BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Praktikum

Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal
tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, ini merupakan salah
satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen
seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen.
Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun
pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna
asam dan pewarna basa.
Bakteri yang memiliki ciri-ciri berantai karbon (C) yang panjangnya 8 95
mikrometer dan memiliki dinding sel yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan
asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel disebut
Basil Aahan Asam (BTA). Bakteri ini ada 41 spesies yang telah diakui oleh ICSB
(International Committe On Systematic Bacteriology) yang sebagian besar sudah
saprofit dan sebagian kecil lainnya patogen untuk manusia
diantaranya Mycobacterium tuberculosa, Mycobacterium leparae dan lain-lainya
yang dapat menyebabkan infeksi kronik. Golongan saprofit dikenal juga dengan nama
atipik.
Mikroorganisme di dunia ini ada yang menguntungkan dan ada juga yang
merugikan. Mikroorganisme yang menguntungkan dapat kita manfaatkan untuk
kepentingan kesejahteraan hidup manusia, akan tetapi, banyak juga mikroorganisme
yang tidak menguntungkan kita yaitu dengan menyebabkan terjadinya penyakit pada
tubuh manusia. Salah satu mikroorganisme yang dapat menyebabkan atau
menginfeksi manusia adalah Mycobacterium tuberculosis.Bakteri ini dapat
mengakibatkan penyakit tuberculosis pada manusia. Tuberculosis merupakan salah
satu penyakit yang mematikan dan berbahaya di dunia. Berdasarkan hal inilah yang
menjadi latar belakang dilaksanakannya percobaan ini untuk mengetahui teknik
pewarnaan Basil Tahan Asam (BTA) dan mengamati tingkat infeksi dari sputum
apakah terdapat Mycobacteriumatau tidak.
 1.2 Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dilaksanakannya praktikum pemeriksaan sputum ini adalah :

1. Untuk mengetahui teknik pewarnaan Basil Tahan Asam (BTA).
2. Untuk mengamati Mycobacterium (jika ada) dan mengetahui tingkat infeksi dari
sputum.

2. Alat dan Bahan

Jas Lab
handscoon

a. Pewarnaan gram
1. Objek glass 5. Tissue 9. Larutan huckers crystal violet
2. penjepit 6. Jarum ose 10. Larutan mordan lugol iodine
3. pipet tetes 7. Sediaan 11. Larutan sofranin
4. mikroskop 8. Imersi oil 12. air

b. Pewarnaan BTA metode Ziehl - neeisen

1. Ose 5. Objek glass 9. Air
2. Lampu spritus 6. Mikroskop 10. Carbon fuchsin 1%
3. Kertas tissue 7. Sediaan sputum 11. Asam alcohol 5%
4. Pipet tetes 8. Imersi oil 12. Methylen blue / Asam pikrat

1.3Cara Kerja Praktikum

a. Pewarnaan Gram

Adapun prosedur kerja yang di lakukan dalam praktikum ini yaitu :

1. Memakai masker dan handskun sebelum melakukan percobaan.
2. Mensterilkan tangan dan alat-alat yang akan digunakan, sebelum melakukan
percobaan dengan menggunakan alkohol 70%
3. Preparat di buat secara langsung dengan meletakkan sampel sputum di atas kaca
objek dengan menggunakan lidi (dalam keadaan aseptis).
4. Menunggu sampel sputum yang berada pada kaca objek sampai kering.
5. Sediaan yang sudah direkat diwarnai dengan Kristal ungu, diamkan selama 5
menit.
6. Zat warna dibuang dan ditetesi dengan larutan lugol, biarkan selama kurang lebih 1
menit.
7. Larutan lugol dibuang dan sediaan dicuci dengan air yang mengalir.
8. Lalu sediaan ditetesi alcohol sampai tidak ada zat yang mengalir lagi.
9. Sediaan dicuci dengan air mengalir
10. Sediaan ditetesi larutan sofranin ( air fukhsin ), diamkan selama 10 20 detik
12. Sediaan dicuci lalu dikeringkan.
13. Amati preparat yg telah kering di bawah mikroskop.

b. Pewarnaan BTA metode ziehl - neeisen

Adapun prosedur kerja yang di lakukan dalam praktikum ini yaitu :

1. Memakai masker dan handskun sebelum melakukan percobaan.
2. Mensterilkan tangan dan alat-alat yang akan digunakan, sebelum melakukan
percobaan dengan menggunakan alkohol
3. Preparat di buat secara langsung dengan meletakkan sampel sputum di atas kaca
objek dengan menggunakan lidi (dalam keadaan aseptis).
4. Menunggu sampel sputum yang berada pada kaca objek sampai kering.
5. Menetesi karbol fuchshin pada sampel yang sudah kering.
6. Memfiksasi sampel di atas api bunsen sampai adanya asap yang muncul.
7. Kemudian mencuci sampel dengan menggunakan aquades mengalir dan
menunggu sampai sampel kering kembali.
8. Meneteskan dengan alcohol asam, lalu mencuci menggunakan aquades
mengalir dan mengerinkannya.
9. Meneteskan cairan methylen blue pada sampel dan menunggu hingga 20-30 detik.
10. Membersihkan kembali sampel dengan menggunakan aquades mengalir, setelah
itu menunggu sampai sampel kering kembali.
11. Mengamati sampel dengan menggunakan mikroskop.
12. Mengambil gambar dari sampel yang terlihat melalui mikroskop.

BAB II
 PROSES PRAKTIKUM

1. Pemeriksaan sputum dengan pewarnaan Gram

Sediaan yang sudah direkat diwarnai dengan Kristal ungu, diamkan selama 5 menit
.
 Zat warna dibuang dan ditetesi dengan larutan lugol, biarkan selama kurang lebih 1
menit.
Larutan lugol dibuang dan sediaan dicuci dengan air yang mengalir.
 Lalu sediaan ditetesi alcohol sampai tidak ada zat yang mengalir lagi.
Sediaan dicuci dengan air mengalir
 Sediaan ditetesi larutan sofranin ( air fukhsin ), diamkan selama 10 20
detik

Sediaan dicuci lalu dikeringkan.

2. Pemeriksaan sputum pewarnaann BTA ziehl neelsen

 Menetesi karbol fuchshin pada sampel yang sudah kering.
Memfiksasi sampel di atas api bunsen sampai adanya asap yang muncul.
Kemudian mencuci sampel dengan menggunakan aquades mengalir dan
menunggu sampai sampel kering kembali.

Meneteskan dengan alcohol asam, lalu mencuci menggunakan aquades

mengalir dan mengerinkannya.
 Meneteskan cairan methylen blue pada sampel dan menunggu hingga 20-30
detik.
Membersihkan kembali sampel dengan menggunakan aquades mengalir,
setelah itu menunggu sampai sampel kering kembali.

Mengamati sampel dengan menggunakan mikroskop.

Mengambil gambar dari sampel yang terlihat melalui mikroskop.
 BAB III

HASIL PRATIKUM & PEMBAHASAN

1. Pembahasan Teknik Pemeriksaan Sputum

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum.

Bakteri yang berbentuk tongkat maupun coccus dibagi menjadi beberapa macam. Pada
bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil dan tripobasil. Pada coccus
dibagi menjadi Monococcus, Diplococcus dan Staphylococcus. Khusus pada spirilum
hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung (Dwidjoseputro, 1998).
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut
maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, ini merupakan salah satu cara
yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro, 1998).
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak
mengabsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna
digunakan untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna
mengabsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya
ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora
dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang
digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus, sedangkan
pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan
diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif.
Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan Ziehl Neelsen yang memilahkan bakteri
menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro, 1998).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun
1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram
positif dan bakteri gram negatif, yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat
tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya,
sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak
mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Waluyo, 2004).
Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan
bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay, 1994).
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel
bakteri, memperluas ukuran jasad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri dan
melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jasad
dapat diketahui (Hadiutomo, 1990).
 Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian
warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya
zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang
bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna
dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion
yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa
dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut
pewarna negatif (Hadiutomo, 1990).
Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat
warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan
memiliki muatan positif, sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan
memberikan zat warna mempunyai muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak
digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan di dinding sel, membran sel dan
sitoplasma. Sewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan
dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat
(Dwidjoseputro, 1998).
Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar
belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat
berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel. Terkadang zat warna
negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif, perlu diperhatikan
bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap struktur sel dapat berubah bergantung
pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan (Dwidjoseputro, 1998).
Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut
pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang
bermuatan positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif, sebaliknya pada
pewarnaan negatif latar belakang di sekeliling mikroorganisme diwarnai untuk
meningkatkan kontras dengan mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup
penyiapan mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas (Dwidjoseputro, 1998).
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan
ini kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak
sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering
kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila
suspensi tersebut berasal dari bukan media padat, sebaliknya pada suatu suspensi bakteri
bila terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada
preparatnya (Sutedjo, 1991).
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk
meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazimnya, prosedur
pewarnaan ini menggunakan zat warna basa seperti seperti crystal violet, methylen blue,
karbol fuchsin basa, safranin atau hijau malakit. Kadang kala digunakan zat warna negatif
untuk pewarnaan sederhana. Zat warna asam yang sering digunakan adalah nigrosin dan
merah kongo (Lay, 1994).
 Pewarnaan Ziehl Neelsen atau pewarnaan tahan asam memilahkan
kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini
disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama (karbol
fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol asam). Larutan asam terlihat
berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena larutan pemucat
(alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan karbol fuchsin dengan cepat, sehingga sel
bakteri tidak berwarna (Lay, 1994).
Basil tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal
sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus dengan
pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut Basil Tahan Asam (BTA) karena
dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat.
Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada manusia contohnya
adalah Mycobacterium tuberculosis. Bakteri Mycobacterium tuberculosis dapat diisolasi
dari sputum penderita TBC. Reaksi hasil pewarnaannya jika positif terdapat bakteri TBC
berwarna merah. Selain menyerang manusia juga menyerang hewan seperti marmut, dan
kera. Penularannya dapat melalui udara yang masuk ke saluran pernapasan (Pelczar,
1988).

2. Pembahasan hasil Praktikum

Pada percobaan ini bertujuan untuk mengetahui teknik pewarnaan Basil Tahan
Asam (BTA) dan mengamati tingkat infeksi dari sputum apakah
terdapat Mycobacterium atau tidak. Sampel yang di gunakan untuk menguji ada atau
tidaknya Mycobaterium yaitu sputum. Sputum adalah lendir dan materi lainnya yang
dibawa dari paru-paru, bronkus dan trakea yang mungkin dibatukkan dan dimuntahkan
atau ditelan. Uji Basil Tahan Asam (BTA) pada praktikum kali ini menggunakan prosedur
pewarnaan Ziehl Neelsen yaitu dengan memberi larutan pewarna karbol fuchsin, alkohol
asam dan methylen blue. Pewarnaan tahan asam dapat digunakan untuk membantu
menegakkan diagnosa tuberkulosis.

Pewarnaan tahan asam menggunakan larutan Ziehl-Neelsen A (karbol

fuchsin), Ziehl-Neelsen B (alkohol asam : HCL 3% dalam metanol 95%) danZiehl-
Neelsen C (methylen blue). Hasil pewarnaan maka basil tahan asam akan berwarna merah
dan basil tidak tahan asam akan berwarna biru. Basil tahan asam (BTA) merupakan
bakteri yang memiliki ciri-ciri yaitu berantai karbon (C) yang panjangnya 8-95
mikrometer dan memiliki dinding sel yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam
lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. Mycobacterium
tuberculose adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan penyakit tuberculosis dan
bersifat tahan asam sehingga digolongkan sebagai Basil Tahan Asam (BTA).

Sebelum semua prosedur kerja dilakukan terlebih dahulu harus memakai

masker dan handskun agar tidak terkontaminasi oleh sputum yang positif
 oleh Mycobacterium tuberculose, yang mana bakteri ini dapat terhirup ketika bernapas
dan tangan harus disterilkan menggunakan alkohol 70% yang disemprotkan ke seluruh
permukaan tangan.

Langkah selanjutnya preparat yang sudah di buat difiksasi, yaitu dengan

membersihkan kotoran dengan alkohol pada objek glass, fiksasi bertujuan untuk
mematikan bakteri tetapi tidak mengubah struktur sel bakteri, lalu sputum diletakkan di
atasnya dengan menggunakan lidi yang telah di sterilkan dengan alkohol setipis mungkin
kemudian dilakukan pengeringan.

Objek glass yang telah kering lalu di tetesi karbol fuchsin 0,3% yang
berfungsi mewarnai seluruh sel bakteri. Objek glass kemudian dipanaskan tetapi tidak
sampai mendidih, hanya sampai adanya asap dari sampel yang dipanaskan hal ini
dilakukan untuk membuka dinding sel dari bakteri sehingga karbol fuchsin dapat di serap
oleh bakteri yang menjadi pewarna bagi bakteri itu sendiri.

Langkah selanjutnya objek glass di cuci dengan menggunakan aquades

mengalir dan dikeringkan, Perlakuan pencucian dengan menggunakan aquades mengalir
bertujuan untuk menutup kembali lemak pada bakteri. Setelah kering objek glass di
teteskan dengan alkohol asam 3%, tujuan pemberian alkohol asam 3% adalah meluruhkan
warna dari karbol fuchsin, tetapi pada golongan BTA tidak terpengaruh pemberian
alkohol asam 3% karena memiliki lapisan lipid yang sangat tebal sehingga alkohol sukar
menembus dinding sel bakteri tersebut dan memberi warna merah akibat karbol fuchsin
tidak hilang, kemudian di cuci kembali menggunakan aquades mengalir dan dikeringkan.

Objek glass kemudian di teteskan methylen blue sampai menutupi semua

permukaan objek glass dan di diamkan selama 20-30 detik. Pemberian methylen blue
bertujuan untuk memberi warna background, kemudian di cuci kembali menggunakan
aquades mengalir dan dikeringkan.

Langkah selanjutnya yaitu mengamati objek glass dengan menggunkan

mikroskop dengan menggunakan pembesaran 100X10 untuk melihat apakah sampel yang
di amati mengandung bakteri Mycobacterium tuberculose atau tidak. Hasil
pewarnaan positif pada Mycobacterium tuberculose akanmenunjukkan warna merah
dan negatif akan berwarna biru.

Dari hasil pengamatan di peroleh bahwa pada sampel sputum, positif terdapat adanya
bakteri Mycobaterium tuberculose ini di tandai dengan adanya warna merah dengan
latar biru pada pengamatan melalui mikroskop.

Berdasarkan hasil percobaan diatas maka dapat dikatakan percobaan ini telah
berhasil. Di mana menurut Pelczar (1988), Basil Tahan Asam (BTA) merupakan
bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan
reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri
ini disebut basil tahan asam (BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama
 sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat
patogen pada manusia contohnya adalah Mycobacterium tuberculosis.
Bakteri Mycobacterium tuberculosis dapat diisolasi dari sputum penderita TBC.
Reaksi hasil pewarnaannya jika positif terdapat bakteri TBC berwarna merah.

BAB IV

KESIMPULAN

Adapun kesimpulan yang dapat diambil dari praktikum ini adalah :

1. Pewarnaan tahan asam adalah pewarnaan yang menggunakan larutan Ziehl-Neelsen A

(karbol fuchsin), Ziehl-Neelsen B (alkohol asam HCL 3% dalam metanol 95%)
dan Ziehl-Neelsen C (methylen blue). Hasil pewarnaan maka bakteri tahan asam akan
berwarna merah dan bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru. Pewarnaan tahan
asam dapat digunakan untuk membantu menegakkan diagnosa tuberkulosis.

2. Sampel sputum menunjukkan hasil positif karena ditemukannya bakteri

Mycobacterium tuberculose dalam sampel yang diamati.
 DAFTAR PUSTAKA

Brooks, 2008. Tuberkulosis Paru Resisten Ganda. Di kutip oleh Ayu Setiawati. 2010.
Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara. Medan.

Darmanto, 2010. Ilmu Penyakit Paru. Di kutip dari tulisan Rizqi Nugraheni
Putri. 2011. Trans Info Media. Jakarta.

Hadiutomo, 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Erlangga. Jakarta.

Kurniawati. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen, dan Fluorokrom
sebagai Metode Pewarnaan Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan Mikroskopis
Sputum. Di kutip dari tulisan Zita Marisa. Vol 9, juni 2005 : 29-33. Makara
Kesehatan.

Lay, 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta.

Sacher AR, Mc.Pherson AR, Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium.

Penerbit Buku Kedokteran EGC, Edisi 11,