Anda di halaman 1dari 5

Materials Today

All astonishing things are done by ordinary materials.


Your Keyw

Home

About

12.16.2011
Posted by
aldilla Labels:
characterization, chromatography, LC

Liquid Chromatography
IUPAC mendefinisikan kromatografi sebagai metode pemisahan campuran
dimana komponen yang akan dipisahkan, didistribusikan antara dua fasa yaitu,
fasa diam dan fasa bergerak dalam arah tertentu. Fasa bergerak adalah fluida yang
bergerak/ merembes di sepanjang fasa diam pada arah tertentu. Fluida dapat
berupa cairan, gas, cairan superkritis. Fasa diam dapat berupa solid, gel, atau
cairan. Berdasarkan fase gerak yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi
dua golongan besar yaitu, liquid kromatografi dan gas kromatografi.
Kromatografi cair (LC) adalah teknik kromatografi analisis yang berguna untuk
memisahkan ion atau molekul yang dilarutkan dalam pelarut (fasa bergerak
berupa cairan). Jika larutan sampel kontak dengan fasa cair, zat terlarut yang
berbeda akan berinteraksi dengan fase lain hingga derajat yang berbeda karena
perbedaan dalam adsorpsi, pertukaran ion, partisi, atau ukuran. Perbedaan ini
memungkinkan komponen campuran untuk dipisahkan satu sama lain berdasarkan
waktu transit dari zat terlarut melalui kolom. Jenis kromatografi sangat banyak
berdasarkan fase diam dan fase bergeraknya juga efisiensi dan performa
karakterisasinya.
Walaupun liquid kromatografi (LC) ditemukan lebih dulu dari kromatorafi gas
(GC), penggunaannya lebih mendominasi bahkan untuk aplikasi sederhana. LC

dapat digunakan pada pemisahan senyawa apa sanya yang bisa terlarut dalam fase
liquid. Untuk aplikasi biologis, polimer sintetis dan alami, juga senyawa
inorganik LC lebih unggul. Selain itu, adanya fase bergerak membuat LC dapat
digunakan pada suhu lebih rendah dari GC. Sehingga LC lebih sesuai untuk
memisahkan sampel yang peka suhu. Tidak seperti GC, LC lebih fleksible dalam
pengoptimalan proses pemisahan dan kebanyakan detektor LC tidak merusak.
Salah satu kekurangan LC dibanding GC adalah resolusinya. Yang termasuk
liquid kromatografi diantaranya kromatografi kertas, kromatografi lapisan tipis,
LPLC, dan HPLC.
Pada kromatografi kertas fase diam adalah kertas serap dan fase gerak adalah
pelarut. Jarak relatif pada pelarut disebut sebagai nilai Rf , yaitu jarak tempuh
senyawa dibagi dengan jarak tempuh pelarut.
Kromatografi liquid sederhana (LPLC/ Low Performance Liquid
Chromatography) terdiri dari sebuah kolom dengan dasar fritted yang menjaga
fasa tetap berada dalam keseimbangan dengan pelarut. Dengan pelarut dan kondisi
yang sesuai, komponen-komponen berbeda dalam campuran akan lewat dengan
kecepatan berbeda di sepanjang kolom dari komponen lainnya sehingga terjadi
pemisahan yang diinginkan dikarenakan perbedaan sifat partisi antara fase tetap
dan
fase
bergerak
cair.
Misalnya, kita ingin memisahkan sebuah campuran yang jika ditambahkan
pelarut akan menghasilkan warna berbeda. Warna larutan awal adalah hijau.
Pertama, penutup kran dibuka untuk membiarkan pelarut yang berada di kolom
mengering sehingga material terpadatkan rata pada bagian atas. Kemudian,
campuran dimasukan dengan hati-hati dari bagian atas kolom. Setelah itu, kran
dibuka lagi agar campuran berwarna diserap pada bagian atas material
terpadatkan. Karena pelarut mengalir secara terus-menerus, pelarut baru perlu
ditambahkan melalui bagian atas kolom dengan tidak merusak material
terpadatkan dalam kolom, sehingga kolom tidak pernah kering. Pelarut yang
mengalir dikumpulkan dalam satu gelas kimia. Seperti telah dijelaskan
sebelumnya, komponen campuran akan lewat dengan kecepatan berbeda (zat
warna
biru
dan
kuning).
Yang telah dijelaskan diatas adalah metode liquid kromatografi konvensional.
Liquid kromatografi konvensional biasanya digunakan untuk menisahkan atau
memurnikan beberapa komponen dari sebuah campuran. Analisa pemisahan
sampel untuk deteksi atau analisa kuantitatif biasanya digunakan HPLC, sebuah
metode liquid kromatografi yang lebih canggih. HPLC memiliki kecepatan,
resolusi dan sensitivitas detektor lebih baik. Ideal digunakan untuk zat bermolekul
besar dan berionik. Selain itu rekoveri sampel mudah dilakukan. Pada HPLC
digunakan ssebuah pompa untuk mendorong fasa bergerak sehingga resolusi lebih
baik dan waktu analisis lebih singkat.
Pada prinsipnya, HPLC teridiri dari tempat pelarut, pompa (untuk mengalirkan
pelarut), tempat injeksi sampel, kolom (berisi padatan fase tetap), detektor, dan
rekorder.

Fase bergerak atau pelarut yang digunakan harus dilakukan degassing terlebih
dahulu untuk mengeluarkan gas yang terlarut yang tidak diinginkan. Dalam
pemilihannya harus diperhatikan kemurnian dari pelarut, kompatibilitas dengan
detektor, kelarutan sampel, inert atau tidak, viskositas yang rendah, dan tentunya
harga
yang
sesuai.
Pompa yang digunakan bertekanan tinggi. Digunakan pengendali aliran aliran
untuk menstabilkan aliran pelarut akibat adanya perubahan tekanan gas,
temperatur, dan viskositas. Ada dua jenis pompa yang mendasari pemakaiannya
yaitu, tekanan tetap dan volum tetap. Pompa bolak-balik dengan piston akan
menarik pelarut
(fase bergerak) dan
membawanya
ke kolom.
Jarum injektor (10-500) digunakan untuk memasukan sampel ke sampel loop.
Sampel yang dibutuhkan hanya sedikit. Dengan rotasi loop sebesar 60o, pompa
akan memasukan sampel ke kolom dengan arah berlawanan dari saat sampel
dimasukan.
Kolom HPLC memiliki diameter sangat kecil (2-10mm) dan biasanya
digunakan material yang reuseable seperti stainless steel. Kolom tidak
memerlukan temperatur yang tinggi karena sifat ikatan kimia terhadap fase tetap
sangat tinggi. Ukuran kolom sangat beragam tergantung dari sampel yang
digunakan, diantaranya 10, 15, dan 25 cm panjang; 3, 5, dan 10 mm diameter luar;
4-4,6mm
diameter
dalam.
Fase tetap pada HPLC biasanya partikel berukuran 3-10 yang terpadatkan
dengan ukuran pori 70-300. Luas permukaannya 50-250 m2/g. Terkadang
digunakan surface coating pada fase tetap, diantaranya yang biasa digunakan
adalah -Si-OH dan -NH2 (fase normal), C8, C18, dan fenil (fase kebalikan),
-NH4+
(pertukaran
anion),
dan
-COO-(pertukaran
kation).
Secara umum detektor untuk HPLC harus memiliki sensitivitas tinggi, respon
menyeluruh terhadap sampel, tidak merusak sampel, tidak sensitif terhadap
perubahan temperatur dan kecepatan aliran fase bergerak, dan dapar beroperasi
secara terus menerus. Beberapa detektor HPLC yang umum digunakan
dikategorikan
menjadi
dua,
universal
dan
selektif.
Detektor universal diantaranya: refractive index (RI), sampel akan mengubah
indeks refraksi proporsional dengan konsentrasinya dengan temperatur dijaga
sebab perubahan temperatur dapat mengubah indeks refraksi, ideal untuk
menganalisa senyawa kompleks seperti gula dan karbohidrat; evaporative light
scattering detector (ELSD), penghamburan cahaya sebagai respon dari partikel
analit, lebih sensitif dari RI; mass spectroscopy (MS), paling banyak digunakan
dan
banyak
jenisnya.
Detektor selektif diantaranya: UV/VIS light, mendeteksi molekul dengan
kromofor (254nm); fluorescence, sinyal terhadap noise lebih tinggi dari UV/VIS
dan lebih sensitif, baik untuk analisa senyawa turunan; electrochemical (ECD),
fase bergerak membawa muatan elektrolit yang mengeliminasi fase normal, baik
untuk sampel yang teroksidasi atau tereduksi pada permukaan elektroda.
Output dari detektor akan dikeluarkan oleh rekorder dalam bentuk
kromatogram.
Fasa tetap yang umum (dan interaksinya dengan zat terlarut) adalah: padatan

(adsorpsi), kelompok ion pada resin (ion-exchange), dan cairan pada dukungan
solid inert (partisi).

Adsorpsi, adalah proses pemisahan bahan dari suatu campuran dengan


cara pengikatan bahan tersebut pada seluruh bagian adsorben cair yang
diikuti dengan pelarutan. Bahan yang dijadikan adsorben harus selektif,
memiliki tekanan uap rendah, tidak korosif, mempunyai viskositas yang
rendah, stabil secara termis, murah, dan memiliki daya melarutkan bahan
yang akan diadsorpsi sebesar mungkin. Dengan demikian kebutuhan akan
cairan lebih sedikit dan volum alat menjadi lebih kecil. Teknik ini cocok
untuk senyawa nonpolar yang kecil (berat molekul<5000). Keuntungan
metode ini adalah dapat memisahkan dan menahan beberapa senyawa
yang tidak bisa dilakukan dengan metode lainnya, misalnya pada
pemisahan isomer geometri. Mekanismenya dapat dilihat pada gambar
berikut, zat terlarut A mengangkat n molekul dari pelarut M dari
permukaannya.

Ion-exchange, digunakan untuk memisahkan sejumlah anion dan kation.


Anorganik kation dipisahkan pada kolom resin pemisah kation. Sementara
anorganik anion dipisahkan pada kolom resin pemisah anion.

Partisi cair-cair, tergantung dari partisi zat padat diantara dua pelarut yang
tidak dapat bercampur. Salah satu diantaranya bertindak sebagai fase diam
dan yang lainnya sebagai fase bergerak. Bahan yang digunakan biasanya
adalah silika. Mekanismenya diberikan oleh hubungan berikut.

Untuk melakukan analisa kualitatif dengan liquid kromatografi dasarnya


adalah waktu retensi atau volum retensi suatu senyawa. Kemudian t atau V
senyawa dalam sampel dibandingkan dengan t atau V suatu senyawa standar yang
telah diketahui sebelumnya. Rasio waktu retensi dari dua komponen atau
selektifitas dapat dihitung dengan cara berikut:
Sementara untuk analisa kuantitatif ada beberapa metode yang perlu diketahui
diantaranya adalah sebagai berikut:

Metode pengukuran tinggi puncak.

Tinggi puncak suatu kromatogram akan sebanding dengan kadar senyawa yang
membentuk kromatogram tersebut. Pengukuran tinggi puncak didasarkan pada

rumus pengukuran tinggi suatu segitiga yaitu, suatu garis tegak lurus dari titik
tengah alas kromatogram sampai dengan perpotongan sisi segitiga kromatogram
tersebut.

Metode pengukuran luas puncak.

Dapat memberikan hasil yang lebih akurat jika dibandingkan dengan cara
pengukuran tinggi puncak. Luas puncak diukur seperti menghitung luas segitiga
yaitu, 1/2 x alas x tinggi. Rumus tersebut memberikan hasill yang baik jika
kromatogramnya berbentuk lancip. Cara lain untuk bentuk kromatogram yang lain
yaitu, tinggi x lebar pada 1/2 puncak.

Metode gunting dan timbang.

Kromatogram yang telah digambarkan pada kertas digunting sesuai bentuknya,


kemudian guntingan-guntingan ini ditimbang. Berat dari masing-masing
guntingan kromatogram ini akan sebanding dengan kadar senyawa yang
membentuk kromatogram tersebut.

Metode integrator.

Integrator emrupakan alat elektronik yang sering dijumpai pada peralatan


kromatografi modern. Alat ini akan mengubah tanda-tanda listrik dari detektor
menjadi suatu gambaran kromatogram sekaligus menghitung luas kromatogram
yang dibentuk secara elektronik.
Area di bawah puncak sebanding dengan jumlah zat x yang terdeteksi. Jika larutan
kurang pekat, area di bawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi
sama. Hal lain yang perlu diperhatikan adalah puncak. Area di bawah puncak Y
lebih kecil dibanding area di bawah puncak X dapat berarti: Y lebih sedikit dari X;
bisa juga erarti jumlahnya sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang
gelombang yang lebih sedikit dibanding X.
Copyright 2013 Materials Today | PSD Design by lollasta