin de la sntesis de RNA. Diferentes actividades
enzimticas actan en esta regin de la molcula. En el primer
paso uno de los tres fosfatos se elimina convirtiendo al 5 en
un difosfato. Despus se agrega una guanosina mono fosfato
en orientacin invertida, de tal modo que el extremo 5 de la
guanosina apunte hacia el 5 de la cadena de RNA. Como
resultado los dos primeros nucletidos quedan unidos por un
puente inusual 5-5. Finalmente la guanosina insertada se
metila en la posicin 7 de su base guanina mientras que el
nucletido del lado interno lo hace en el 2 de la ribosa. Este
casquete se forma durante las primeras fases de la
transcripcin y se le denomina casquete de metil guanosina,
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el cual impide que las exonucleasas digieran el extremo 5 del mRNA, favorece el transporte de ste hacia fuera
del ncleo y tienen una participacin importante en el inicio de la traduccin. El extremo 3 de un mRNA
contiene una cadena de residuos de adenosina que forma una cola poliA. El ensamblado de la cola poliA se
relaciona de manera fsica con la polimerasa II cuando esta sintetiza al transcrito primario. El procesamiento
de la cola poliA requiere varios procesos. Una endonucleasa corta la molcula de pre-mRNA en direccin 3 en
un sitio de reconocimiento (AAUAAA). Luego la polimerasa depoli(A) agrega 250 o ms adenosinas sin la
necesidad de una plantilla. La cola poliA y una protena adjunta protegen al mRNA de la degradacin prematura
por exonucleasas.
Corte y empalme del RNA: Los
intrones deben eliminarse del
transcrito primario por un proceso
denominado corte y empalme del
RNA o splicing. Para procesar un
RNA deben efectuarse cortes en los
extremos 5 y 3 de la cadena de cada
intrn, y los exones deben ligarse de manera covalente. Existen sitios de corte y empalme de una secuencia
nucletida conservada y originada en la evolucin ancestral. Estos son el componente G/GU en el extremo 5
del intrn, el elemento AG/G en el extremo 3 del intrn y la secuencia de pirimidinas cercanas al sitio de corte
y empalme 3. Regiones adyacentes al intrn poseen nucletidos preferidos, los cuales ayudan al
reconocimiento del sitio de corte y empalme. La adicin de
seales que le permiten a la maquinaria distinguir entre exones
e intrones se debe a secuencias especficas de los potenciadores
de corte y empalme exnico (ESE) situadas dentro de los
exones. Los ESE sirven como sitios de adhesin para una
familia de pptidos que se unen al RNA conocidas como
protenas SR. Estas protenas ayudan a reclutar snRNP a los
sitios de splicing. Thomas Cech se dio cuenta de que el RNA
es capaz de catalizar reacciones qumicas. El ciliado
Tetrahymena es capaz de sintetizar un pre-rRNA capaz de
eliminar sus propios intrones. Los intrones tipo II se encuentra
en mitocondrias de hongos, cloroplastos, bacterias y arqueas.
Estos intrones se pliegan y se eliminan por si mismas al pasar
por un estado intermedio conocido como lazo. El primer paso
es la divisin del sitio de corte en el extremo 5. Luego se forma
un lazo a travs de un enlace covalente entre el extremo 5 y un
residuo de adenosina cerca al 3. Luego un corte en el 3 libera
el lazo y los exones se ligan de modo covalente.
Los pre-mRNA no son capaz de sufrir splicing por si solos y
requieren un grupo de RNA nucleares pequeos (snRNA) y
protenas accesorias. Conforme cada molcula larga de hnRNA se transcribe, sta se relaciona con protenas
para formar una ribonucleoprotena nuclear heterognea (hnRNP) la cual es el sustrato de las siguientes
reacciones. El procesamiento en cada intrn del pre-mRNA se vincula con una dinmica maquina
macromolecular llamada empalmosoma. Cada empalmosoma posee diferentes protenas y un nmero de
distintas partculas ribonucleoprotenicas conocidas como ribonucleoprotenas nucleares pequeas (snRNP).
Estas se componen de snRNA unidos a protenas especficas. Una vez que el empalmosoma se ensambla, las
snRPN cortan los intrones del transcrito y unen los extremos de los exones. Los intrones, que constituyen el
95% del pre-mRNA, se degradan en el ncleo. La exclusin de un intrn requiere de varias partculas de snRNP:
las U1, U2, U5, y U4/U6. Las protenas Sm estn presentes en todos los snRNP. Las protenas Sm se unen entre
s y a cada snRNP (menos en el U6) para formar el nucleo de la snRNP.
El ensamblaje de la maquinaria de splicing en un intrn ocurre junto con la sntesis del CDT por parte de la
polimerasa. El CDT recluta varios factores de procesamiento. La mayor parte de la maquinaria que se requiere
para el procesamiento del mRNA viaja con la polimerasa como una gran fbrica de mRNA.
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RNA reguladores pequeos y vas de desactivacin del RNA: Gracias a experimentos con las petunias y la
insercin de un transgen para intensificar su color, se
descubri que los mRNA resultantes estaban degradados.
Este fenmeno se conoce como desactivacin gnica
postranscripcional (PTGS). Experimentos posteriores con
el nematodo C. elegans ayudaron a descubrir la
interferencia del RNA. Al nematodo le inyectaron RNA
codificante con la protena de inters, RNA no codificante
complementaria a la secuencia codificante y un RNA
bicatenario que contena ambas secuencias unidas entre si.
Los RNA bicatenarios inducan una respuesta que llevaba a
destruccin selectiva de los mRNA con la misma secuencia
que los dsRNA agregados. A este fenmeno se le denomin
como interferencia del RNA (RNAi). La interferencia del
RNA mediada por el dsRNA es un ejemplo de desactivacin
del RNA, un fenmeno en el que RNA pequeos inhiben la
expresin gnica. El RNAi evolucion como un tipo de
sistema inmunitario gentico para proteger a los organismos
de la presencia de material gentico extrao como el de los
virus o para suprimir el movimiento de transposones en el
genoma. El RNA bicatenario que inicia la respuesta primero
se divide en fragmentos (de 21 a 23 nucletidos)
denominados RNA interferentes pequeos (siRNA) por la
accin de una ribonucleasa llamada Dicer. Las enzimas
como Dicer actan de manera especfica en sustratos de
dsRNA y generan pequeos segmentos con fragmentos
sobresalientes 3. Estos dsRNA se incorporan a un complejo
denominado pre-RISC el cual contienen un miembro de la familia Argonauta de protenas. Argonauta tiene una
funcin clave en todas las vas de desactivacin del RNA. En la va del RNA de interferencia, una de las hebras
del dplex de RNA se divide en dos y se disocia del pre-RISC. La otra hebra (cadena gua) se incorpora, junto
con su pareja Argonauta, en un complejo llamado RISC. Los RISC que contienen siRNA poseen la protena
Argonauta Ago2. El RISC aporta la maquinaria para que el siRNA de cadena simple se adhiera a un RNA que
posea una cadena complementaria. Una vez se completa esta unin, el RNA dplex se corta en un sitio
especfico por accin ribonucleasa de la protena Ago2. Por lo tanto el siRNA acta como una gua para dirigir
el complejo hacia el RNA complementario, mismo que posteriormente ser destruido por una protena adjunta.
El siRNA puede dirigir la destruccin de RNA transcrito vrico, de un transposn o de un mRNA. Los
vertebrados no utilizan sistema de RNA de interferencia como mecanismo de defensa, sino que usan un sistema
inmunitario. Cuando se agrega dsRNA a un mamfero, se inicia una respuesta global que inhibe la sntesis de
protenas en general. Sin embargo la introduccin de dsRNA de igual tamao que un siRNA, no induce una
respuesta global, pero produce interferencia a la protena especfica codificada por un RNA.
Micro RNA: Pequeos genes que regulan la expresin gnica: En el nematodo C. elegans, el gen lin-4 codifica
un RNA pequeo complementario de algunos segmentos en la regin 3 no traducida de un mRNA que codifica
la protena LIN-14. Lin-4 se une durante el desarrollo larvario al mRNA complementario de LIN-14 y bloquea
la traduccin del mensaje. Los mutantes con carencia de lin-4 poseen una concentracin excesiva de la protena
LIN-14 y no pueden experimentar de manera normal la transicin a etapas larvarias posteriores. Tanto plantas
como animales producen cientos de pequeos RNA denominados microRNA (miRNA) los cuales poseen una
funcin reguladora. Los miRNA poseen 21-24 nucletidos de longitud (aproximadamente el mismo que los
siRNA). Los miRNA se producen por una maquinaria de procesamiento similar a la encargada de formar los
siRNA, y ambos actan en vas de desactivacin del RNA post-transcripcin. Sin embargo un siRNA proviene
del producto bicatenario de un virus, de un elemento transponible o de un dsRNA aportado por un investigador,
y se dirige a los mismos transcritos que lo originaron. El siRNA sirve para mantener la integridad del genoma.
Por otro lado, un miRNA es codificado por un segmento del genoma y se dirige a un mRNA especfico para
regular la expresin gnica. Un miRNA es sintetizado por la RNA polimerasa II como un transcrito primario
con un casquete 5 y una cola poli A. El transcrito primario se pliega sobre si mismo para formar un RNA
bicatenario con forma de horquilla llamado pri-miRNA. ste se corta dentro del ncleo por una enzima llamada
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Drosha, y forma un precursor mas corto en forma de horquilla. Este pre-miRNA se exporta al citoplasma donde
Dicer lo corta y da origen a un pequeo miRNA bicatenario. Luego el miRNA bicatenario se relaciona con
Argonauta, se desensambla el dplex de DNA y una de las cadenas se incorpora al RISC. Un miRNA es
parcialmente complementario a una regin no traducida de su mRNA diana. El miRNA del RISC gua a la
protena Argonaulta a un sitio cercano al mRNA unido, lo que genera la degradacin del mRNA o se reprime
su traduccin. Los seres humanos podran codificar ms de 1000 miRNA diferentes. Un solo miRNA puede
unirse a varios mRNA distintos. Muchos mRNA contienen secuencias complementarias para varios miRNA
diferentes, stos actan combinadamente para ajustar la precisin de la regulacin gnica. Los microRNA se
han implicado en muchos procesos, como la regulacin para el SNcentral, el control de la proliferacin, muertes
celulares etc.
piRNA: Existen mecanismos especializados para suprimir el movimiento de elementos transponibles en las
clulas germinales. Las clulas germinales expresan una clase distinta de RNA llamados RNA asociados a piwi
(piRNA), los cuales suprimen el movimiento de los elementos transponibles en la lnea germinal. Las protenas
PIWI son una subclase de la familia Argonauta de protenas. Los piRNA junto con PIWI son necesarios para la
formacin exitosa de gametos en Drosophila y ratones machos. En comparacin con los si/miRNA, los piRNA
son mas largos (24-32 nucletidos vs 21-24), los piRNA de los mamferos pueden rastrearse hasta un pequeo
nmero de loci genmicos enormes, los cuales codifican miles de piRNA diferentes, los piRNA pueden sufrir
un proceso de amplificacin lo cual genera copias adicionales, y la formacin de piRNA no involucra la
formacin de precursores de dsRNA ni la divisin por Dicer. El origen de piRNA depende de la actividad
endonucleasa de la protena PIWI.
Otros RNA no codificantes: En condiciones normales, se transcriben al menos dos tercios del genoma de un
raton o humano. La mayora de las secuencias incluidas en este DNA transcrito se consideran basura, incluidos
los elementos transponibles. Estudios indican que la transcripcin puede comenzar en sitios inesperados de
todos los tipos de genoma. Las clulas tambin a menudo transcriben ambas cadenas de DNA, generando as
RNA codificante y no codificante. Las polimerasas tambin pueden transcribir en la direccin opuesta al gen.
El DNA de una clula de un organismo constituye su genoma. Las protenas que este sintetiza su proteoma y
los RNA su transcriptoma. Gran parte del RNA no codificador que se produce participa en actividades
reguladoras. No todos los transcritos no codificantes son pequeos. Secuencias como XIXT, HOTAIR y AIRE
actan como reguladores de la estructura de la cromatina o de la transcripcin.
TRADUCCIN Fala hacer el resumen L
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La forma de doble hebra del ADN estabiliza a la molcula y evita que estos
tautomerismos pasen con mucha frecuencia.
o Entonces cuando polimerasa ve estos tautmeros llega y pone la base equivocada.
Y no hay forma de saber que est mal.
2. Deaminaciones: ocurren con cierta frecuencia 100 bases por clula al da en el humano, y
DNA pierde grupo amino.
o Prdida de amino en C se convierte en U y este se aparea con A.
o Prdida de amino en A hipoxantina y se aparea con C.
o La metil citosina se transforma en T
3. Depurinacin: frecuencia de 5000 bases por clula por da purinas pierden sus bases
nitrogenadas, tambin se incrementa con Temperatura. Se tiene que
o Para estudios en dientes de ancestros, tienen que repurinar el DNA
4. Radiacin electromagntica: daa el DNA a una mayor frecuencia de onda o a una corta
longitud de onda. Entre mas pequea es la longitud de onda es ms penetrante y peligrosa.
o Dada por ondas de radio (10 a la 3m a 10 a la 9nm)
o Microondas (10 a la 9nm 10 a la 6nm)
o Luz infrarroja: no visibles a ojo humano, pero si algunos animales como las serpientes
(10 a la 6 nm 10 a la 3nm).
o Luz visible 750nm-380nm
o Luz ultravioleta: (380nm 250nm) bronceado y sol* (desde aqu daa DNA). Cuando
uno se somete a sol se forman ampollas, esas ampollas son clulas que han muerto,
pero de lo que hay preocuparse son de las clulas que han quedado y que la clula
tienen que reparar. El problema es que no siempre le va bien a la maquinaria de
reparacin.
Es muy comn y produce reorganizacin de los electrones en las pirimidinas (T>C)
dmeros de timina (Se solucionan con el mismatch repair).
- Benzopireno presente en el tabaco, es hidrofbico, se inserta en la parte
hidrofbica el DNA causando modificaciones en su estructura.
- Benzopireno (tabaco y carnes ahumadas) + dmeros de timina tasas de
mutacin ms alta en todos los rganos cncer.
o Rayos X: no atraviesan huesos, pero si todos tejidos** Rompe el DNA (1nm a 103nm).
o Rayos Gama (en plantas nucleares)*** (10-3nm a 10-5nm)
o Rayos csmicos**** (10-5nm.)
*A medida que aumenta energa, disminuye longitud de onda. Cuando disminuye
longitud se hacen ms penetrantes.
Mecanismos de reparacin del DNA
Ninguna reparacin garantiza que el DNA va a volver a ser como antes. Por lo general hay una
pequea modificacin.
1. (mismatch repair) Mecanismo de reparacin dirigido a una misma hebra: se discrimina entre
la hebra vieja y nueva.
o Por lo general, se duda de la fidelidad de la hebra nueva.
o Ms comn en bacterias, porque hebra vieja siempre
es metilada. Entonces se saca base de hebra nueva.
- Se recluta 3 protenas, MutS reconoce la alteracin
del DNA, y MutS le reculta al MutL, y luego estas a
Mut H, la cual produce 1 corte en la hebra no
metilada, no necesariamente donde es la
mutacin sino a cierta distancia.
- Se reculta exonucleasa que saca la mutacin
desde la base metilada hasta el sitio del error.
- Polimerasa y ligasa
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Algunos tipos de cncer como el cancer no poliposo hereditario (de colon) se generan
debido a problemas con los genes de MutS y MutL en eucariotas. Si los mecanismos de
reparacion de DNA estan daados la probabilidad de tener cancer es menor.
2. Reparacin de mutaciones por escisin de bases (para aminaciones y depurinaciones)
o No discrimina entre 2 hebras.
o Por ejemplo si se deamina C se produce un U, se da deformacin del DNA porque
no hay apareamiento de bases. Entonces hay que sacar el uracilo mediante Uracilo
glocosilasa (entra en el surco mayor), saca la base y deja el azucar y el fosfato, luego
vienen AP exonucleasa y saca al azcar dejando hueco, viene polimerasa y ligasa.
o Si es para reparar depurinacin, como la base est ausente, slo viene la
exonucleasa y corta, polimerasa y ligasa.
3. Reparacin por escisin de nucletidos (dmeros de timina y benzopirenos u otros
compuestos que daan el ADN):
o En lugar de sacar una sola base, se saca varios nucletidos (12).
o TTO de cncer es un mutgeno. Hacen que clulas cancergenas muten ms rpido
y mueran
o En bacterias:
Sistema SOS Se prende cuando existe DNA de una sola hebra. Inmunidad
de bacterias ante antibiticos.
- Produce cambios en clulas para que sobrevivan a lo que venga.
- Lo primero que pasa para que se active sistema SOS es que se detecta el DNA de
una sola hebra Este DNA de una sola hebra recluta a protena RecA. Esta tiene
mltiples acciones: con su funcin proteasa ataca a represor LexA (mlecula que
une a promotor y lo inhibe), y se activan los genes: entre otros, uvrA, uvrB y uvrC; y
tambin la RecA promueve recombinacin del DNA.
- Molcula uvrA (reconoce dao durante la transcripcin) y recluta a uvrB, y este
complejo recluta uvrC (que es una endonucleasa) rompe el DNA cercano a la
mutacin (pedazos de 10-12 nucletidos).
- Polimerasa I y ligasa.
o En eucariotas:
- Existe la intervencin de una RNA polimerasa. La cual detecta el dao y recluta
algunas protenas (XP Xeroderma pigmentoso y CS cocaine syndrome):
- Se reconoce el dao gracias XPE, y XPC. Luego se recluta a proteinas que son
factores de transcripcin.
- Entra XPB y XPD (Helicasas).
- Luego se produce el corte del DNA a los dos extremos por 2 protenas: XPF y XPG
son las que cortan el ADN (Endonucleasas).
- Polimerasa y ligasa
*Protena CS: parte del complejo que ayuda reclutar protenas.
En Xeroderma pigementosa, protenas XP estn daadas y no pueden reparar daos del
DNA, por eso son sensibles a la luz y presencia del cncer aumenta. Intolerancia a la luz
ultravioleta. Exeso de pecas.
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CLASE 2: RECOMBINACIN.
La recombinacin es muy importante por dos razones:
La replicacin del DNA
Reparacin del DNA
Nadie sabe donde para, el proceso de recombinacin y se forma el quiasma de recombinacin.
Nadie sabe donde se va a realizar el corte, existen dos opciones. En la recombinacin en eucariotes
intervienen protenas RAD50 y RAD51 (esta 51 es similar a RecA) funcionan junto a protenas BRCA1
Y BRCA2. Se necesitan de ambas para que se de la recombinacin, por lo tanto actan en
conjunto. Para que se d la recombinacin es necesario que el 80% de las secuencias sean
idnticas, sino no se da.
Cuando estn daados los genes de BRCA1 y BRCA2, se presenta una predisposicin por
el cncer de seno. Lo mismo sucede con RAD51 (como es similar a RecA, interviene en
procesos de reparacin, recombinacin de DNA y por ende de cncer).
Para que se d el proceso:
o Protenas ATM (reconoce el DNA de una sola hebra daado) de Ataxia telangientasa.
o ATM recluta al complejo de reparacin.
Recombinaciones de sitio
Son recombinaciones en sitios especficos del DNA. Se usa una enzima llamada integrasa.
Por ejemplo: virus, reconoce secuencia en el cromosoma de husped y se recombina; de
tal manera que el virus se pega el genoma o se sale (de bacteria a otra). Cuando se sale,
se pasan entre bacterias y lisan a las clulas.
o Estn involucradas en algunas cosas: delecciones.
- Repeticiones dirigidas: 2 secuencias homlogos en una hebra de DNA. pueden
recombinarse. Se encuentran genes homolgos que se recombinan y se puede
perder DNA.
- Secuencias invertidas: 2 secuencias homlogas que se organizan en la direccin
opuesta. Tambin se recombinan. Como resultado el DNA se produce inversiones.
- Como un resutado de la recombinacion se pueden producir deleciones o
inversiones.
o As se trasmite la vilrulencia de virus
o Se utiliza para terapia gnica para insertar un gen de inters (gen teraputico).
Integrones
Las bacterias tienen sistemas en el cual un pedazo de ADN atrapa cassetes, y estos suelen tener
resistencia a antibioticos. Son mquinas que utilizan recombinacin para atrapar genes.
(El gen de la integrasa) y tienen un sitio de unin (attI) en el cual se integran los casetts por
recombinacin.
Las bacterias cambian cassets (attC) con genes circulares de resistencia a antibiticos. Las
bacterias pueden tener 25 cassettes.
Inversiones
Genes que codifican flagelos (Salmonella)
Existen secuencias invertidas a ambos lados del promotor hin del flagelo de Salmonella.
o H2 gen de flagelo - rh1gen represor de flagelo H1.
o En esta conformacin, no se expresa el gen H1.
o Cuando la persona se infecta, hace anticuerpos en una semana contra H2.
o Cuando se produce una inversin, estos dos genes (H2 y rh1) se quedan sin
promotor y se apagan.
o Luego, se activa H1 que es un gen para otro tipo de flagelo. Una semana ms de
vida para transmitirse.
En ingeniera gentica:
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Duplicacin de genes:
Se genera duplicacion debido a entrecruzamiento igual del ADN. Cuando hay secuencias
muy repetidas son muy inestables.
La recompinacion puede estar relacionada en delecion, inversion y duplicacion de genes.
TRASPOSICIN
Fenmeno en el cual existe un trasposn, que tiene secuencias invertidas y en el medio hay
gen que codifica para una enzima llamada trasposa.
Los transposones poseen sitios especficos de insersion. La transposasa corta el DNA
donde se va insertar (de manera escalonada). Y huecos que quedan son rellenados por las
polimerasas.
La trasposicin NO necesita secuencias homlogas para recombinarse, la recombinacin
SI necesita secuencias idnticas para recombinarse. Como producto, si un transposn se
inserta en medio de un gen, lo apaga.
Se los conoce como genes saltarines.
o Cuando varios Trasposones simples saltan y se ubican a ambos lados de un gen
forman un trasposn complejo. Muchos de ellos tienen genes de resistencia a
antibiticos. Y pueden movilizarse a otros lugares.
o El maz no tiene que ver con leyes de Mendel. Barbara McClintock, maices de
diferentes color son generados por el salto de un transposn.
Ella propuso los genes saltarines.
o Hay gen W que codifica para pigmento de color, 2 trasposones, Ac Y Ds (Idnticos
con mutaciones) el Ac no se mueve pero produce trasposasa y Ds no produce
trasposasa pero puede:
saltar porque Ac le da su trasposasa.
- Ds se puede mover afuera o adentro del gen W, esto ltimo ocasionara una mutacin
y el gen de la antocianina (morado) no se expresara y produce color amarillo.
En eucariotes hay retrotrasposones, los cuales provienen de retrovirus que han perdido
vialidad.
o Los retrovirus estan envueltos en una membrana y fusiona su membrana con la de la
clula y libera su genoma de ARN y una enzima retrotranscriptasa, la cual copia el
ARN y sintetiza ADN. Este ADN se inserta en el genoma de la clula. Estos
retrotransposones usan la maquinaria de transcripcin de la clula, se hace ARN y
la retrotranscriptasa vuelve a sintetizar el DNA del virus. Lo interesante es que se
REPRODUCEN.
o La cola poliadenilada del retrotransposn reconce la secuencia de insercin al
genoma eucariota. Este proceso es al azar.
o Otro ejemplo: un retrotrasposn L1.
o Un retrovirus posee capacidad infectiva a otras clulas, mientras que los
retrotransposones no se pueden pasar.
o Por qu se dice que son retrovirus?
Genoma de un retrovirus.
- LTR Secuencias que bordean al retrovirus.
- RetrovirusLTR - Gag Pol (retrotranscriotasa) Env - LTR
- Retrovirus del sarcoma en los gatos porduce cancer.
o HERV (human endogens retrovirus).
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Se cree que son retrovirus insertos en el genoma: Line (ms largo) , Sine y Alu se han
formado debido a errores.
o Line gen pol.
o Sine gen env
o Ms del 45% de genoma humano posee retrotrasposones.
o Algunas enfermedades son causadas por saltos de retrotransposones, ya que se
mete en el medio del gen y lo apaga. Estas enfermedades son las sigueintes:
Hemofilia A y B
Inmunodificiencia severa combinada
Porfiria
Cncer (BRCA 2) heriditaria
Distrofia muscular de Duchenne
Trombos (cuagulos sanguineos en la sangre).
o Podemos apagar a los retrotransposones por RNA de interferencia y protenas.
o Casi siempre producen dao, pero puedes domesticarlo para que sean buenos.
- Por ejemplo, si se estudia retrovirus. Ellos necesitan protena env, una protena para
fusionarse con la membrana. Entonces, si se estudia LTR (similar a env) , en la
sincitina, se deduce que esta tiene un origen de un retrovirus. Se dice que el paso a
la viviparidad es gracias a un retrovirus y se dio lugar a los mamferos.
- Solo son importantes cuando retrotrasposones estn en clulas germinales, porque
se heredan.
- Se originaron en retrovirus que infectaron clulas germinales, si por alguna razn el
virus del VIH infecta a una clula germinal y esa clula germinal da a un individuo y
el individuo nace con VIH. Entonces individuo est genticamente infectado.
- Las nicas consecuencias en clulas NO germinales son cncer y envejecimiento.
Se secuencia genoma de ornitorrinco para ver si hay sincitina y no se encontr. Lo cual dice
que hay un ancestro comn. Por ejemplo, en canguros si hay el retrovirus, pero est
metilado. En los primates existe muy poco salto de transposn, al contrario como sucede en
los ratones.
Cmo se comparan los cromosomas?
o En rojo tamao de genomas, y en azul el DNA que codifica protenas.
o Salamandra ms basura que protenas = humanos.
o Hay plantas que han perdido todo la basura
El problema del DNA eucariota es que debe asegurarse que la copia de un gen vaya a
clulas hijas.
Por qu hay tanta basura?
o Por infecciones de genes que se quedan insertados
o O genes que nuestros ancestros usaban, pero nosotros ya no.
Experimento universitario hicieron que pollo naciera con dientes.
GENMICA COMPARATIVA nos permite conocer que es lo que diferencia a dos especies
animales, la ubicacin de mutaciones importantes.
Para saber por qu seres humanos somos as, qu nos hace diferentes.
Diferencias entre primates y humanos, debido a presiones selectivas:
o Gen FOXP2 Gen involucrado en el habla.
o Gen de la microcefalina Microcefalia, gen del tamao del cerebro.
o Gen AMI1 Gen involucrado en el sistema imunitario.
POLIMORFISMOS de una solo base (SNPs)
Mutaciones puntuales de 1 sla base que corresponden a la mayor cantidad de cambios
que tienen los genomas.
90% de variacin entre humanos son por SNIPs
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4. Cadenas pesadas
o Hay 2 genes que codifican: las protenas que lo forman las cadenas pesadas y a
las protenas que forman las cadenas livianas. Las cadenas pesadas tienen 1 slo
loci mientras que las livianas tienen 2 (esto es porque las livianas tienen 2 tipos de
cadenas). Entonces para que se produzcan las inmunoglobulinas se prenden estos
3 genes que estn en diferentes cromosomas
o Las regiones variables y constantes forman los dominios (aros). Cada dominio tiene
100 aa. Y son producidos por aa sulfurados unidos por puentes disulfuro. De
hecho, las cadenas pesadas se unen por puentes disulfuro, entre las pesadas y
livianas tambin hay puentes disulfuro. Y entre estas mimas tambin.
o Cuando un antgeno estimula a linfocito B, este cambia de forma y se convierte en
una clula plasmtica (huevo frito) para formar anticuerpos. Por lo general el ncleo
es desplazado y crece el retculo.
La respuesta a un antgeno:
o Cuando entramos en contacto por 2 vez con el antgeno, los anticuerpos aumentan
en pico.
o Cuando se aplica una nueva vacuna, se da una subida pero no tanto como en la
segunda vez que entramos en contacto con el antgeno. Esto se da por Memoria
inmunolgica: es muy especfica (en realidad lo que cambia es el gen del linfocito)
Hay varios tipos de Ig (Inmunoglobulinas):
o IgM Encargados de la respuesta primaria. Primera inmunoglobulina que
linfocitos B producen (esto es en ausencia de antgeno).
o IgG Encargados de la respuesta secundaria. Principal contra infecciones. Est
en suero sanguneo.
o IgA bloquea entrada de patgenos. Estn en las mucosas.
o IgE asociada a alergias. Son problemas genticos.*
Regin variable Parte que reconoce el antgeno, formada por los 6 dedos (3 de la
cadena pesada y 3 de la ligera)
o Existen regiones hipervariables dentro de las regiones variables (HVR)/CDR:
regiones variables de la cadena ligera que coincide con las puntas de los dedos.
o Cuando se leen a todos los aa que forman las protenas de la cadena
liviana/pesada se encuentran los sitios donde hay mayor diversidad de aa.
Hacia aa 25 (HVR1 est en el extremo amino), 50 (HVR2 en el extremo
carboxilo), y 90 (HVR3). La HVR3 es la que ms vara.
Cmo se genera la diversidad?
Mayor diversidad en cadena pesada
Cmo es que teniendo 20000 protenas, podemos producir 10 a la 9 anticuerpos.
o Experimento de Susumo Tonegawa: clulas embrionarias de un ratn y tambin
clulas precursoras de linfocitos B. Sac el DNA y lo cort con una enzima de
restriccin y observ:
- Genes que contienen a las regiones constantes y variables ms pequeos en
DNA de linfocitos precursores de linfocitos B que en clulas embrionarias. Esto
se explica: hay un proceso en el cual los dos pedazos de DNA se combinan, de
tal manera que se pierde DNA. Lo cual sugiere un re arreglo de los genes.
- Entonces, lo siguiente que hizo fue secuenciar el DNA de las inminoglobulinas.
El gen de la cadena pesada tienen miles de cassets, cada uno de los cuales
codifica una cadena variable: 15 D, 5J y despus se encuentra a los genes que
codifican. Entonces, lo que propuso es que para que se forme una
inmunoglobulina, el casset V (1000) se juntaba con el D (15) y luego con J, lo
que nos lleva a una gran cantidad de posibilidades de las cadenas de los
anticuerpos.
29
Entonces todo lo anterior explica por qu clula precursora es ms corta que de la de embrin, ya
que la precursora ha pasado por proceso de acortamiento
- En cassets V y J: hay secuencias invertidas que se recombinan (heptmeros y
nonmeros) en cadena Kappa, H y delta.
- Rag1 y 2 (Recombinasas) SLO reconoce la barriga (estructura secundaria
con sitio de recombinacin
formado por 23 y 12).
- Estas enzimas (Rag 1 y 2 slo se
prenden en los linfocitos B y
tambin el T.
La recombinacin no es un proceso que sea preciso puesto que entre los cassets se
pueden recombinar de varias formas.
o La recombinacin de los heptamros y nanmeros puede ocurrir en cualquier
nucletido. Por ejemplo: si 2 linfocitos recombinan casset V3 con D2, no hay
garanta que las 2 cadenas codifiquen para lo mismo
- Aun cuando los cassets sean las mismas, pueden haber cambios en los aa. Es
muy posible tambien que se produzcan codones de parada y no pueden los
linfocitos producir anticuerpos.
- Es decir; dos cassets pueden dar productos diferentes porque aa se combinan
diferente.
CLASE 4
OJO: Cadenas pesadas son las que tienen genes que codifican para inmunoglobulinas.
Cadena ligera es ms fcil porque slo tiene casset V y J.
Por ejemplo, clula de pelo = que mieloma (osea clulas ms grandes)
Estructura de cadenas: secuencias invertidas de 7 y 9 aa, 23 y 12 nucleotidos.
OJO!! Recombinacin se da en 1 de los 7 nucletidos.
Formas distintas posibles de unin: recombinaciones que se pueden dar sin producir codn
de parada.
La explicacin de por qu 3 locis que codifican para Ig, se producen 10 a la 9 anticuerpos
diferentes, es que hay una abundante diversidad de cassets que forman cadenas pesadas,
livianas y las diferentes formas posibles de unin de genes. Entonces si se multiplican, se
da una gran diversidad.
30
Exclusin allica
Recombinacin en vida fetal inicia en cadena pesada (escoge un alelo y una vez que ya se
produjo la protena, esta apaga la recombinacin en el otro alelo.
Luego empieza en liviana, con kappa y sucede lo mismo de arriba.
El linfocito se muere cuando ambos alelos producen codones de parada (90%)
Ambas cadenas vienen de cromosomas diferentes.
En cadena pesada, en el gen variable estn los 3 dedos. El tercer dedo es el ms variable
porque justo coincide con la regin donde se mezclan D y J. Tienen un sitio de
recombinacin ligeramente diferente, por lo que reconocen antgenos un poco diferentes.
Adems dedo 3 tiene pedazos de D, J y V.
Cadena liviana no tiene casset D.
Algo importante es que antgeno estimula a ciertos linfocitos para producir anticuerpos,
estos anticuerpos compiten entre si y solo los que sean mas capaces sobreviven.
Hipermutacin somtica:
Cuando linfocito B es estimulado por 1 antgeno por primera vez, la clula empieza entra en un
estado de hipermutacin somtica.
Hay una enzima citocina deaminasa, quita amino de citosinas. Es decir, introduce
mutaciones al azar.
Esto se hace con el fin de que las clulas mutadas compitan entre ellos para que se
produzcan anticuerpos con mayor afinidad al antgeno. Se seleccionan los que tienen
mayor afinidad y resto mueren por apoptosis. Esto es beneficioso:
o Por ejemplo: en vacunas: a medida que aumenta el tiempo de la vacuna, aumenta
la afinidad de anticuerpos por antgenos.
o Las mutaciones en los anticuerpos que sobreviven son las que se dieron en los
dedos.
Edicin del receptor
Recombinacin de genes en etapa fetal sin control de calidad, com producto de esta recombinacin
puede ser un anticuerpo que reconozca PROPIOS antgenos.
Ej: en enfermedades autoinmunes.
o Delecin clonal: cuando se eliminan antgenos propios por parte de anticuerpos.
o Una vez que han eliminado al antgeno, hay algunos linfocitos que no se degradan y
en etapas posteriores pueden causar enfermedad autoinmune.
o Estos linfocitos van a la sangre, pero Hay mecanismos que impiden que estos
linfocitos se repliquen.
Por eso es que podemos producir protenas que antes no producamos:
embarazo, adolescencia.
Deleccin de receptor: cuando un linfocito que est a punto de morir despus de haber
reconocido un antgeno propio, activa (recombina otro alelo) al otro alelo que codifica para
cadena liviana (en este caso sera lamda, puesto que inicia con Kappa)
o Pero es posible que si se cambia de alelo, ya no va a reconocer a antgeno. Esto es
deleccin de receptor (osea hace que linfocito ya no reconozca antgeno propio
activando a otro alelo de cadena liviana)
Cambio de isotipo
Al nacer, todos nuestros linfocitos tienen IgM en la superficie.
Una vez que se estimula con antgeno a un linfocito, pasa de ser IgM a ser IgG, IgA, etc.
Cmo pasa esto?
o Por recombinacin
- Entonces, otra vez volvemos a lo que vismos antes. La cadena pesada es la
que tiene a los genes C que codifican para las inmunoglobulinas diferentes.
- IgM: Niu
31
32
PARCIAL 3
CAPTULO 12 : Control de la expresin gnica.
Las clulas de todos los organismos portan una informacin gentica mucho mas abundante que
la que utilizarn en un momento dado. En los organismos eucariotas el control de la expresin
gnica esta estrechamente relacionada con la diferenciacin celular. En procariotas la expresin
gnica responde a los estmulos ambientales.
12.1 Control de la expresin gnica en bacterias.
En procariotas la mayora del DNA posee funcin codificante y existe un espaciamiento pequeo
entre genes. Genes que intervienen en los mismos procesos biolgicos se agrupan en conjunto
para regularse de manera coordinada.
En bacterias, la presencia de lactosa induce la sntesis de la enzima B-galactosidasa para romper
el disacrido. De igual manera, la ausencia del triptfano en bacterias induce a la sntesis de
protenas capaces de sintetizar este aminocido. Los genes que codifican enzimas de una va
metablica suelen agruparse en un cromosoma formando un complejo funcional denominado
opern. Un opern consta de genes
estructurales, un promotor, una regin
operadora y un gen regulador. Los
genes estructurales se encuentran uno
junto a otro. Todos los genes
estructurales de un opern se
transcriben en un mRNA continuo que
se traduce en polipptidos/enzimas
individuales de la va metablica. Este
tipo de mRNA se denomina mRNA
policistrnico. El promotor es el sitio
donde la RNA polimerasa se une al DNA
antes de iniciar la transcripcin. El
operador, el cual esta adyacente o
traslapado al promotor, sirve como sitio
de unin para una protena represora, la
cual determina si el gen se transcribe o
no. El gen regulador codifica la protena
represora. La capacidad del represor
de unirse al operador es controlada de
manera alostrica por un compuesto
clave de la va metablica. La
concentracin de este compuesto
determina si la transcripcin del gen se
activa o no. En un opern reprimible
(como el triptfano), el represor es
incapaz de unirse al DNA operador por si mismo, y solo lo har cuando este forma un complejo con
un correpresor. La unin del correpresor al represor cambia la estructura del represor permitiendo
que este se pueda unir al operador. En un opern inducible (como el opern Lac), la presencia de
una sustancia metablica fundamental induce la transcripcin de los genes estructurales. La unin
de este compuesto al represor cambia la estructura del represor logrando as que el este no sea
capaz de unirse al operador. En un opern inducible, la protena represora solo puede unirse al
DNA operador en ausencia de un compuesto (en este caso lactosa), la cual funciona como inductor.
El opern Lac posee 3 genes estructurales en tndem. El gen Z codifica la B-galactosidasa, el gen
Y la permeasa de galactsido y el gen A la acetil-transferasa de tiogalactsido. En estos dos casos
anteriores, los represores ejercen su influencia por control negativo. En algunos casos (como el
operon Lac) la regulacin se da por control positivo. Esto sucede cuando hay una baja de
33
concentracin de glucosa, la cual acta en el medio para suprimir la produccin de varias enzimas
metablicas. El control positivo esta mediado por el AMP cclico o cAMP. El cAMP acta al unirse a
la protena receptora cAMP (CRP). El complejo cAMP-CRP reconoce un sitio especfico de la regin
controladora Lac y se une a ella. La presencia del complejo cAMP-CRP ocasiona un cambio de
conformacin en el DNA permitiendo que la RNA polimerasa transcriba el opern Lac. El sitio de
unin de la RNA polimerasa en el promotor del opern Lac no tiene gran afinidad por esta, es por
ello que el inicio de la transcripcin es ineficiente y depende del cAMP-CRP, incluso en presencia
de lactosa.
Otro mecanismo de control por es la atenuacin. La atenuacin es la regulacin de la terminacin
de la transcripcin en los operones. En el caso del operon trp, al haber grandes cantidades de
triptfano, la RNA polimerasa para la transcripcin poco despus de haber comenzado. En caso
de que las concentraciones de trp sean bajas, la transcripcin termina luego de que todo el opern
haya sido transcrito. El mecanismo de atenuacin vincula estructuras de RNA secundarias
alternativas al proceso de terminacin de la transcripcin. Una vez transcrito, el RNA de la regin
lder se pliega en una de dos estructuras secundarias alternativas. Una de ellas es una seal de
final de terminacin de la transcripcin, lo cual impide que la RNA polimerasa contine hasta el final
del opern. La otra estructura alternativa no posee seal de terminacin y permite la transcripcin
de un solo mRNA de los genes estructurales. La concentracin del trp regula la seleccin de alguna
de las dos estructuras.
Varios mRNA bacterianos son capaces de unirse a un metabolito pequeo como la glucosamina o
adenina. Esta unin se da en la regin 5 no codificante del mRNA. Una vez unido al metabolito, el
mRNA (ribointerruptor) sufre un cambio en su conformacin modificando la expresin de un gen
implicado en la produccin de ese metabolito. De esta forma, los ribointerruptores actan por medio
de un mecanismo de retroalimentacin. La mayora de estos suprime la expresin gnica
bloqueando la terminacin de la transcripcin o el inicio de la traduccin. Los ribointerruptores al
igual que los represores, permiten que las clulas ajusten la expresin gnica en respuesta a
cambios en la disponibilidad de metabolitos determinados.
12.2 Control de la Expresin gnica en eucariotas.
A diferencia de los procariotas, el genoma de los eucariotas esta empacado en cromatina dentro
del ncleo, como consecuencia las protenas de unin al DNA especficas necesitan detectar sus
sitios de unin en el contexto DNA protenas implicado. En el ncleo de una clula en interfase hay
cromatina, uno o mas nuclolos, y el nucleoplasma. La envoltura nuclear consta de dos membranas
celulares organizadas de forma paralela y en conjunto estas membranas contienen mas de 60
protenas transmembrana distintas. Ambas membranas se fusionan en sitios formando poros
circulares que contienen complejos de protenas. Generalmente la membrana externa posee
ribosomas y se contina con la membrana del RE rugoso. La superficie interna de la envoltura
nuclear de las clulas animales se une mediante protenas integrales de membrana a una delgada
red de filamentos que se conoce como lmina nuclear, la cual sirve como apoyo mecnico a la
envoltura nuclear, como sitio de unin para las fibras de cromatina en la periferia y participan en la
replicacin y transcripcin del DNA. Mutaciones en los genes de la lmina (LMNA) causan distrofia
muscular (EDMD2), sndrome de progeria de Hutchinson-Gilford.
La envoltura nuclear es el punto de actividad para el movimiento de RNA y protenas hacia fuera y
dentro del ncleo. Los poros nucleares contienen un aparato complejo en forma de dona
denominado complejo de poro nuclear (NPC). El NPC es un complejo supramolecular con simetra
octagonal, se forma de aprox. 30 protenas diferentes denominadas nucleoporinas. Las protenas
contienen secuencias de aminocidos cercanos al grupo C-terminal que funcionan como seal de
localizacin nuclear, la cual capacita a una protena para que pase por los poros nucleares y
penetre el nucleo Contina
En procariotas el DNA no est empacado en cromatina y las protenas de unin al DNA se adhieren
de manera directa. En eucariotas, las protenas necesitan detectar los sitios de unin.
34
En el ncleo se ve una masa amorfa y viscosa en donde hay cromosomas observados como fibras
de nucleoprotena (cromatina), uno o ms nuclolo (sintetizar rRNA ribosmicos y el ensamble de
ribosomas) y nucleoplasma (sustancia lquida en la que los solutos del ncleo se disuelven). La
heterocromatina se evidencia alrededor de la superficie interna de la envoltura nuclear.
La envoltura tiene dos membranas celulares paralelas separadas de 10 a 50 nm. Tienen ms de 60
protenas transmembrana (ej protenas de vinculacin entre la membrana nuclear externa y
elementos del citoesqueleto). Ambas membranas se fusionan en sitios, formando poros con
ensambles complejos de protenas. La membrana externa est tapizada con ribosomas y se
contina, al igual que la luz, con la membrana del RER. Los filamentos de actina y los filamentos
intermedios del citoesqueleto estn conectados a la membrana nuclear externa por protenas
fibrosas (nesprinas). Y la superficie interna de la envoltura se une con protenas una red de
filamentos llamada lmina nuclear (10nm) que sirve de apoyo para la envoltura, de unin para fibras
de cromatina en la periferia y participa en la duplicacin y transcripcin del DNA. La lmina est
formada de polipptidos denominados lminas de la familia de los polipptidos de los filamentos
intermedios. La lmina se desensambla previo a la mitosis por fosforilacin. Mutaciones en el gen
LMNA, de la lmina, producen una rara de distrofia muscular (llamada EDMD2) donde las clulas
musculares tienen ncleos muy frgiles. Tambin est vinculado con el sndrome de progeria de
Hutchinson-Gilford (HGPS): envejecimiento prematuro y muerte en la adolescencia por ataque
cardiaco o apopleja, produce ncleo malformados an cuando la mutacin es de tipo sinnima
(produce el mismo aminocido pero se alter el splicing del transcrito produciendo una protena
ms corta).
Cromosomas y cromatina: el cromosoma humano de mayor tamao tiene 300 millones pb, si entre
cada pb hay 0.34 nm, estos pb abarcaran un cromosoma de 10 cm. Cmo es posible incluir 46
cromosomas en un ncleo de slo 10 m de dimetro? Los cromosomas se componen de DNA y
protenas, que en conjunto se conocen como cromatina, y su empaquetamiento depende de las
histonas (pequeas protenas que poseen un contenido inusualmente alto de los aminocidos
bsicos arginina y lisina). Se dividen en cinco clases dependiendo de la relacin arginina/lisina: H1,
H2A, H2B, H3 y H4 (de menor a mayor cantidad de Arg, y de mayor a menor cantidad de Lys). La
secuencia de a.a de H3 y H4 han tenido pocos cambios durante largos periodos de la evolucin.
Estn muy conservadas porque interactan con el esqueleto de la molcula de DNA, que es idntico
en todos los organismos (Ej: histona de vaca y arveja). Adems casi todos los aminocidos de una
histona interactan con otra molcula por lo que pocos de ellos pueden reemplazarse con otros sin
afectar significativamente la funcin de la protena.
Cuando la cromatina se trata con nucleasas inespecficas, se producen fragmentos de 200pb, pero
cuando el DNA desnudo se trata de similar manera, se producen al azar fragmentos de diferentes
tamaos. Esto sugiere que el DNA cromosmico est protegido de ataques enzimticos con ayuda
de las protenas. En el 74 Kornberg postul que el DNA y las histonas se organizan en subunidades
repetidas llamadas nucleosomas. Cada nucleosoma tiene una partcula central de 146pb de ADN
superenrollado que consiste en 1.8 vueltas de DNA superenrollado en forma negativa alrededor de
un disco formado por ocho histonas. En el ncleo hay 2 copias de cada tipo de histona, excepto de
la H1 que est fuera de la partcula central. Es una histona conectora porque se une a una parte del
DNA conector que une un nucleosoma a otro. La H1 puede disociarse de la cromatina y volverse a
unir, as como se pueden retirar con soluciones de fuerza inica baja. Cuando la cromatina est
libre de H1, las partculas centrales y el DNA conector desnudo se observan como cuentas de un
collar. Las histonas en total interactan con aprox. 168pb. El disco de 8 histonas se organizan en
4 heterodmeros: 2 dmeros H2A-H2B y 2 dmeros H3-H4 mediados por los dominios C-terminal.
Cada uno se une a 27-28pb contactando con el surco menor. Cada histona del disco tiene: una
regin globular llamada pliegue de histonas con 3 hlices , y una cola amino terminal flexible
que se proyecta fuera del disco (con excepcin del C-terminal de H2A que tambin sale). Las colas
carecen de una estructura terciaria por lo que no aparecen en las estructuras obtenidas por rayos
X, y stas son objetivos para enzimas que ayudan a que la cromatina sea accesible para ciertas
protenas.
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Las histonas se modifican para alterar las caractersticas de los nucleosomas, pero tambin se
generan versiones alternativas de las H2A
y H3. Entre ellas estn las CENP-A en los
centrmeros, H2A.X que reemplaza a la
H2A en una fraccin de los nucleosomas y
se fosforila en sitios de rotura del DNA para
reclutar enzimas de reparacin, y H2A.Z y
H3.3 para la activacin de la transcripcin.
Tasa de empaquetamiento: nucleosoma
10nm, 200pb en c/u, 0.34nm= 70nm 7:1
Niveles superiores de la estructura de la
cromatina: cuando la cromatina se libera del ncleo se observa una fibra de 30nm de grosor, que
es la organizacin de nucleosomas en una fibra ms gruesa. Hay dos modelos de enrrollamiento
que difieren en la posicin de los nucleosomas dentro de la fibra. El ms probable es el de zigzag
donde el DNA de unin salta de manera alternante entre partculas centrales
consecutivas, disponiendo a los nucleosomas en pilas que se pliegan en una
estructura helicoidal. El otro modelo es el solenoide, el DNA se curva para
conectar partculas centrales consecutivas, formando una sola estructura
helicoidal con 6-8 nucleosomas por vuelta. Se incrementa la tasa de
empaquetamiento 6 veces ms. Para que se mantenga la fibra de 30 nm, las
histonas y nucleosomas interactan. Las H1 la mantiene enrollada y las
histonas centrales de nucleosomas adyacentes interactan por las colas. La
cola de la H4 puede hacer contacto con el DNA conector y el dmero
H2A/H2B de otros nucleosomas. De ah los filamentos se organizan
en una serie de asas superenrolladas, o dominios que se compactan
en fibras ms gruesas de 80 a 100 nm. Las asas de se unen en su
base con protenas de un andamiaje nuclear y se diseminan dentro
del ncleo. Una de las protenas es la cohesina (anular) que tambin
conserva unidas a las cromtidas durante la mitosis. Los cromosomas
mitticos son la ltima etapa de empaquetamiento; un cromosoma de
1 m de longitud tiene 1 cm de DNA= tasa 10 000:1.
Heterocromatina y eucromatina: cuando termina la mitosis, la
cromatina regresa a su condicin de interfase difusa, pero cerca de
10% (heterocromatina) permanece en forma condensada y puede
apreciarse en la periferia del ncleo, cerca de la lmina nuclear porque se tie fuertemente, y tiene
poca o ninguna actividad transcripcional. En la periferia del ncleo se encuentran factores que
reprimen la transcripcin, lo cual genera un entorno favorable para la localizacin de la
heterocromatina. Tanto la eucromatina como heterocromatina se heredan. La heterocromatina
puede ser constitutiva si permanece en el estado compactado en todas las clulas durante todo el
tiempo y no se transcribe. En mamferos se encuentra flanqueando a los telmeros, en el centrmero
y la parte distal del brazo del cromosoma Y. Consiste en secuencias repetidas y pocos genes, y
puede inactivar genes adyacentes por un efecto de posicin, e inhibe la recombinacin entre
secuencias repetitivas homlogas produciendo duplicaciones y deleciones. La diseminacin de la
heterocromatina en los cromosomas se bloquea por secuencias especializadas de barrera
(elementos de frontera). La heterocromatina facultativa es cromatina que se ha inactivado de
manera especfica durante ciertas fases del desarrollo o clulas diferenciadas. En mamferos
hembras slo un cromosoma X tiene actividad transcripcional, y el otro est condensado como un
cmulo de heterocromatina (corpsculo de Barr) que se condensa durante la fase temprana del
embrin, para asegurar que las clulas de hembras y machos sinteticen cantidades equivalentes
de los productos codificados por los genes del cromosoma X. El corpsculo de Barr es responsable
por los patrones de color de los gatos calic hembras y heterocigotas, porque el gen para el color
36
37
Para convertir eucromatina a heterocromatina lo primero que ocurre es la eliminacin de los grupos
acetilo de H3 y H4, que se acompaa de la metilacin de H3K9 catalizado por una metiltransferasa
de histonas, que slo se dedica a metilar. Esta enzima en los humanos se encuentra en el interior
de la heterocromatina. Esta metilacin de este residuo, le confiere a la cola de H3 la capacidad de
unirse con alta afinidad a protenas que contienen un dominio llamado cromodominio. La mejor
estudiada es la protena heterocromtica 1 (HP1) que forma y mantiene la heterocromatina. Cuando
HP1 se une a una cola de H3, interacta con la metiltransferasa y otras HP1 de nucleosomas
cercanos, generando una red interconectada de nucleosomas metilados y luego de un dominio de
cromatina compactada de un orden superior.
Telmeros: las puntas de cada molcula de DNA estn compuestas por secuencias repetidas
(T2AG3/A2TC3-500 a 5000 veces) llamadas telmero que forman una cubierta en cada extremo de
un cromosoma. Esta secuencia no cambia entre vertebrados, y vara poco en otros organismos (la
funcin es conservada). La Polimerasas no pueden
replicar si no tienen un extremo 3 libre, por lo que
cuando se quita el cebador de la cadena 3-5, el
extremo 5 se queda sin un pequeo segmento de
DNA, haciendo que el extremo 3 de una cadena sea
ms grande que el extremo 5 de la otra cadena. La
hebra que sobresale se pliega sobre s misma
formando un asa para proteger el extremo corto (un
extremo colgante invade la cadena doble). Esta es
un sitio de unin para un complejo de 6 unidades
llamado protectina que se une en los telmeros,
impidiendo que el aparato de reparacin confunda
los telmeros como cadenas de DNA daadas. Hay
que agregar que los extremos 5 de cada punta del
cromosoma se procesan con nucleasas, aumentando an ms los extremos de cadena sencilla.
Luego una telomerasa con RNA complementario al extremo sobresaliente rico en G sirve como
plantilla para la adicin de nucletidos al extremo 3 (hace ms largo el extremo colgante). Luego
de la sntesis de DNA, el RNA de telomerasa se transloca a este nuevo extremo, sirviendo como
inciador para la incorporacin de nucletidos. Las clulas envejecidas tienen que ver con el
desgaste de los telmeros. En otras no pasa eso: clulas madre, clulas hematopoyecticas, clulas
de reparacin de la piel, porque tienen la telomerasa, que es una transcriptasa inversa.
Enfermedades: Parkinson. Cuando la telomerasa sigue activa forma clulas tumorales. La
telomerasa es importante para que los cromosomas se repliquen completamente. Las clulas
germinales expresan telomerasa y conservan largos los telmeros. Otras no tienen esa enzima y
conforme se acortan los telmeros cesa la proliferacin celular. Estas clulas pueden vivir si se les
estimula eliminando el inhibidor p21 de crecimiento. El periodo de detencin de crecimiento se
conoce como crisis.
Centrmeros: sitio donde se constrie el cromosoma. Tiene heterocromatina constitutiva. Ah est
la histona variante H3, CENP-A, para que se forme el cinetocoro que es el anclaje de los
microtbulos y posteriormente. En humanos el centrmero tiene secuencias repetida en tndem de
171 pb (DNA satlite ). Los cromosomas que carecen de centrmero tienen problemas para
ensamblarse a un cinetocoro y se pierden durante la divisin celular. El DNA centromrico tiene
diferencias marcadas en la secuencia incluso nucleotdica, inclusive entre sp. especiesmuy
relacionadas. As que la secuencia en s no parece ser importante para la estructura del centrmero
y su funcin. Pieza ms de DNA cromosmico que forma un cromosoma diminuto= cromosoma
marcador. stos no tienen DNA satlite y an as tienen un centrmero.
12.3 Aspectos generales de la regulacin gnica en organismos eucariotas.
Cualquier clula de un organismo eucariota posee todos los genes necesarios para transformarse
en otra clula de dicho organismo. De este modo, Frederick Steward demostr que las clulas de
38
la raz de una planta poda producir una planta completa. John Gurdon demostr que el ncleo de
una clula intestinal diferenciada de Xenopus trasplantada a un oocito sin ncleo poda generar un
anfibio completo. Ian Wilmot clon a la oveja Dolly al trasplantar ncleos de las clulas de las
glndulas mamarias a vulos no fecundados cuyos cromosomas fueron extrados. Por lo tanto la
forma en la que los genes se utilizan determina las propiedades de una clula. As, un ncleo de
una clula diferenciada puede reprogramarse con factores que residen en el citoplasma de su
nuevo ambiente. Una clula eucariota adulta en promedio codificar 5000 polipptidos en un
momento, muchos de estos son forman protenas esenciales para su funcionamiento (house
keeping genes), mientras que otras son protenas nicas para su estado diferenciado. La regulacin
de la expresin gnica en eucariotas ocurre en niveles distintos: A nivel de la transcripcin, que
determina si un gen se transcribe o no y con que frecuencia. A nivel del procesamiento, lo cual
determina la va por la cual el pre-mRNA se procesa en un mensajero maduro que puede traducirse
en un polipptido. A nivel de la traduccin, lo cual determina si un mRNA se traduce, con que
frecuencia y por cuanto tiempo. Y a nivel postraduccional, lo cual regula la actividad de las
protenas.
12.4 Control de la transcripcin.
La transcripcin es el mecanismo ms importante por el cual las clulas activan o reprimen la
expresin gnica. Los micromatricies de DNA (chips de DNA) y la secuenciacin masivamente
paralela (RNA-Seq) son tcnicas que permiten conocer con detalle y de manera simultanea la
actividad de los genes en un tipo celular. Primero se asla el RNA de clulas y se analizan los perfiles
de expresin gnica. En el caso del micromatriz de DNA, se generan fragmentos de DNA mediante
tcnicas de clonacin y se colocan estos fragmentos en pozos que contienen diferentes genes. Los
mRNA de las clulas estudiadas se purifican y se los convierte en ssDNA marcados con
fluorescencia. Finalmente se hibrida el DNA en la micro matriz con el ssDNA marcado y se analiza
con un microscopio de fluorescencia. En el caso de las levaduras se coloca fluorescencia verde a
los ssDNA cuando la levadura consume glucosa y produce etanol, y se coloca fluorescencia roja a
los ssDNA cuando la levadura tiene etanol y produce energa mediante fosforilacin oxidativa. De
esta manera se puede conocer que genes estn siendo expresados en un momento determinado
y la abundancia del los mRNA en cierto punto, lo que indica que tanto se expresa ese gen. Las
micromatrices de DNA se utilizan para estudiar cambios en la expresin gnica que ocurren durante
una amplia variedad de sucesos biolgicos.
En la secuenciacin masivamente paralela (RNA-Seq), los fragmentos obtenidos de DNA se
secuencian de forma directa y se hace cartografa de su ubicacin en el genoma. Esta tcnica
permite identificar todos los fragmentos y volver a ensamblarlos en transcritos completos y as
cuantificar los niveles exactos de cada uno de ellos para desarrollar perfiles de expresin gnica
en las clulas estudiadas. Estas tcnicas permiten identificar que genes se expresan, por ejemplo,
en el cncer mamario y as ajustar el tratamiento a cada paciente de forma personalizada.
El control de la transcripcin est dirigido por un gran numero de protenas llamadas factores de
transcripcin (TF), los mismos que pueden ser generales (GTF) o especficos. Los generales se
unen a los sitios promotores en relacin con las RNA polimerasas, y los especficos se unen a varios
sitios reguladores de genes particulares. Los TF especficos pueden actuar como activadores o
represores transcripcionales. Cada TF interacta con secuencias de DNA diana especficas. Genes
individuales son controlados por muchos sitios reguladores de DNA diferentes que se ligan con
diversos factores de transcripcin. Por otro lado, un solo factor de transcripcin se puede unir a
varios sitios del genoma y controlar la expresin de diferentes genes de un hospedador. Cada TF
posee cierta afinidad por un sitio de unin. Corriente arriba de un gen pueden haber varios sitios
de unin para un TF, y cada uno de ellos con una secuencia un poco diferente lo que cambia la
afinidad. Se necesita la unin de varios TF para que inicie la transcripcin. Las clulas expuestas a
diferentes estmulos sintetizan diferentes factores trasncripcionales. La extensin en la que un gen
se transcribe depende de la combinacin de factores transcripcionales que se unen a elementos
39
reguladores corriente arriba. Los factores de transcripcin NFAT-1 y AP-1 se unen corriente arriba
del gen de citocina en la respuesta inmunitaria.
El fenotipo final de una clula es muy estable. Existen factores reguladores maestros que dirigen la
diferenciacin de tejidos. Este es el caso de MyoD el cual dirige la diferenciacin muscular en
vertebrados y Eyeless el cual interviene en el desarrollo de los ojos de la mosca de la fruta.
Las clulas madre embrionarias se pueden renovar a si mismas de forma ilimitada y son
pluripotenciales, es decir, se pueden diferenciar en cualquier tipo de clula. Las clulas se pueden
reprogramar en clulas indiferenciadas. Los factores Oct4, Sox2, Myc y Klf4 son los encargados de
mantener a las clulas indiferenciadas. El proceso de reprogramacin celular ocurre de forma
gradual conforme las clulas se dividen. La reprogramacin causa una reorganizacin de las
marcas epigenticas.
Los factores de transcripcin contienen diferentes dominios que participan en aspectos distintos
de su funcin. Un dominio es de unin al DNA y el otro es de activacin, el cual regula la
transcripcin al interactuar con otras protenas. Los dominios de unin se pueden agrupar en clases
con estructuras relacionadas (motivos) que interactan con secuencias de DNA. Generalmente los
motivos se insertan en en surco mayor del ADN reconociendo las pares de bases en este. La unin
de estos al DNA se realiza mediante fuerzas de van der Waals, enlaces inicos y puentes de H. Los
diferentes motivos son los siguientes:
Dedos de cinc: El ion cinc de cada dedo se coordina con dos cistenas y dos histidinas. Las
cistenas forman parte de una lamina B-plegada en un lado del dedo
de cinc, mientras que las histidinas forman parte de una hlice alfa
en el lado opuesto. Las protenas dedos de cinc poseen varios dedos.
Los dedos de cinc actan independientemente unos de otros y se
encuentran espaciados para proyectarse en los surcos mayores
sucesivos del DNA blanco. El factor TFIIIA, Egr que activa los genes
de la divisin celular y los factores GATA que participan en el
desarrollo del musculo cardiaco son dedos de cinc. Los dedos de
cinc proveen un marco estructural para una amplia variedad de
aminocidos que reconocen un grupo diverso de secuencias de
DNA.
Hlice-asa-hlice (HLH): se caracteriza por dos segmentos de hlice alfa separados por un asa
intermedia. El dominio HLH es precedido por aminocidos bsicos cuyas
cargas positivas interactan con el DNA y determinan la especificidad de
secuencia del TF. Los motivos HLH bsico siempre forman dmeros, como en
el caso de MyoD. Si cada subunidad del dmero es codificada por un gen
distinto se dice que es un hterodmero. El hecho de que se puedan formar
heterodmeros aade diversidad de factores de regulacin debido a que se
pueden formar muchas combinaciones distintas.
Los factores de transcripcin con estructuras HLH intervienen en la
diferenciacin de tejidos, en el control de la proliferacin celular y en la
generacin de ciertos tipos de cncer. Genes (MYC, SCL, LYL-1 y E2A)
translocados que codifican bHLH conducen al desarrollo de cnceres especficos. Por ejemplo el
gen MYC del cromosoma 8 al translocarse al cromosoma 14 genera linfoma Burkitt.
Cremallera de Leucina: Es un motivo en el cual las leucinas estn presentes cada 7 aminocidos a
lo largo de la secuencia de la hlice alfa. Todas las leucinas a lo largo del polipptido se encuentran
en la misma direccin. Las cremalleras de leucina existen como dmeros. Dos hlices alfa de estas
al juntarse forman una estructura superenrollada. La estructura se une al DNA porque contiene un
fragmento de aminocidos bsicos en un lado de la hlice alfa que contiene leucina. El segmento
bsico y la cremallera de leucina juntos se conocen como estructura bZIP. Al igual que en las
protenas bHLH, las porciones de hlice alfa de las protenas bZIP son importantes en la
dimerizacin y el grupo de aminocidos bsicos le permite a la protena reconocer una secuencia
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de DNA especfica. Un ejemplo de un TF del tipo bZIP es la AP-1 la cual se compone de dos
subunidades codificadas por los genes FOS y JUN. Estos genes desempean una funcin
importante en la proliferacin celular.
El gen PEPCK codifica la enzima carboxicinasa de
fosfoenolpiruvato, la cual es clave en la conversin
del piruvato en glucosa. La enzima se sintetiza
cuando las concentraciones de glucosa son bajas,
sin embargo su produccin decae despus de
ingerir productos ricos en carbohidratos. La
transcripcin del gen PEPCK esta controlado por
una variedad de factores de transcripcin
diferentes. La clave para entender la regulacin y expresin de un gen reside en descubrir las
funciones de las secuencias DNA reguladoras corriente arriba del gen, identificar los TF que se
unen a estas secuencias y aclarar las vas de sealizacin que activan la maquinaria de expresin
del gen. La secuencia de regulacin mas cercana al gen es la caja TATA la cual es uno de los
elementos del promotor central del gen. Los promotores eucariotas se encuentran ubicados en
diferentes regiones. La regin desde la caja TATA hasta el sitio de inicio de la transcripcin se
conoce como promotor central, el cual es el
sitio de ensamble para la RNA-pol II y
diferentes factores generales de transcripcin
GTF. Adems de la caja TATA, las cajas
CAAT y CG que se encuentran corriente
arriba son necesarias para que se inicie la
transcripcin. Las cajas CAAT y GC se ubican
entre 100 y 150 pb corriente arriba del gen en
la regin promotora proximal, se unen a
factores de transcripcin como NF1 y SP1 y regula la frecuencia con la que el gen se transcribe.
Por el contrario, la caja TATA se encuentra de 25 a 30 pb corriente arriba y determina el sitio de
inicio de la transcripcin.
Generalmente los genes poseen mas de un promotor, lo que permite que el inicio de la transcripcin
ocurra en ms de un sitio corriente arriba de un gen. Los transcritos primarios producidos tienen
extremos 5 muy distintos. En algunos casos los promotores alternativos conducen a la sntesis de
un mismo polipptido, sin embargo estos tendrn regiones no traducidas 5 diferentes lo que hace
que estn sujetos a diferentes tipos de control a nivel de la traduccin. En otros casos se generan
protenas relacionadas que difieren en la secuencia de aminocidos del extremo aminoterminal. En
otros casos se transcriben RNA que se traducirn en diferente marco de lectura para producir
pptidos totalmente diferentes. Para identificar que sitios del genoma que interactan con un TF se
usan diferentes mtodos:
Mapeo por delecin: En este procedimiento se preparan molculas de DNA con deleciones en el
promotor, luego se insertan estos DNA en clulas y se mide la capacidad de los mutantes de iniciar
la transcripcin. Si ocurre una delecin en alguna de las cajas TATA, CAAT o CG, la transcripcin
se reduce. La delecin de otras regiones puede no tener efecto o incrementarse la transcripcin.
Huella de DNA (DNA foot-printing): Es cuando un TF se une a una secuencia de DNA y protege que
esta sea diferida por nucleasas como la DNasa I. Se digiere la cromatina y se identifican las
secuencias de DNA protegidas.
Anlisis de localizacin en el genoma completo: Permite vigilar al mismo tiempo todos los sitios del
genoma unidos a un factor de transcripcin determinando bajo condiciones especficas. Para ello
se asla una clula en alguna etapa de desarrollo y se usa un fijador que forma uniones entre los TF
y el DNA de unin. La cromatina se aisla, se rompe y se cultiva con un anticuerpo que reconoce el
TF de inters. Luego se realiza la inmunoprecipitacin de la cromatina en la cual se induce la
precipitacin de los fragmentos de cromatina con el TF unido. Posteriormente el DNA puede ser
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para hacerla accesible a la maquinaria de transcripcin. Estos dos tipos trabajan juntos para activar
la transcripcin de un gen. Cada complejo coactivador opera en conjunto con una amplia variedad
de TF. TFIID es un GTF (factor general de transcripcin) y el componente principal de este es el
TBP (TATA binding protein) el cual se une a la caja TATA. Su adhesin es facilitada por varios
factores vinculados con la TBP (TAF). El coactivador que se comunica entre los TF unidos al
potenciador y la maquinara de transcripcin se conoce como mediador. Este interacta con la
RNApol II y es necesario para el funcionamiento de los activadores de la transcripcin.
Las modificaciones de las colas de histonas poseen efectos en
la estructura y funcin de la cromatina. La metilacin en residuos
de H3K9 causa compactacin. La acetilacin de las lisinas en las
histonas causa un efecto contrario. La acetilacin incrementa el
acceso de regiones del DNA para su interaccin con protenas.
Se usan tcnicas ChIP para localizar modificaciones especficas
en las histonas y anticuerpos para reconocer dichas
modificaciones. Los residuos H3K9 y H4K16 se acetilan y los
H3K4 y H3K36 se metilan. Las acetilaciones en las histonas H3 y
H4 y metilaciones en H3K4 se aglomeran en regiones
promotoras, y estn ausentes en los cuerpos de los genes. Las
metilaciones en los residuos H3K36 se concentran en los
cuerpos de los genes. El comienzo de la transcripcin se
relaciona con la fosforilacin de aminocidos Ser5 en el CDT
(cola) de la RNApol II. Estos aminocidos fosforilados actan
como plataforma de reconocimiento de la metil transferasa de
histonas Set1 la cual metila H3K4 en el promotor. Estos residuos
metilados son sitios de unin de complejos proteicos de
remodelacin de la cromatina y splicing. H3K36 es metilado por
la metil transferasa Set2 la cual se desplaza con la polimerasa
durante la enlongacion. La metilacin de H3K36 hace que el
complejo enzimtico Rpd3S desacetile la lisina en las histonas a
medida que se transcribe el gen. Esto previene la iniciacin
inapropiada de la transcripcin en un gen.
En los promotores durante las transcripcin, los grupos acetilo
se agregan a los residuos de lisina en las histonas mediante la
acetiltransferasa de histonas (HAT). Diferentes coactivadores
tienen actividad HAT. Una vez que el TF receptor de
glucocorticoides (GR) se une a su sitio especfico, el activador
dirige al coactivador CBP hacia una regin de la cromatina para
la transcripcin. El coactivador acetila las histonas creando un
sitio de unin para el complejo de remodelacin de la cromatina
SWI/SNF. Las acciones de estos diferentes complejos
incrementan la accesividad del promotor a la maquinaria de
transcripcin. Las subunidades TAFII250 y TAF1 de TFIID
tambin tienen actividad acetiltrasnferasa de histonas.
Los complejos de remodelacin de la cromatina utilizan energa
del ATP para alterar la estructura de los nucleosomas. Las
maquinas de remodelacin SWI/SNF constitudos por 9-12
subunidades son reclutados por promotores particulares gracias
a marcas epigenticas en las histonas.
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CBP acetila las histonas nucleares y genera un sitio de afinidad para el complejo de remodelacin.
Cuando este complejo se recluta en el promotor altera las histonas en el DNA causando: 1)
Promover la movilidad y por ende el desplazamiento del octmero de histonas. IFN-de TFIID hace
esto exponiendo as la caja TATA. 2) Cambiar la conformacin
del nucleosoma haciendo el sitio mas accesible. 3) Facilitar el
remplazo de una histona por una modificada (H2A/H2B por
H2AZ/H2B) la cual se correlaciona con transcripcin activa. 4)
Desplazar por completo el nucleosoma.
La digestin de DNA no
cubierto por histonas y su
posterior secuenciacin
permite realizar mapas
de los nucleosomas. La
mayor parte de los genes
comparten
una
arquitectura comn de
cromatina. La ubicacin
de un nucleosoma en un
sitio especfico en el DNA
no es aleatoria y regula la transcripcin de genes.
Secuencias promotoras se ubican en regiones libres de
nucleosomas (NFR) y adyacentes a estas se encuentran dos
nucleosomas. La NFR del promotor permite el acceso a los
sitios blanco del DNA. Si el sitio de inicio de la transcripcin
esta cubierto por un nucleosoma, este es menos estable y
contiene variantes de histonas (H3.3 y H2A.Z). Las regiones
promotoras de la cromatina son blanco de una gran
variedad de enzimas modificadoras de histonas, complejos
remodeladores de cromatina y TF con especificidad gnica.
Diversos factores se unen a promotores e inducen el
reclutamiento de GTF, complejos modificadores de cromatina y RNApol II. Las RNApol II tambin
se unen a promotores de genes que no se transcriben. En otros casos la polimerasa sintetiza un
RNA de 30 nucletidos y cesa su actividad generando un transcrito primario incompleto. Las RNA
pol se mantienen en estado pausado por factores inhibidores DISF y NELF. La inhibicin se libera
cuando los inhibidores son fosforilados por cinasas como P-TEGb y posteriormente factores de
elongacin son reclutados.
En los organismos eucariotas, al igual que en bacterias, existen mecanismos de regulacin negativa
por represores. La desacetilacin de la cromatina es mediada por la desacetilasa de histonas
(HDAC). HDAC se relaciona con la represin de la transcripcin y se presenta como subunidades
de complejos correpresores. Los correpresores (como CoREST) son reclutados por factores
transcripcionales (represores) que hacen que los genes blanco se silencien. Ciertas clulas
tumorales tienen la capacidad de reprimir genes, en este caso se usan frmacos que inhiben HADC
especficas. La desacetilacin esta acompaada de la metilacin. La protena SUV39H1 es
encargada de metilar el residuo K9 en las histonas H3.
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HOTAIR es el vnculo entre estos dos complejos. Los lncRNA actan como andamios para que los
complejos proticos se acerquen a sitios especficos en el genoma y desempean una funcin
generalizada en la regulacin de la expresin de genes.
12.5: Control del procesamiento del RNA
Al final de la transcripcin un mRNA tiene que pasar por un
procesamiento de una aadidura de un casquete 5, splicing
y una cola poli A 3. El patrn de corte de intrones o splicing,
permite que surjan diferentes productos de un mismo gen. A
esto se le conoce como splicing alternativo. Un ejemplo de
ellos es la fibronectina, la generada en los fibroblastos y
retenida en la matriz es codificada por un mRNA con dos
exones ms en comparacin a la sintetizada en el hgado y
secretada en la sangre. El gen Dscam codifica una
familia de molculas de adhesin celular que se
expresan en la superficie de la clula y guan a los
axones durante la fase inicial del desarrollo neuronal
de la mosca de la fruta. El gen posee 24 exones pero
posee versiones alternativas de los exones 4, 6, 9 y
17. Los exones 4 y 6 codifican segmentos de dos de
los dominios de Ig, el exn 9 codifica algo diferente
de Ig y el 17 codifica el dominio transmembrana de la protena. Debido a las posibilidades de
combinacin, Dscam puede codificar 38106 molculas de adhesin. Drosophyla posee solo 14K
genes, pero el splicing alternativo genera un proteoma mucho mas grande.
La maquinaria de splicing escoge sitios especficos 3 y 5 para ser
cortados, muchos factores influencian esto. Algunas regiones
denominadas frgiles son ignoradas por la maquinaria de splicing
bajo ciertas condiciones. El reconocimiento de los sitios de splicing
frgiles se controla mediante secuencias de RNA que incluyen
potenciadores exnicos de splicing, los cuales se localizan dentro
de los exones. Estas secuencias sirven como sitio de unin para
protenas reguladoras. Estas protenas se pueden unir a un
potenciador de splicing y reclutar factores necesarios hacia un sitio
frgil cercano a 3 o 5. Esto resulta en la inclusin del exn dentro
del mRNA. Si la protena reguladora no se produce en la clula, los
sitios de splicing vecinos no se reconocen y el exn se elimina junto
con los intrones adyacentes a este.
Las protenas SR inactivan los sitios de splicing y los hnRNP los
reprimen. SR se unen a sitios potenciadores de splicing de exones
o intrones (ESE e ISE). hnRNP se unen a sitios silenciadores de
splicing de exones o intrones (ESS e ISS). La unin de tales protenas regula la seleccin del sitio
de empalme al identificar si componentes de empalme (como U2AF, snRNP U1, y snRNP U2) se
unen o no a un sitio particular en el pre-mRNA.
En la edicin del mRNA nucletidos especficos se transforman en otros luego de la transcripcin.
Esta edicin crea nuevos sitios de splicing, codones de detencin o produce sustituciones de
aminocidos. Este mecanismo es importante como en el sistema nervioso en el que las Adeninas
se convierten en inosinas al eliminar el grupo amino del nucletido. La maquinaria lee a I como G.
El receptor para glutamato el cual media la transmisin sinptica estimulante en el cerebro es un
producto de esto. El cambio de A por I hace que el conducto interno de la molcula sea
impermeable a Ca+.
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que son sitios de unin para protenas que son desestabilizadoras (AUF1) y microRNA (miR-430)
que inducen la desadenilacin y destruccin. Si una de estas secuencias se introduce en la UTR 3
de un mRNA de globina, la vida media se reduce de 10 h a 90 min. En cambio si se eliminan estas
secuencias del mRNA del gen FOS, la vida media aumenta y las clulas se hacen malignas.
Funcin de los microRNA en el control de la traduccin: los miRNA actan unindose a las UTR 3
de sus mRNA blanco. Actan
incluso en el embrin temprano (Ej:
los animales que carecen de Dicer
productora de miRNA no se
desarrollan ms all de la gstrula,
o si slo est ausente en un tejido,
ste igual se desarrolla con
anomalas. Mecanismo: los miRNA
forman parte de un complejo
miRNP que se une a la UTR 3 de
mRNA especficos, suprimiendo la
expresin
despus
de
la
transcripcin: (1) induciendo la
desadenilacin y la degradacin
de mRNA, (2) bloqueando la
iniciacin de la traduccin (reconociendo el casquete 5 o unindose a la subunidad 60S), (3)
inhibiendo la elongacin (lentificando o inactivando el ribosoma) y (4) degradando los pptidos
recin formados regulando proteasas. mRNA y miRNA tambin pueden formar pares que se
almacenan en los cuerpos P, cuando salen del cuerpo ya reanudan la traduccin. ORF= marco de
lectura abierto que es el segmento codificador de aminocidos de mRNA. Estos modelos se
identificaron por 1era vez embriones de peces cebra, donde el miR-430 eliminaba el mRNA materno
induciendo la desadenilacin y la degradacin, por reclutacin de exonucleasas al extremo 3.
Muchos mRNA maternos se almacenan para usarse en el desarrollo del embrin, pero conforme se
transcriben se induce su destruccin. Este mecanismo se da ratones, humanos y es prevalente en
plantas. Se observa que las cantidades mRNA guardan relacin inversa con los niveles de miRNA
complementarios. Los miRNA tambin facilitan tambin una respuesta rpida a condiciones de
estrs, bloqueando la traduccin de mRNA especficos, guardndolos en los cuerpos P hasta que
algn estrs libere la inhibicin y permita reanudar la traduccin.
12.7: Control postraduccional: determinacin
de la estabilidad de las protenas
Las clulas tienen mecanismos para controlar
el lapso que las protenas sobreviven. La La
degradacin de protenas se realiza en
mquinas cilndricas llamadas proteasomas
que estn en el ncleo y el citoplasma. Estn
formadas por 4 anillos apilados con 7
subunidades (son similares pero no idnticas)
ms capuchones en cada extremo de la pila.
Los dos anillos centrales son de subunidades
, 3 de ellos con funcin proteoltica (en
procariotas todas las subunidades son activas)
y su sitios activos hacia la cmara central donde ocurre la digestin. Slo se digieren ciertas
protenas que estn marcadas para su destruccin. Se eligen porque se reconocen como
anormales (plegamiento anormal o vinculacin incorrecta con otras protenas). La eleccin de las
normales se basa en su estabilidad biolgica, su longevidad (Ej: enzimas de la gluclisis o las
globinas duran das y semanas, las protenas de la replicacin o las que activan la divisin celular
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son de minutos). Bortezomib es un frmaco que inhibe la digestin proteasmica, para tratar cncer.
La secuencia de a.a especficos en el extremo amino terminal de un polipptido parecen controlar
el tiempo de vida de una protena. Los polipptidos que terminan en arginina o lisina suelen ser de
vida corta. Las protenas del ciclo celular se marcan al fosforilarse. Otras, tienen una secuencia
interna llamada degrn que hace que no sobrevivan mucho tiempo. Con la ubiquitina, que es
conservada, las protenas se marcan para su destruccin. stas estn formando una cadena
transfirindose a residuos de lisinas gracias a ligasas de ubicuitina (E1, E2 y E3). Las enzimas que
se encargan de este proceso comprenden una gran familia de ligasas de ubicuitina. A partir de esto
la protena es reconocida por el capuchn superior del proteasoma que remueve la cadena y
desplega la protena blanco usando ATP. Slo as el polipptido pasa por una abertura estrecha,
formada por el anillo de las subunidades , pasando a la cmara central y digirindose. Los
polipptidos se liberan al citoplasma donde se degradan en a.a.
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parte anterior, media o posterior del cuerpo. Los genes pair-rule se expresan a continuacin y sus
mRNA se sitan en bandas alternas demarcando los limites de los segmentos generales dentro de
cada regin general. Posteriormente se expresan los genes de polaridad de segmento en bandas
mas restringidas conformando as los lmites dentro de segmentos individuales. De esta manera los
genes gap (que son 9), pair-rule (8) y de polaridad de segmento (9) se expresan por orden y en
regiones cada vez mas restringidas y el eje anteroposterior establecido por bicoid se divide
progresivamente en un organismo segmentado. De igual
forma, los genes de segmentacin interactan
directamente entre s desencadenando cascadas de
sucesos. Bicoid activa la transcripcin de los genes gap,
algunos gap codifican TF que regulan la expresin de los
pair-rule y estos a su vez regulan los genes de polaridad
de segmento. Esta jerarqua entre bicoid y los dems
genes se denomina cascada de regulacin. Cada uno de
los genes define un nivel de la cascada que se
desencadena gracias a bicoid y es afectada ms tarde
por otras seales. Estos mismos mecanismos generales
de regulacin son aplicables al resto de organismos
eucariotas, tales principios son los siguientes: --------->
Una vez que los genes gap, pair rule y de polaridad de
segmento han establecido la identidad de cada segmento a lo
largo del eje antero posterior del embrin de la mosca, se activan
los genes hometicos. Los genes de segmentacin establecen
los limites de cada segmento y los genes hometicos identifican
que segmento es cada uno y desencadenan el desarrollo de
estructuras apropiadas para cada segmento. La homeosis es
cuando se sustituye una estructura por otra y ocurre cuando las
clulas obtienen informacin incorrecta acerca de su situacin
en el organismo. En la mosca existen 8 genes que al poseer
defectos ocasionan homeosis y se los ha dominado genes hox.
Los genes hox expresan un patrn distintivo a lo largo del eje
antero-posterior y codifican para TF que desencadenan la
produccin de estructuras concretas en cada segmento. Se han
encontrado genes hox en otras especies animales y su
organizacin cromosmica es parecida a los genes hox de la mosca. Los genes hox desempean
un papel clave en la identificacin de la posicin de las clulas a lo largo del eje cabeza-cola del
cuerpo. En un experimento se transfiri el gen Hoxb6 del ratn a embriones de la mosca. Al no ser
introducido con sus secuencias reguladoras, este gen ocasion los mismos efectos que causa el
gen Antp en la mosca cuando se encuentra alterado. Esto sugiere que los genes Hox son
homlogos en las especies, provienen de un ancestro comn y surgieron antes del origen de los
animales. El gen Pax est implicado en la formacin de los ojos en los animales.
Los TF reguladores y las seales ms importantes se han conservado a lo largo de la evolucin y
son un principio general del desarrollo de animales y plantas. De igual forma, durante el desarrollo,
se usan los mismos TF reguladores y las mismas seales intercelulares en varios contextos. Por
ejemplo, los genes hox no solo participan en la definicin del eje antero-posterior, sino que tambin
estn involucrados en el desarrollo de estructuras. Otro ejemplo de ello son los genes wingless
(Wnt) los cuales son una familia de 15 genes y estn implicados en la cascada de regulacin que
ayuda a establecer el eje antero-posterior, pero tambin estn involucrados en la formacin de los
msculos de la espalda, la regin media del cerebro, extremidades, gnadas, folculos, intestinos
y riones. Los organismos multicelulares tienen una caja de herramientas de seales comunes, vas
de transduccin de seales y protenas reguladoras que se utilizan durante el desarrollo. Estas
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pueden dirigir el desarrollo de estructuras diferentes por que se despliegan en momentos diferentes
y ubicaciones diferentes.
21.4.- Para que se desarrolle un embrin las clulas tienen que proliferar, moverse, diferenciarse e
interactuar. Cambios genticos que alteran los procesos de desarrollo constituyen los cimientos del
cambio evolutivo. La investigacin de evolucin y desarrollo (evo-devo) se centra en comprender
como los cambios en los genes de desarrollo ocasionan la evolucin de nuevos fenotipos.
Las serpientes a pesar de no poseer
extremidades son tetrpodos. Las boas y
pitones poseen vestigios de los huesos
plvicos y un fmur rudimentario. De esta
manera se sabe que las serpientes
perdieron sus extremidades a lo largo de la
evolucin. Los genes Hoxc6 y Hoxc8 se
expresan juntos en las vertebras que
forman costillas. Sin embargo, cuando
Hoxc6 se expresa sin Hoxc8 se generan extremidades en dicha regin. En las serpientes, Hoxc6 y
Hoxc8 se expresan juntos en la parte donde se deberan formar las extremidades anteriores. Por lo
tanto un cambio en la regulacin del gen Hoxc8 llev a la perdida de la extremidad anterior. La
prdida de las extremidades posteriores se debe a defectos en una molcula de sealizacin
codificada por el gen Sonic hedgehoc producto de un cambio gentico en la parte de la cascada
de sealizacin que establece el eje antero posterior. En ambos casos, cambios en la cascada de
regulacin motivaron cambios en el cuerpo adulto de un ancestro de las serpientes.
22.- Introduccin al desarrollo animal: En los animales, el vulo fecundado pasa por una rpida
serie de divisiones celulares. Las clulas resultantes se mueven de manera amplia y coordinada y
el embrin se reorganiza. Las seales intercelulares causan la produccin de conjuntos especficos
de factores de transcripcin en varias clulas del embrin, lo que resulta en la expresin gentica
diferencial y diferenciacin. La gametognesis es el proceso por el cual se producen gametos, los
cuales son haploides. A la gametognesis le sigue la fecundacin o unin de gametos.
Posteriormente el vulo fecundado se multiplica rpidamente en un proceso llamado segmentacin
formando una masa de clulas denominada bstula. Posteriormente las clulas se reordenan en un
proceso denominado gastrulacin. Durante esta fase de desarrollo, al embrin se le denomina
gstrula.
22.1.- El desarrollo comienza con la gametognesis en los rganos reproductores adultos. El DNA
y el citoplasma de los gametos sern los componentes del nuevo individuo. Tanto vulo como
espermatozoides aportan un juego de cromosomas, sin embargo el vulo es el que aporta mucho
mas citoplasma. Los espermatozoides se desarrollan a partir
de una clula haploide y poseen 4 regiones principales: la
cabeza, el cuello, la parte media y la cola. En la cabeza se
encuentra el ncleo y una estructura llena de enzimas
denominada acrosoma, el cual se encuentra en la punta del
espermatozoide y se deriva de las vesculas producidas por el
aparato de Golgi. Las enzimas de este le permiten al
espermatozoide penetrar barreras alrededor del vulo. En el
cuello se encuentra un centriolo el cual se unir al del vulo y
ayudar a formar el huso mittico. La parte media posee
mitocondrias las cuales proveen la energa para el
espermatozoide. La cola consiste en un flagelo compuesto por
microtbulos y rodeado de una membrana plasmtica, el
flagelo le provee motilidad al espermatozoide.
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Los vulos son de mayor tamao que los espermatozoides debido a que contienen los nutrientes
necesarios para el desarrollo temprano del embrin. Adems de esto tambin poseen molculas
claves reguladoras del desarrollo llamadas determinantes citoplasmticos que controlan los
primeros eventos del desarrollo. En las especies que poseen desarrollo placentario, el vulo es
pequeo debido a que estos obtienen los nutrientes de la placenta. En las especies que ponen
huevos, las reservas del huevo son la nica fuente de nutrientes hasta que el nuevo ser nazca. En
estas especies la yema proporciona los nutrientes para el desarrollo temprano, esta es rica en grasa
y protena; y puede estar presente como una gran masa o como grnulos pequeos. Muchos vulos
poseen grnulos corticales, los cuales son vesculas llenas
de enzimas que se activan durante la fecundacin. Estos
grnulos se sintetian en el aparato de Golgi, se transportan
a la superficie celular y se localizan debajo de la superficie
interior de la membrana plasmtica. La membrana vitelina
es una capa de glucoprotenas fibrosas que rodea la
membrana citoplasmtica, en mamferos esta estructura
es muy densa y recibe el nombre de zona pelcida. En
algunas especies una capa gelatinosa rodea a la
membrana vitelina para proteger ms al vulo.
22.2.- En la fecundacin un espermatozoide se une a un vulo
para formar un cigoto. La fecundacin ha sido ampliamente
estudiada en los erizos de mar, los cuales poseen
fecundacin externa. La capa gelatinosa que rodea al vulo
posee una molcula (pptido) que atrae a los
espermatozoides. Cuando estos se encuentran, el
espermatozoide debe penetrar la capa gelatinosa. Esto
sucede gracias a la reaccin acrosmica que se
desencadena gracias al contacto entre la cabeza del
espermatozoide y la membrana gelatinosa. En este
acontecimiento el contenido del acrosoma se libera. Las
enzimas que se difunden digieren un camino para que el
espermatozoide pueda llegar a la membrana vitelina del vulo.
En la segunda parte de la reaccin se produce el proceso
acrosmico en la cabeza del espermatozoide mediante la
polimerizacin de actina en microfilamentos. Cuando el
espermatozoide hace contacto con la membrana vitelina, las
membranas plasmticas de los dos gametos se unen. El
ncleo, las mitocondrias y el centriolo ingresan al vulo, pero las mitocondrias del espermatozoides
sern degradadas. Cuando ambos ncleos se unen, la fecundacin ha terminado.
La fertilizacin cruzada entre especies se evita debido a que en la superficie de los vulos existe
una sustancia llamada fertilicina. Esta sustancia est involucrada en el acoplamiento
espermatozoide-vulo. La fertilicina de un vulo interacciona con una sustancia en el
espermatozoide denominada bindina. La fertilicina es una protena cerradura de la superficie de
los vulos que se une a la binina la llave de una manera especfica para cada especie. Durante la
fecundacin, las molculas de bindina especfica de la especie que estn en el espermatozoide
interactan con los receptores de fertilicina especficos de la especie que estn en la superficie del
vulo. sta interaccin es necesaria para que se unan las membranas plasmticas de ambos.
55
La
poliespermia
es
una
fecundacin mltiple del vulo. El
bloqueo de la poliespermia se da
con la construccin de una barrera
fsica
a
la
entrada
de
espermatozoides luego de la
fecundacin. La entrada de un
espermatozoide hace que iones de
Calcio (Ca2+) se liberen de sus
lugares de almacenamiento en el
vulo. Este cambio en las
concentraciones
de
calcio
desencadena
una
serie
de
acontecimientos dentro del vulo.
Los grnulos corticales dentro de la membrana plasmtica se fusionan con la membrana y liberan
su contenido al exterior. Las proteasas existentes en este contenido digieren el fragmento externo
del receptor del vulo para el espermatozoide y se impide la unin de otro espermatozoide al vulo.
La elevada concentracin de iones de calcio tambin hace que el agua fluya por osmosis hacia el
espacio entre la membrana plasmtica y la membrana vitelina. La entrada de agua ocasiona que la
matriz de la membrana se separe de la clula y se forme una membrana de fecundacin, la cual
impide que otro espermatozoide haga contacto con la membrana plasmtica del vulo.
En el caso de los mamferos, la fecundacin ocurre internamente y como resultado la hembra elige
a un macho antes de la interaccin espermatozoide-vulo. Adems, la reaccin acrosmica ocurre
despus de que la cabeza alcance a la zona pelcida. La interaccin entre las glucoprotenas del
vulo y las molculas de la superficie de la cabeza del espermatozoide hace que estos se peguen
a la zona pelcida, lo cual desencadena la reaccin acrosmica. El bloqueo de la poliespermia se
da debido a que las enzimas liberadas por los grnulos corticales destruyen al receptor del vulo
para el espermatozoide. Las enzimas de los mamferos modifican las glucoprotenas del vulo de
manera que se impida la unin de cualquier otro espermatozoide.
22.3.- La segmentacin es la rpida divisin celular que tiene lugar en los animales luego de la
fecundacin y es el primer paso de la embriognesis. La embriognesis es el proceso por el que
un cigoto unicelular se convierte en un embrin multicelular. La segmentacin separa el citoplasma
del vulo sin haber un crecimiento celular. Este proceso de divisin celular es el ms rpido de toda
la vida de un individuo. Las clulas creadas mediante segmentacin reciben el nombre de
blastmeros. Una vez que la segmentacin ha terminado, a la masa de clulas resultante se le
denomina blstula. El patrn de
segmentacin
vara
entre
especies. En la segmentacin
radial, las clulas se dividen en
ngulos recto una respecto de
otras. En la segmentacin espiral,
las clulas forman ngulos
oblicuos unas con otras. En la
segmentacin discoidal (de aves
y peces) se producen muchas
clulas alrededor o sobre la
yema. En la segmentacin
superficial
(insectos),
la
citocinesis no sigue a la mitosis y
un gran nmero de ncleos se
esparce por el citoplasma. Luego
estos ncleos migran a la
56
periferia del embrin y se forman las membranas plasmticas a su alrededor. Como resultado de la
segmentacin las clulas terminan con diferentes determinantes citoplasmticos. Un determinante
citoplasmtico es una molcula existente en los vulos y que ayuda a dirigir el desarrollo temprano.
Estos se encuentran en ubicaciones especficas dentro del citoplasma del vulo y en consecuencia
terminan en poblaciones concretas de blastmeros. Como resultado, solo se desencadenan ciertas
cascadas de regulacin de genes en algunos blastmeros dando
como resultado la diferenciacin celular.
En los humanos se da la segmentacin rotacional y como resultado
de esta segmentacin se obtiene un blastocito, el cual posee dos
poblaciones de clulas. El exterior es una estructura hueca de
paredes finas llamado trofoblasto. El interior del trofoblasto
contienen un grupo de clulas denominado masa celular interna
(ICM). Al llegar al tero, el blastocito se implanta en la placenta la
cual es un rgano derivado de clulas madres y clulas del
trofoblasto y facilita el intercambio de nutrientes y desechos entre
la sangre de la madre y la del embrin.
22.4.- A medida que la segmentacin est cercano a su final, la divisin celular se ralentiza y le
sigue el proceso de gastrulacin. Durante este proceso, movimientos celulares amplios y
organizados reordenan las clulas embrionarias en una estructura denominada gstrula. El patrn
de gastrulacin vara entre especies tanto como los patrones de segmentacin. La gastrulacin da
como resultado la formacin de capas de tejido embrionario. Un tejido es un conjunto integrado de
clulas que funciona como una unidad. Los embriones poseen tres capas de tejido: ectodermo,
mesodermo y endodermo. Estos tejidos reciben el nombre de capas germinativas debido a que
dan lugar a los rganos y tejidos del adulto. Del ectodermo se genera el SN y la cubierta externa
del cuerpo; del mesodermo se generan los msculos, rganos internos y tejido conectivo; del
endodermo se produce el tubo digestivo. El destino de cada clula est determinado por seales
intercelulares,
TF
y
determinantes citoplasmticos
en los blastmeros. La blstula
contiene un espacio interior
lleno de fluido denominado
blastocele. Cuando comienza
la gastrulacin, las clulas se
mueven hacia este espacio
mediante invaginacin y se
forma el blastoporo. Las
clulas de la periferia se
continan moviendo hacia el
interior del embrin a travs
del blastoporo, formando la
parte inicial del tubo digestivo.
En la gastrulacin los ejes
principales del organismo se
vuelven visibles debido a que
el blastoporo se convertir posteriormente en el ano.
22.5 La organognesis es el proceso de formacin de rganos y tejidos una vez que se ha
completado la gastrulacin. Durante este proceso, las clulas proliferan y se diferencian. El hecho
de que una clula se convierta en un tipo particular de clula es el final de una larga y compleja
secuencia de acontecimientos mediados por las cascadas de seales intercelulares que
interaccionan y los TF reguladores.
El primer paso de la organognesis en los cordados es la aparicin de la notocorda en el
mesodermo a lo largo del eje antero-posterior. En algunas especies, la notocorda es una estructura
57
de larga duracin que funciona como un esqueleto interno. Pero en otras especies como humanos,
la notocorda es efmera y a medida que avanza la organognesis esta sufre de apoptosis. La
notocorda sirve como un elemento clave de organizacin durante la organognesis. Las clulas de
la notocorda y las adyacentes a estas producen molculas de sealizacin que inducen que el
ectodermo se doble. Estas seales desencadenan cambios en los elementos del citoesqueleto que
estn dentro de las clulas ectodrmicas dorsales. Segn se reorganiza el citoesqueleto, las clulas
del ectodermo se alargan y se constrien en su extremo dorsal para ampliarse en el extremo ventral.
Este proceso hace que la lmina de clulas se doble hacia arriba y se forme el tubo neural. El tubo
neural es el precursor del cerebro y de la mdula espinal. La notocorda tambin proporciona un
soporte fsico a medida que las clulas ectodrmicas se van doblando hasta alcanzar su
configuracin final.
Luego de la formacin del tubo neural, las clulas
mesodrmicas cercanas se organizan en bloques de tejido
llamados somitas en respuesta a los cambios en las
molculas de adhesin de la clulas que mantienen a las
clulas mesodrmicas unidas unas con otras. Los somitas
son estructuras efmeras y estn destinadas a formar una
variedad de estructuras. Las somitas se dividen en
poblaciones diferentes que migran a su ubicacin final en
el embrin. Las clulas de los somitas formarn las
vrtebras, costillas, msculos y piel de la espalda, paredes
del organismo y las extremidades. El destino de caca clula
del somita depender de su posicin en un momento
concreto durante la organognesis. A medida que madura
el somita, sus clulas se van determinando de manera
irreversible basado en su ubicacin dentro del somita. Las
clulas del somita se diferencian en respuesta a distintas
combinaciones de seales intercelulares. Estas combinaciones nicas de seales dirigen el
movimiento de las clulas del somita cuando la estructura se rompe y desencadena la produccin
de los TF para la expresin de protenas especficas como la de los msculos, huesos o piel. As, la
organognesis se da con la formacin de estructuras embrionarias como la notocorda, el tubo
neural y los somitas y continuar con la formacin de huesos, msculos y rganos.
En el caso de los msculos, estos se darn origen a partir de los mioblastos. Un mioblasto es una
clula determinada para convertirse en clulas musculares, pero aun no produce las protenas
especficas para este. Los mioblastos contienen al menos una protena reguladora. Estos empiezan
a producir esta protena determinante despus de recibir una serie adecuada de seales
provenientes de tejidos cercanos. Las clulas de la parte exterior de los somitas contienen una
protena reguladora llamada MyoD la cual hace que se diferencien en msculo. El gen MyoD
codifica un TF regulador y la protena MyoD se une a elementos activadores en los genes
especficos de los msculos. Adems la protena MyoD activa la expresin de MyoD. Genes
relacionados con MyoD son necesarios para la diferenciacin de las clulas musculares.
23.- Introduccin al desarrollo de las plantas: Las plantas crecen y se desarrollan a lo largo de toda
su vida. Los procesos esenciales de desarrollo: de proliferacin y expansin celular, diferenciacin
e interacciones intercelulares ocurren durante toda la vida de la planta. La mayora de las clulas
vegetales mantiene la capacidad de des diferenciarse. Se sabe que la multicelularidad evolucion
independientemente en los linajes de plantas y animales, esto incluye diferencias en la composicin
qumica de las matrices celulares, y los mecanismos de contacto y adherencia intercelulares. Dentro
de las plantas, Arabidopss thaliana es el organismo modelo ms estudiado en plantas debido a que
es de fcil cultivo, produce gran descendencia y su ciclo vital es corto, de 6 semanas. En las
plantas el vulo es fecundado dentro del folculo ovrico el cual es una estructura protectora
parecida a un tero. Luego de la fecundacin se contina con la embriognesis y se dar lugar a
58
59
60
proximidad con otras plantas. Las plantas se ajustas a estas variaciones con el crecimiento continuo
de races, tallos y hojas gracias a los meristemas.
Cuando se completa el desarrollo embrionario se han establecidos los ejes y las estructuras de
races y brotes. De ah los meristemas dirigen desarrollo en la punta de los brotes y las races
permitiendo crecer en todas las direcciones tanto areas como subterrneas. Las clulas del
meristemas son pequeas e indiferenciadas, y las seales intercelulares se producen como
respuesta a estmulos ambientales cambiando el ritmo y direccin del crecimiento. Debajo del
meristema,
las
hijas
producto
de
la
mitosis
se
diferencian
en
tejido
epidrmico/fundamental/vascular que luego se especializan.
Si se aplica auxina a un SAM puede inducirse el crecimiento de hojas. El comienzo de una hoja
depende de su concentracin y otras seales intercelulares. Cuando crece se forman 3 ejes:
proximal distal (cercano al cuerpo principal-disantes del cuerpo principal), lateral (desde la mitad
de la hoja hasta su borde), y dorsoventral. La cantidad y direccin a lo largo determina la forma.
El gen PHANTASTICA establece el eje dorso ventral. Su protena tiene un dominio de unin al ADN
y es un TF regulador. Desencadena la formacin de la superficie dorsal (adaxial) y suprime la
formacin de la superficie ventral (abaxial). Es parte de la cascada de regulacin que comienza
con la auxina y termina con el crecimiento de una hoja con forma normal. Las hojas pueden ser
compuestas si estn divididas en unidades ms
pequeas llamadas foliolos. Las palmeadas son las
que salen varios foliolos de un solo punto. Cambios en
la expresin de PHAN producen cambios evolutivos en
las hojas que puede variar entre especies. Se estudi
esto se crearon plantas de tomate transgnicas,
bloqueando PHAN bastante y poco. Salieron hojas
simples
como
copas
y
otras
palmeadas.
Evidentemente la mutacin de PHAN da lugar a cambios en el tamao y forma de las hojas. Menor
expresin de PHAN motivan hojas simples, alelos de mayor expresin motivan hojas compuestas.
Plantas y animales difieren mucho en el desarrollo de tejidos reproductores y los rganos. En
animales, las clulas que forman los gametos se aslan en el desarrollo temprano y luego migran a
las gnadas cuando stas se han desarrollado. Por esto estas clulas tienen poca mitosis (20 a 50)
antes de la gametognesis. Las plantas no tiene clulas geminales apartadas en el desarrollo
temprano. En su lugar, la floracin y gametognesis es producto de un SAM que pasa del desarrollo
vegetativo a reproductivo, dividindose a miles de veces para dar lugar a rganos reproductores y
luego a los gametos. Mutaciones se dan en cada ciclo celular generando mucha variacin gentica
ms que los animales.
Las protenas de Arabidopsis desencadenan la produccin de seales para que los SAM pasen al
desarrollo reproductivo. Un SAM puede modificarse para producir flores, convirtindose en un
meristema floral. Las flores tienen rganos reproductores, no vegetativos. Mientras la flor se
desarrolla, el meristema floral produce 4 rganos que son hojas modificadas: spalos (alrededor
de la parte externa de la flor y protegen, en algunas sp. son de color para atraer a polinizadores),
ptalos (dentro de los spalos en disposicin circular encerrando los rganos reproductores, son
de color para indicar las estructuras reproductoras a los polinizadores), estambres (son los rganos
reproductores de polen localizados dentro de los ptalos) y carpelos (los rganos productores de
vulos dentro de toda la estructura). El conjunto de cada uno se llama verticilio.
Siglo XIX: plantas con flor mutantes son hometicas. Los
rganos florales se sustituyen por otros, sin cambiar la
posicin o # de rganos. Ej: flor con spalos, ptalos,
ptalos y carpelos. Estas mutaciones son similares a la
transformacin de segmentos en mutantes hometicos
de Drosophilla.
Individuos de Arabidopsis con mutaciones hometicas
en las flores se investigaron y se clasificaron en 3 clases
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que se distinguen por el tipo de transformacin hometica. Mutantes: slo carpelos y estambres,
slo spalos y carpelos, slo ptalos y spalos. A cada uno le faltaba los elementos de dos de los
4 verticilios. Pensaban que se deba la mutacin de un solo gen.
3 genes son responsables del patrn de la flor: A,B,C
en un modelo ABC. En este modelo cada uno de los 3
genes se expresa en 2 verticilios adyacentes, dando
lugar a 4 combinaciones de productos genticos, cada
una desencadena el desarrollo de un rgano. A=
spalos, A y B= ptalos, B y C=estambres y C=clulas
precursores de carpelos. A inhibe la produccin de la
protena C, y C inhibe a A. Luego se mapearon los
genes de los fenotipos mutantes y se secuenciaron.
Utilizaron el ADN de una sola hebra para hibridar in
situ y ver el patrn de expresin de A, B y C. Los mRNA
de
los
3
genes
aparecieron: A en los 2
verticilios exteriores, B
en los 2 medios y C en
los 2 interiores. Las
combinaciones
del
modelo ABC (los genes
de
identidad
de
rganos
florales)
especifican las partes de una flor como los genes Hox en los segmentos de Drosophilla. Estos 3
genes tiene un segmento que codifican una secuencia de 58 a.a llamada MADS-box que se une al
ADN, por lo que son TF reguladores que se unen a activadores y secuencias reguladoras.
Desencadenan la expresin de genes de los spalos, ptalos, carpelos y estambres. Hay mucha
similitud entre los genes MADS-box y los Hox de Drosophilla. Los Hox tiene una regin homeobox
similar a MADS-box en funcin y codifica para un dominio de unin al ADN en las protenas Hox.
stos productos gnicos de ambos son parte de cascadas de regulacin. Hox regula la expresin
de genes de formacin de miembros y partes del cuerpo, y MADS-box regulan los genes de la
formacin de flores. Los 2 informan a las clulas acerca de su posicin y si no producen mutantes
hometicos.
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