Nombres: Christian Quijia , Alexis Vela, David Zapata Materia: Enzimologa

Practica N: 1 Fecha: 31 03 2012 Seccin: 004 NRC:

1. -------------------------------------------------
TEMA: Determinacin de protena por el mtodo de Kjeldahl
2. OBJETIVOS:
* General:
Determinacin de protena por el mtodo de Kjeldahl
* Especfico:
Aprender y desarrollar el protocolo de obtencin de protena en procesos qumicos
Determinar la concentracin de nitrgeno presente en la muestra para luego ser
transformado a travs de un factor en protena.
3. INTRODUCCIN

El mtodo de Kjeldahl es un proceso de anlisis qumico para determinar el contenido en

nitrgeno de una sustancia qumica. A partir de compuestos que contengan protenas en los
alimentos, El resultado del anlisis es una aproximacin del contenido de protena cruda
Es catalogado como un mtodo de oxidacin humeda, porque busca la ruotura y posterior
oxidacin de los fragmentos a la forma ionica (NH4+) de todas las molculas complejas de
nitrgenos presentes en una muestra ( protena, acidos nucleicos , humus , aminas ,
aminocidos , etc) en una solucin liquida . el nitrgeno ligado orgnico se expresa como
nitrgeno total calculado como protena o como protena total
El mtodo se basa en la destruccin de la materia orgnica por un tratamiento oxidativo
con cido sulfrico concentrado, en presencia de una mezcla catalizadora (las sales/xidos
metlicos sirven
para el transporte de oxgeno con formacin intermedia de oxgeno naciente; en donde se
aplica una temperaturas de 300-400C durante la digestin formndose sulfato de amonio
que en exceso de hidrxido de sodio libera amonaco, el que se destila recibindolo en
acido sulfrico donde se forma sulfato de amonio y el exceso de cido es valorado con
hidrxido de sodio en presencia de rojo de metilo ; El contenido en protena de la muestra
se calcula teniendo en cuenta el contenido medio en nitrgeno de la protena en cuestin.

4. MATERIALES Y MTODOS:
*
* Frascos Kjeldahl,
* Pipeta graduada de 5ml,
* Erlenmeyer de 150 y 500 ml,

* Balanza,
* bureta de 50ml.

REACTIVOS:
* Acido Sulfrica concentrado y disolucin 0,1N
* Hidrxido de sodio disolucin al 40% y 0,1 N
* Perxido de hidrogeno
 * Indicador rojo de metilo.

Procedimiento:
PRIMERA ETAPA;
En el Frascos Kjeldahl poner 300 mg de tejido, hacer bajar al fondo y aadir 3ml. De acido
sulfrico y poner a calentar, cuando la mezcla adquiera una coloracin parda y
desaparezcan los trocitos de tejidos, dejar enfriar y aadir 12 gotas de perhidrol, agitar y
poner nuevamente a calentar, aadir el perhidrol hasta obtener un lquido mineralizado
transparente
SEGUNDA ETAPA:
El liquido del frasco de frasco de digestin se diluye con agua destilada hasta mitad matraz
echar ncleos de ebullicin, aadir 4 gotas de indicador rojo de metilo: aadir solucin de
Hidrxido de sodio concentrado
hasta que el liquido adquiera una coloracin amarilla y empezar la destilacin, el
amoniaco se recoge en un matraz que contiene 25 mi de acido sulfrico 0,1 N con 3 gotas
de indicador rojo de metilo.
TERCERA ETAPA:
En la bureta se vierte disolucin de hidrxido de sodio 0,1 N y se valora

5. RESULTADOS:

REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MTODO DE KJELDAHL

DIGESTIN

(1) n - C -NH2 + mH2SO4 catalizadores CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2

protena calor

NEUTRALIZACIN Y DESTILACIN

(2) (NH2)SO4 + 2 NaOH 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O

(3) NH3 + H2SO4 (cido sulfurico) NH4 + HSO3- (in sulfato)

TITULACIN

El anin sulfato (proporcional a la cantidad de nitrgeno) es titulado con Na(OH)

estandarizado:

(4) HSO3- + H+ H2SO4

Clculos
Moles de HCl = Moles de NH3 = Moles de N en la muestra

% N = 14*N*V*100/ m*1000

% Protena = 14*N*V*100*fator/m*1000

en donde:

V: 25 mL H2SO4 0,1N- gasto de NaOH 0,1 N

M: massa de la muestra , 300 en gramos
Factor 6,25 para carne

%N= 14 *0,1 N*(25-17)ml *100/300*1000= 0,0037

% Protena =14 *0,1*(25-17)*100*6,25/300 *1000=0,0233

6. ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS

Segn bibliografa en el porcentaje, no debe exceder 0.06 % de
Nitrgeno o 0.38 % de protena en la cual si esta entre estos limites como es el % N=
0,0037 y %Protena con 0,023
7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:

Conclusiones:

Recomendaciones:
* Durante el proceso de digestin ocurre una perdida de nitrgeno en la cual es causado
por exceso de sulfato de sodio que se aade al cido para elevar el punto de ebullicin, en
la cual puede producir una descomposicin por calor y por lo tanto prdida de nitrgeno.
* Durante la destilacin puede haber prdida de amonaco por fugas en el circuito de
destilacin. o por perdida de amoniaco por refrigeracin insuficiente en el condensador

8. BIBLIOGRAFA:
Internet:

* Volumetria de neutralizacion mtodo de Kjeldahl ; [en lnea], disponible en <

http://webdelprofesor.ula.ve/ingenieria/lauraitm/guiaLQA/Practica_5.pdf> [Consulta: 31 de
marzo del 2012]
* Determinacin de Protena- mtodo de Kjeldahl [en lnea], disponible en :
<http://www.ispch.cl/lab_amb/met_analitico/doc/ambiente%20pdf/Proteina.pdf f>
[Consulta: 31 de marzo del 2012]
* Determinacin de Protena- mtodo de Kjeldahl, [en lnea], disponible en: <
http://www.grupo-selecta.com/notasdeaplicaciones/analisis-alimentarios-y-de-aguas-
nutritional-and-water-analysis/determinacion-de-proteinas-por-el-metodo-de-kjeldahl-
kjeldahl-method-for-protein-determination/ >[ Consulta: 31 de marzo del 201
DETERMINACION DEL CONTENIDO DE NITROGENO POR EL METODO DE
MICROKJELDAHL

Angulo Oscar Andrs (0843819); Cifuentes Leidy Diana (0839166); Dvalos Magaly
(0842610).

Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Departamento de Qumica, Tecnologa Qumica

Nocturno, Universidad del Valle, Cali, Colombia.
Octubre 17 de 2009.

RESUMEN.

Se realizo experimentalmente la determinacin del contenido de nitrgeno en una muestra

de cereal (avena) utilizando el mtodo Kjendahl. El anlisis consiste en destruir la materia
orgnica de la muestra (0,0346 g) en acido sulfrico concentrado por medio de digestin
con algunos catalizadores y calor formando sulfato de amonio, al cual se le aadi
hidrxido de sodio para liberar el ion amonio en forma de amoniaco por medio de la
destilacin para luego ser atrapado en una solucin de acido brico formando borato de
amonio, dicha solucin fue valorada con HCl 0,025M. Los resultados obtenidos fueron un
porcentaje de nitrgeno del 6,4% y de protena del 36,5%.

Palabras claves: kjeldahl, protena, nitrgeno.

DATOS, CALCULOS Y RESULTADOS.

Tabla 1. Estandarizacin de la solucin 0,02 M de HCl.

|ESTANDARIZACION HCl |
|PESO Na2CO3 |0,0104 g |
|VOLUMEN HCl |7,9 mL |

0,0104 g Na2CO3 x 1 mol Na2CO3 x

106 g Na2CO3

2 mol HCl x 1 = 0,025 M

1 mol Na2CO3 0,0079 L

Tabla 2. Titulacin del H2BO3 formado durante la destilacin del amoniaco.

|VALORACION H2BO3
|
|PESO MUESTRA |0,0346 g |
|VOLUMEN HCl |6,3 mL |

Porcentaje de Nitrgeno:

6,3 mL x 0,025 mol HCl x 1 mol N x

 1000 mL 1 mol HCl

14,007 g N x 100 = 6,4%

1 mol N 0,0346 g

Porcentaje de Protena:

% Protena = % N x Factor
6,4 x 5,7 = 36%

Tabla 3. Porcentajes de nitrgeno encontrados en la muestra por cada grupo y su respectiva

conversin a porcentaje de protena.

|GRUPO |% NITROGENO |% PROTEINA |

|1 |6,4 |36 |
|2 |7,5 |43 |
|3 |6,8 |35 |
|4 |1,9 |11 |
|5 |2,2 |12 |
|6 |6,4 |37 |

Valores Reales:

Tamao de porcin: 22 g.
Cantidad de protena por porcin: 3 g.

Gramos de protena en la muestra:

0,0346 g x 3 g protena = 4,72 x 10-3

22 g

Porcentaje real de protena en la muestra:

4,72 x 10-3 g protena x 100 = 13,6%

0,0346 g muestra

Porcentaje real de nitrgeno en la muestra:

13,6% = 2,4%
5,7

Porcentaje de error (protena):

| 13,6 36 | x 100 = 165%

13,6

Porcentaje de error (nitrgeno):

| 2,4 6,4 | x 100 = 167%
2,4

Pruebas Estadsticas

Tabla 4. Media y desviacin estndar de los datos obtenidos experimentalmente por todos
los grupos.

| |% NITROGENO |% PROTEINA |
|MEDIA |5,2 |29 |
|DESVIACION ESTANDAR |2,5 |14 |

Intervalo de confianza:
29 [2,57 x 14 / 6] = 29 15

Prueba de significancia:

Hiptesis nula: El valor de la media experimental es estadsticamente igual al valor real.

Hiptesis alterna: El valor de la media experimental es estadsticamente diferente al valor

real.

Valor real: 13,6

Prueba estadstica t.

tcalc = |29-13,6| x 6 / 14 = 2,69

tcrit = 2,57
tcalc >tcrit

Conclusin: Se rechaza la hiptesis nula y se acepta a hiptesis alterna. El valor de la media

experimental no es estadsticamente igual al valor real. Por lo tanto, hay error
sistemtico.

ANALISIS Y DISCUSION DE LOS RESULTADOS.

El mtodo kjeldahl es usado ampliamente para cuantificar el contenido de protena en los

alimentos mediante la determinacin de nitrgeno de los aminocidos contenidos en esta, a
diferencia de otros componentes mayoritarios como las grasas y los carbohidratos que no
contienen nitrgeno. [1] Sin embargo el tratamiento kjeldahl no solo determina los
aminocidos libres sino tambin cidos nucleicos y sales de amonio, adems del nitrgeno
ligado de compuestos aromticos como pirazina, ciclopentapirazina, pirrol y oxazol, as
como el nitrgeno orgnico ligado de
las vitaminas, tales como la B1 (tiamina), la B2 (riboflavina) y la nicotinamida, aadiendo a
la determinacin nitrgeno
que no proviene de la protena. [2].
La presencia de nitratos o nitritos puede ser fuente de errores tanto positivos como
negativos. Los nitratos o nitritos provenientes de diversos aditivos y carentes de valor
nutricional pueden reducirse en las condiciones del anlisis del amonio, originndose
resultados errneamente altos. Si se sospecha que la concentracin de nitratos o nitritos de
la muestra puede causar desviaciones inaceptables o bien prdida de precisin, debe
procederse a la reduccin separada a amonio previamente al proceso de mineralizacin. Se
recomienda realizar una determinacin previa de nitritos o nitratos para asegurarse de que
no se van a producir interferencias. [3][4]
El mtodo kjeldahl se lleva a cabo en tres etapas, digestin, destilacin y valoracin.
Durante la digestin la protena es oxidada con acido sulfrico concentrado y calor,
adems se utilizan catalizadores (CuSO4 + MgO) para incrementar la velocidad de ruptura
de los enlaces moleculares y una sal neutra (sulfato de potasio) para elevar el punto de
ebullicin de la solucin de acido sulfrico y as aumentar la temperatura para llevar a cabo
la descomposicin de la materia orgnica. Esta es la etapa crtica del proceso, los gases del
acido sulfrico que se forman a una temperatura de 338C se disocian en forma de SO3 y
H2O. El SO3 se descompone en SO2 y oxgeno, el oxgeno reacciona con el carbono y el
hidrgeno presentes en la muestra para convertirlos en CO2 y H2O. Los grupos amino y
amida se convierten cuantitativamente
a in amonio. [5] La reaccin general que se lleva a cabo en esta etapa es:
n-C-NH2 + mH2SO4 catalizadores (NH4)2SO4
+ CO2 + SO2
El control de la temperatura es muy importante, ya que una temperatura inferior a la citada
provoca una digestin incompleta mientras que una temperatura mayor provocar prdida
de compuestos nitrogenados en la corriente de gases que salen de los tubos; en ambos
casos, los resultados finales darn un porcentaje de protenas inferior al real. [2]
En la etapa de destilacin el sulfato de amonio formado en la digestin se diluye con agua
destilada y se le aade una solucin de hidrxido de sodio concentrado para darle la
basicidad necesaria para liberar el ion amonio presente convirtindolo en amonaco, el que
deber recogerse por burbujeo del vapor de arrastre en una solucin de cido brico
originando amonio y boratos: [6]
H3BO3 + NH3 NH4 + H2BO3
Durante esta etapa se pueden presentar dos fuentes de error, la prdida de amoniaco durante
la destilacin y atrapamiento o la contaminacin del acido brico por arrastre de gotas de la
base fuerte (NaOH) por la corriente de vapor.
La ltima etapa del mtodo kjeldahl es la valoracin con HCl del ion dihidrogenoborato
producido en la destilacin el cual es una base relativamente fuerte que reacciona con los
protones del acido clorhdrico con el fin de regresar la base conjugada a H3BO3 y as
obtener la relacin estequiometria 1:1:1 entre el NH4+, H2BO3- y el agente titulante HCl.
H2BO3 + H H3BO3
Para
efectuar la titulacin, an cuando existe la posibilidad de la valoracin visual mediante el
uso de indicadores cido/base y la normativa no establece la obligacin de su uso, es muy
recomendable la valoracin potenciomtrica. Entre las ventajas de la valoracin
potenciomtrica, la deteccin del punto final es muy precisa, permitiendo independizarse de
la estimacin visual, disminuyendo la dispersin de los resultados.
Al tener en el inicio de la valoracin slo una disolucin de cido brico en agua, su pH
esta alrededor de 4,65. Una vez finalizada la etapa de la destilacin, el amonaco
solubilizado provoca que el pH sea mayor, por lo que se valora dosificando un cido de
concentracin conocida, hasta alcanzar nuevamente el valor inicial de pH. [2]
Los resultados experimentales tienen un enorme % de error: 167 para el nitrgeno y 165
para la protena, donde es evidente la suma de muchos errores sistemticos durante las
diferentes etapas del anlisis, posiblemente debidos a:
Falta de calibracin de la balanza analtica, arrojando un dato errado del peso inicial de
muestra adems de que el tamao de esta era muy pequeo en comparacin con el
porcentaje real.
La presencia de nitratos y/o nitritos u otras sales de amonio que carecen de valor nutricional
pero que podran estar presentes en la muestra aumentando el contenido de nitrgeno bruto.
Arrastre de hidrxido de sodio por la corriente de vapor contaminando el acido brico
aadindole base extra fuera de la aportada por el amoniaco. Adems durante
el proceso de destilacin se observo ebullicin con pequeas explosiones, lo que pudo
ocasionar el arrastre de la base hacia el acido.
La contaminacin de la solucin titulante (HCl) disminuyendo su molaridad y aumentando
el volumen requerido para la neutralizacin del H2BO3.
Una incorrecta determinacin del blanco, la cual no arrojo ningn valor.
Una mala percepcin del viraje de neutralizacin durante la valoracin con HCl, aadiendo
ms volumen que el requerido.
Uso de un indicador que no virara cerca del punto de equivalencia ocasionando un consumo
mayor de acido en la valoracin.
SOLUCION A LAS PREGUNTAS.
1. Explique claramente porque la titulacin final debe realizarse con HCl y no con NaOH.
Despus de que todo el amoniaco (base dbil) es destilado reacciona con el cido brico
(acido dbil) de la siguiente manera:
NH3 + H3BO3 NH4+ + H2BO3-
El ion dihidrgenoborato formado es una base considerablemente fuerte, haciendo la
solucin alcalina, por ello la titulacin final debe realizarse con HCl y no con NaOH.
2. Si el amoniaco proveniente de 1.50 g de una muestra que contiene 8.5 % p/p de N, se
recibe en HCl 0.1 M, cual debe ser el mnimo volumen del cido a utilizarse para que el
anlisis sea vlido?
Hay que tener en cuenta que el amoniaco debe ser atrapado sobre un exceso de la solucin
de cido clorhdrico, ya que la titulacin final neutralizara el exceso de acido fuerte que no
reacciono con el amoniaco utilizando como titulante una base fuerte.
Volumen mnimo de HCl:

1.50g muestra
x 8.5g N x 1 mol N
100g muestra 14.007g

x 1mol NH3 x 1mol HCl x 1000mL HCl =

1mol N 1mol NH3 0,1mol HCl

91 mL HCl
3. Como se utiliza el destilador Kjeldahl?
El matraz de digestin kjeldahl el cual contiene la muestra, acido sulfrico, catalizadores y
una sal neutra, es conectado a la trampa de absorcin que contiene aproximadamente 250
mL de hidrxido de sodio al 15%, el disco poroso de la trampa convierte los humos en finas
burbujas para facilitar la absorcin, el SO2 formado durante la digestin es convertido a
sulfito sdico.
El matraz es conectado al equipo de destilacin y se le agrega lentamente NaOH (50%) por
el embudo y se cierra la llave. Iniciar la destilacin atrapando el amoniaco formado en: a.
Una solucin de acido sulfrico 0,1M en exceso para que se pueda realizar la titulacin por
retroceso neutralizando con NaOH 0,1M el exceso de acido.
b. Una solucin de acido brico aproximadamente al 4% y titulando con HCl 0,1M el ion
dihidrogenoborato formado en la reaccin del amoniaco con el acido dbil. [7]

CONCLUSIONES.
1. El mtodo de Kjeldahl se basa en el rompimiento de la materia orgnica utilizando cido
sulfrico concentrado, el cual forma sulfato de amonio que en exceso de hidrxido de sodio
libera amoniaco que es destilado y recibido en cido brico.
2. Para mejorar la cintica del proceso de oxidacin, se aade una sal neutra para aumentar
el punto de ebullicin del acido sulfrico y con ello la temperatura en
la que se desarrolla la oxidacin.
3. Es necesario dar la basicidad necesaria para la liberacin del amoniaco cuando la
digestin se ha completado.
4. El mtodo kjeldahl es una aplicacin bsica de las titulaciones de neutralizacin, donde
el nitrgeno es transformado mediante un tratamiento adecuado en una base y
posteriormente titulado con un patrn acido o bsico fuerte.
5. El contenido de nitrgeno kjeldahl es la suma del nitrgeno amoniacal y el nitrgeno
orgnico, tambin llamado nitrgeno bruto.
BIBLIOGRAFIA.

[1] http://es.wikipedia.org/wiki/M%C3%A9todo_Kjeldahl. Consultado el 5 de octubre de

2009.

[2] http://es.answers.yahoo.com/question/index?qid=20070821132254AAF0CmG
Consultado el 5 de octubre de 2009.

[3] http://es.wikipedia.org/wiki/Nitr%C3%B3geno_total_Kjeldahl. Consultado el 11 de

octubre de 2009.

[4] www.ual.es/~jfernand/ATA/Tema1/Tema1-Introduccion.pdf . Consultado el 11 de

octubre de 2009.
[5] SKOOG DOUGLAS A. Fundamentos de qumica analtica. Mxico; International
Thomson Editores S.A; 2005; 351p, 352p, 353p.

[6] http://books.google.com/books?
id=YdtzV12beGMC&pg=PA69&lpg=PA69&dq=metodo+kjeldahl+nitrogeno&source=bl&
ots=v02ErDduql&sig=TxUlY8pQ3DFpR4rLGcKwFW-
m8vE&hl=es&ei=i5jSStMjjbKUB5vx2KgK&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=5
&ved=0CBEQ6AEwBDgK#v=onepage&q=&f=false Consultado el 11 de octubre de 2009.

[7] http://www.inboxsa.com/Comparaci%F3n%20entre%20los%20m%E9todos
%20Kjeldahl%20y%20Dumas%20para%20el%20an%E1lisis%20de%20Prote%EDna.pdf