LAPORAN PRAKTIKUM

KETERAMPILAN DASAR LABORATORIUM

ISOLASI DNA, DNA FINGERPRINTING DAN PCR

Pengajar
Dr. rer. Physiol. dr. Septelia Inawati Wanandi

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA
JAKARTA
2016
 ISOLASI DNA
Pendahuluan

Deoxyribosa nucleic acid (DNA) terdapat pada seluruh jaringan dan cairan
tubuh. Oleh karena itu DNA genom dapat diisolasi dari semua bahan biologis yang
mengandung sel berinti, seperti darah, semen, rambut, liur dan lain-lain. Bahan
yang paling sering digunakan untuk tujuan isolasi DNA adalah darah dan rambut,
karena kedua bahan tersebut relatif mudah diperoleh. DNA genom yang diisolasi
dapat digunakan untuk identifikasi DNA suatu organisme, baik dengan metode
Polymerase Chain Reaction (PCR) atau menggunakan enzim endonuklease restriksi
yaitu sidik DNA (DNA fingerprinting).1,5 Pada praktikum kali ini, yang akan dilakukan
adalah mengisolasi DNA dari darah vena dan DNA dari sel mukosa pipi.

Sebelum isolasi DNA, maka sampel harus dipersiapkan terlebih dulu. Sampel dapat
berupa jaringan, darah, sel kultur, bercak (misalnya sperma, darah) dan lain-lain.
Setiap bahan mempunyai karakteristik yang berbeda-beda yang memerlukan
penanganan yang berbeda pula. Dalam mengisolasi DNA terutama pada penyakit-
penyakit infeksi bakteri atau parasit dimana organisme terdapat dalam darah
penderita, maka sangat penting untuk menghindarkan kontaminasi dari DNA hospes.

Darah (whole blood) dan sumsum tulang mamalia mengandung baik sel berinti (sel
1,5
darah putih) maupun sel-sel tidak berinti (sel darah merah). Untuk mengisolasi
DNA dari darah, maka sel darah merah yang tidak mengandung DNA genom harus
dilisiskan agar dapat dipisahkan dari sel darah putih. Sel-sel darah putih yang sudah
dipisahkan kemudian dilisiskan dengan bantuan bahan - bahan pengawet DNA, yaitu
deterjen anionik yang dapat melarutkan komponen seluler. Bahan pengawet DNA
juga dapat mengurangi aktivitas DNase yang terdapat di dalam sel. Bila perlu,
dapat ditambahkan RNase untuk menyingkirkan kontaminasi RNA. Selanjutnya
dengan presipitasi garam DNA genom dipisahkan dari protein plasma dan inti.
Akhirnya, DNA genom diisolasi dengan presipitasi dengan alkohol dan pelarutan
kembali endapan yang terbentuk dengan larutan dapar yang mengandung suatu

1
bahan pengawet DNA. Hasil isolasi DNA dikatakan baik apabila didapatkan DNA yang
murni dan utuh.1,5

Tujuan

Tujuan utama isolasi DNA adalah untuk mendapatkan DNA dengan jumlah DNA
(g/mL) atau berat molekul (BM) yang tinggi tanpa protein serta penghambat
enzim restriksi lainnya sedangkan tujuan dari praktikum ini adalah untuk
mempelajari cara mengisolasi DNA dari darah vena dan DNA dari sel mukosa pipi.

Dasar

Ada 2 alasan utama isolasi DNA yaitu membuat gene bank dan analisis dari genom.
Berbagai prosedur dilakukan untuk mendapatkan genomic DNA, tapi secara
prinsipil sama yaitu dimulai dengan melisiskan sel, dilanjutkan dengan
deproteinisasi dan recovery (pemulihan) DNA.1 Perbedaan utama dari berbagai
prosedur itu hanyalah pada lama deproteinisasi dan berat molekul DNA yang
dihasilkan.
Prinsip isolasi DNA adalah
1. Melisiskan sel
Pada saat membran sel hancur dan sel mati, DNA-ase akan terlepas dan
menghancurkan DNA yang ada. Yang diperlukan pada saat lisis sel adalah
detergen misalnya SDS, Saponin,enzim proteolitik (Proteinase K).3,5
Lysis buffer terdiri dari :
EDTA2 Pada saat sel mati dan membran sel hancur, dilepaskan enzim
DNAase yang bekerja menghancurkan DNA. EDTA berfungsi mengikat ion
Ca dan Mg sehingga DNAase tak dapat bekerja lagi. Ion Mg diperlukan
untuk bekerjanya DNAase.
Tris Untuk menyamakan pH2
NaCl pekat Untuk menstabilkan DNA.
Pada praktikum ini memakai Nuclei Lysis Solution.

2
2. Memisahkan DNA dari protein
Untuk mendapatkan DNA dilakukan pemisahan DNA dari protein. Yang biasa
dilakukan adalah dengan menggunakan larutan fenol. 4 Cara ini merupakan
cara paling umum untuk deproteinisasi larutan DNA. Pada ekstraksi dengan
fenol kloroform, maka protein akan ditarik oleh fenol sehingga berada di
fase organik yaitu fenol / kloroform sedang DNA yang bermuatan negatif
berada di fase air, lapisan paling atas. Fenol merupakan bahan yang
berbahaya karena sifat oksidatifnya. Produk oksidatif ini dapat merusak
asam nukleat. Karenanya fenol yang digunakan harus diekuilibrasi. Fenol
juga berfungsi mendenaturasi protein dengan efisien dan juga mungkin
melarutkan protein yang terdenaturasi. Sedangkan fungsi kloroform adalah
mendenaturasi protein dan menstabilkan batas lapisan fenol dan fase air
DNA.4 Biasanya fase ini dilakukan 2 - 3 kali untuk mendapatkan DNA yang
murni, sampai tidak lagi didapatkan presipitasi protein. Karena proses diatas
yang memakan waktu, maka digunakan cara lain untuk memisahkan DNA dari
protein yaitu dengan cara mengendapkan protein dengan menambahkan
larutan pengendap protein, maka endapan protein akan membentuk butiran
coklat tua yang padat. Pada Praktikum ini memakai larutan pengendap
protein precipitation solution.
3. Mengendapkan DNA
Tujuan untuk memadatkan DNA yaitu dengan cara membuang oligonukleotida
rantai tunggal atau ganda yang <30bp dan membuang DNA yang tidak
terlabel pada proses penandaan DNA. Untuk itu dapat dilakukan dengan
penambahan etanol absolut atau isopropanol.2 Isopropanol kurang volatil dan
lebih lama menguap dibanding etanol. Selanjutnya sisa alkohol absolut atau
isopropanol dan garam-garam serta molekul organik yang kecil dibuang
dengan menambahkan etanol 70%.
4. Melarutkan kembali DNA
Hasil yang didapat adalah endapan putih panjang seperti benang dengan
melarutkan dalam larutan DNA rehydration sol. Kemudian dipanaskan pada
suhu 65C selama 1 jam dan disimpan dalam freezer 2-8C. 1,5
5. Menghitung jumlah DNA yang diperoleh

3
 Perhitungan DNA dapat dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer
pada OD 260nm.1 Konsentrasi dapat dihitung dengan menggunakan rumus
yaitu:
Konsentrasi DNA (mg/mL) = (A 260 X 50 mg/mL) x pengenceran, atau
Jumlah DNA yang diisolasi (g) = Konsentrasi DNA (g/mL) x Vol larutan
penghidrasi DNA yang ditambahkan (L).
Pada A260 = 1, konsentrasi DNA adalah 50mg/mL.
6. Menilai kemurnian DNA.
Kemurnian DNA dapat dilakukan dengan membandingkan nilai absorbansi
pada OD 260nm dan OD 280nm. 1 Untuk mengetahui indeks purifikasi yang
baik adalah bila OD260/OD280 > 1,7 2,0. Jika indeks kemurnian dibawah 1,7
yang harus dilakukan adalah bahan / sampel tersebut harus diekstraksi
ulang. Satu mg/mL DNA adalah konsentrasi yang baik untuk melakukan
pekerjaan. DNA itu harus minimal 100 kb panjangnya dan harus dapat
dicerna oleh enzim restriksi.

Alat dan Bahan

Alat Spektrofotometer + kuvet

Tabung mikrosentrifugasi steril
ukuran 1,5 ml
Pipet Eppendorf + tip
Pipet Pasteur
Alat sentrifugasi mikro
Vorteks
Rak tabung mikro
Penangas air, 37C
Penangas air, 65C (dipakai
untuk rehidrasi DNA secara
cepat)

4
Bahan Protein Precipitation solution
Sampel darah (300 L) Isopropanol, suhu kamar
Cell Lysis solution Etanol 70 %, suhu kamar
Nuclei lysis Solution DNA Rehydration Solution
RNase solution

Cara Kerja
A. Isolasi DNA dari darah vena
Lisis Sel
1. Sampel darah 300L ditambahkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 cc yang
berisi 900L lautan pelisis Sel darah merah.
2. Dibalik-balikan tabung tersebut sebanyak 6 kali supaya sampel bercampur
3. Sampel diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Selama 20 detik
disentrifugasi pada 13 000 - 16 000 x g
4. Supernatan dibuang dengan pipet sehingga tersisa butiran endapan sel
darah putih yang dapat terlihat dan ditinggalkan 10 - 20 L sisa cairan.
5. Untuk mengapungkan kembali sel darah putih maka divorteks dengan kuat
selam 15 detik.
6. Larutan pelisis sel 300L ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sel
darah putih tersebut.
7. Untuk melisiskan sel dipipetkan turun naik 6 kali, karena tidak ada
gumpalan setelah proses pencampuran maka inkubasi pada suhu 37C atau
pada suhu ruang sehingga larutan homogen.
Perlakuan dengan RNase
8. Larutan RNase A 1,5 L ditambahkan ke dalam lisat sel.
9. Sampel dicampur dengan cara membalik-balikan tabung 5 kali dan
diinkubasi pada waterbath 37C selama 15 menit
Pengendapan protein
10.Sampel didinginkan pada suhu ruang

5
 11.Larutan pengendap protein 100L ditambahkan ke dalam lisat sel dan
divorteks kuat selama 20 detik supaya bercampur secara menyeluruh.
12.Selama 3 menit disentrifugasi pada 16 000 g, dan endapan protein akan
membentuk butiran coklat tua yang padat.
Pengendapan DNA
13.Supernatan yang mengandung DNA dituangkan dengan hati-hati ke dalam
tabung eppendorf 1,5 cc bersih yang di dalamnya sudah berisi 300L
isopropanol 100%. Tabung eppendorf yang mengandung butiran endapan
protein dibuang.
14.Sampel dicampur dengan cara membalik-balikkan tabung sebanyak 50 kali
secara perlahan-lahan sehingga benang-benang putih DNA membentuk
gumpalan yang dapat terlihat.
15.Selama 3 menit disentrifugasi pada 16 000 g, dan DNA akan tampak sebagai
butiran putih kecil.
16.Supernatan dibuang dan dikeringkan.
17.Larutan etanol 70% sebanyak 300L ditambahkan ke dalam eppendorf 1,5
cc tersebut dan dibalik-balikan beberapa kali untuk mencuci butiran DNA.
18.Selama 3 menit disentrifugasi pada 16 000 g, dan etanol 70% tersebut
dituang dengan hati-hati tanpa mengeluarkan butiran DNA.
19.Tabung dikeringkan, lalu sampel dibiarkan mengering pada udara kering
selama 15 menit.
Hidrasi DNA
20.Sebanyak 30L larutan penghidrasi DNA ditambahkan ke butiran DNA yang
di dalam tabung eppendorf dan tabung tersebut diinkubasi swlama 1 jam
pada suhu 65C.
21.DNA disimpan pada suhu 2 - 8C
Penghitungan Jumlah DNA dari darah vena
Kuvet diisi dengan 1mL akuades
Dimasukkan 1L DNA dari darah vena, ke dalam kuvet. Dan dikocok perlahan-
lahan
Diukur serapan DNA pada panjang gelombang 260 nm

1
Penghitungan Jumlah DNA dari sel mukosa pipi
Kuvet diisi dengan 1mL akuades
Dimasukkan 5L DNA dari sel mukosa pipi ke dalam kuvet. Dan dikocok
perlahan-lahan
Diukur serapan DNA pada panjang gelombang 260 nm
Menentukan kemurnian DNA
Diukur serapan protein pada panjang gelombang 280 nm
Kemurnian DNA ditentukan dengan indeks kemurnian.

V. Hasil dan Pembahasan

Berdasarkan prinsip irradiasi sinar ultraviolet pada spektrofotometer dengan
panjang gelombang 260 nm yang diserap secara maksimal oleh DNA dan dengan
panjang gelombang 280 nm yang diserap secara maksimal oleh protein maka jumlah
DNA dapat diukur.1,3,5 Apabila kepadatan optik ( optical density ) pada panjang
gelombang 260 nm sama dengan satu maka konsentrasi DNA adalah 50 g/ml
(untuk DNA heliks ganda) atau setara 40 g/ml (untuk RNA atau DNA tunggal) atau
setara 20 g/ml (untuk nukleotida untai tunggal).
Rumus:

Konsentrasi DNA ( g /mL) = (A 260 X 50 g/mL) x pengenceran

Tabel 5.1. Jumlah Konsentrasi DNA Dari Darah dan Sel Mukosa Pipi

Sampel DNA pada A 260 nm A 280 nm Pengenceran Kemurnian Konsentrasi DNA

(g/mL)
Darah vena 0,047 0,027 200 1,741 470
Sel mukosa pipi 0,007 0,005 400 1,4 140

Rumus:
Jumlah DNA yang diisolasi = konsentrasi DNA x Vol larutan penghidrasi
( g/mL) DNA yang ditambahkan( g)

Tabel 5. 2. Jumlah DNA yang diisolasi dari Darah dan Sel Mukosa Pipi
Sampel DNA pada Vol larutan penghidrasi Konsentrasi Jumlah

2
 DNA (L) DNA (g/L) DNA (g)
Darah vena 30 470 x 10-3 14,1
Sel mukosa pipi 20 140 x 10-3 2,8

Untuk mengetahui tingkat kemurnian DNA yang diperoleh dapat ditentukan dengan
cara menghitung perbandingan antara nilai OD 260 dan OD280 pada sampel DNA yang
diukur melalui spektrofotometer. DNA dikatakan murni jika perbandingan antara
kedua nilai tersebut adalah 1,7.
Rumus:
Indeks kemurnian = A260/280
Tabel 5.3. Indeks Kemurnian DNA Pada Darah dan Sel Mukosa Pipi

Sampel DNA A 260 nm A 280 nm Indeks

Kemurnian
Darah 0,047 0,027 1,74
Sel mucosa pipi 0,007 0,005 1,4

Dari hasil percobaan di atas terlihat bahwa DNA pada sel mukosa pipi dapat
dinyatakan tidak murni karena memiliki indeks kemurnian DNA < 1,7. Hal ini
mungkin disebabkan oleh adanya kontaminan protein pada DNA yang diisolasi.
Kontaminan protein dapat terjadi pada saat dilakukan pengendapan protein oleh
protein precipitation solution yang berlangsung kurang sempurna.

VI. Kesimpulan
Isolasi DNA dilakukan melalui proses melisiskan sel, pemisahan protein dan RNA dan
pemurnian DNA. Hasil isolasi DNA dikatakan baik apabila didapatkan DNA yang
murni dan utuh. Dari percobaan ini didapatkan bahwa DNA pada sel mukosa pipi
tidak murni. Cara pengambilan sampel, perlakuan terhadap sampel selama
penyimpanan atau selama melakukan percobaan bisa menyebabkan hasil isolasi
DNA tidak murni.

3
Isolasi DNA yang dilakukan tidak dapat dikatakan berhasil karena tidak didapatkan
DNA murni sehingga jumlah DNA (g/mL) atau berat molekul (BM) yang diperoleh
juga sedikit.

Daftar Pustaka

1. Maftuchah MP, Winaya A, Zainudin A. Isolasi DNA. Ikhwan A, editor. Dalam : Teknik
Dasar Analisis Biologi Molekuler. Jakarta: Deepublish; 2014.p.56-66.

2. Suguna S, et al. Genomic DNA Isolation from human whole bloods samples by non
enzymatic salting out method. International Journal of Pharmacy and
Pharmaceutical Sciences, 2014: 198-9.

3. Technical Manual : Wizard Genomic DNA Purification Kit. Promega. USA.

4. Zumbo P. Phenol-chloroform extraction. Weil Cornell Medical College Laboratory of

Christopher E Mason, Department of Physiologu and Biophysics.p 1-7.

5. Cortes DC, Griffiths LR. Methods for extracting genomic DNA from whole blood
samples : current perpectives. Dove Press; 2014,p 1-9.