Los inhibidores selectivos de la dihidrofolato reductasa

Conferencia Nobel, 8 de diciembre de 1988, por

George H. Hitchings, JR.

Presidente del Fondo Burroughs Wellcome, Research Triangle Park, Carolina del Norte, EE.UU.

Mi inters en los cidos nucleicos, sus constituyentes y el metabolismo se remonta al descubrimiento de

adenosi trifosfato ne en el msculo por Fiske y Subbarow (1).Yo haba entrado en la Universidad de
Harvard como candidato a un doctorado grado en 1928 y trasladado a la Escuela de Medicina de Harvard
en 1929. Otto Folin, entonces jefe del Departamento de Qumica Biolgica, designado mi ao predoctoral
primero que se pas con Ciro J. Fiske, a continuacin, participar en los descubrimientos trascendentales de
la fosfocreatina y las libras de fsforo com lbiles de los msculos y otros tejidos.Yo estaba inmerso en
breve en el descubrimiento de las herramientas analticas con las que fo siga al metabolismo de la
adenosina trifosfato (2).
Otras lneas de pensamiento que se unieron con este inters cuando me un a Bur roughs Wellcome Co.
en 1942 como el nico miembro del Departamento de Bioqumica.Mientras tanto, el principio
antimetabolito haba sido Expresse d por Woods (3) y Fildes (4).Vi la oportunidad de explorar la biosntesis
de cidos nucleicos en una forma nueva y reveladora empleando anlogos sintticos de las bases de
purina y pirimidina en un sistema que utiliza estos compuestos heterocclicos para la biosntesis.
Fui capaz de intereses Elvira Falco quien era entonces un asistente en el Departamento de Bacteriologa
de la empresa.Juntos hemos desarrollado un sistema utilizando Lactobacillus casei, que crecen bien con un
entonces desconocido "L-casei" factor de crecimiento o con una mezcla de timin electrnico y una purina
(fig. 1) (5).Este sistema rpidamente nos dio resultados alentadores. En una prueba de deteccin sencilla
para la actividad antibacteriana, los anlogos se encontr que inhibe fuertemente no slo la L. casei
sistema, pero las bacterias patgenas tambin.Habamos aadido las pruebas y toxicit en ratas en
crecimiento y otros procedimientos de vigilancia biolgica y se hace cada vez ms entusiasmado por los
resultados.
En 1947, seis o siete de nosotros se nos persigue este trabajo, y la sensacin en el grupo fue: "Ahora
tenemos los agentes quimioterpicos,. Slo tenemos que encontrar las enfermedades en las que van a ser
activa"En ese momento me hizo dos modalidades de estudios en colaboracin, uno con Sloan Kettering
Institute para ensayos antitumorales con sarcoma 180 en ratones, y otro con el exterior

laboratorios para la expansin de las pruebas anti-bacteriano y la malaria. Las pruebas contra la malaria
se ha incluido a travs de la visin de Pedro B. Russell, tambin miembro de nuestro grupo de
investigacin. Russell observ la semejanza de un 5-fenil-2, 4 - diaminopirimidina a una conformacin
hipottica del proguanil contra la malaria.Se supo despus que esta teora fue proftico, el dihidrotriazina
es el metabolito activo de proguanil (6).
Al ao siguiente, dos conductores se desarroll casi al mismo tiempo. Ico Fa comenz una serie de
inhibidores selectivos de la dihidrofolato reductasa con la sntesis de 2,4-diamino-5-phenoxypyrimidine, y
Gertrude Elion sintetizado 2,6-dia-minopurine (7).Este ltimo fue uno de los primeros cuatro compuestos
que presenten Ted Sloan Ketteri ng Instituto.Se mostr activo en el S-180 de prueba, se ha tenido en
ensayo clnico por Joseph H. Burchenal y dio al menos una remisin espectacular (8). Esto fue suficiente
para establecer la terapia del cncer la quimioterapia como un objetivo continuo de primaria de nuestro
grupo.La historia de purina analgico, que ha sido un tema importante en la carrera de Gertrude Elion, es
el tema de su discurso del Nobel.
El tema principal de este ensayo es el tema constante de los inhibidores selectivos de la dihidrofolato
reductasa (DHFR). Conocimiento bioqumico de la funcin de los folatos estaba desarrollando
concomitantemente. Figura 2 muestra que la dihidrofolato se sintetiza de novo en procariotas
(microorganismos), mientras que los CIES Spe ms altos de los eucariotas (host) debe tener la vitamina A
preformada.Voy a recoger la historia de los inhibidores selectivos de la dihidrofolato reductasa in medias
res y llevarlo adelante en la evolucin actual emocionantes.
Un corto iew de revoluciones de nuestra lnea de investigacin fue presentada en un simposio en honor
de Sir Henry Wellcome (9).Los trabajos de avances en la enzimologa (10), Avances en el Reglamento de enzimas
e inhibidores de enzimas, como las drogas (12) cuentan la historia de la selectividad entre los 2,4-
diaminopirimidinas de su primer reconocimiento cin antes de 1950 para su confirmacin.La prueba se
desarroll a travs de la inhibicin de Tor anlisis de la secuencia, conformaciones, mitognesis inducida,
los estudios con ayuda de computadora de conformacin y nuevas sntesis basadas en este tipo de
informacin.
La primera prueba del mecanismo de accin de estos compuestos se ilustra en la figura. 3 (13). El
crecimiento de Streptococcus faecium fue fcilmente inhibida por un diaminopirimidina cuando el
crecimiento fue inducida por el cido flico, pero tom 500 a 1000 veces como inhibidor mucho cuando el
cido folnico (tetrahidrofolato) fue suministrado.Esto fue interpretado correctamente como la inhibicin de
la enzima an desconocida responsable de la reduccin de cido flico a tetrahidrofolato.
En 1950, se lleg a la conclusin de que estbamos Ing. acuerdo con los inhibidores selectivos de la
dihidrofolato reductasa.A partir de este trabajo pareca probable que los detalles de estructura fina en
reductasa dihidroflico varan de una especie a otra y que un inhibidor dado puede exhibir una selectividad
considerable como resultado de suelta o apretada unin a la enzima correspondiente de husped o
parsito, respectivamente (14).El anlogo estructural completa de MTX muestra poca selectividad dad,
mientras que la pirimetamina es muy activo frente a la enzima malaria y trimetoprim en contra de una
enzima erial Bact.Ni tiene una toxicidad notable contra la enzima del hgado de rata.
Aislamiento y caracterizacin de esta enzima condujo primero a anlisis inhibidor (Tabla 1). Esta
documentado de forma inequvoca las diferentes estructuras de repre ases representativas dihidrofolato
Reducc de diferentes fuentes.Esto fue seguido por anlisis de aminocidos y las determinaciones de la
secuencia.

LOG millimicrograms PIRIMIDINA concentracin por 10 ml.

Figura 3. La concentracin de pirimetamina requerida para inhibir el crecimiento de Streptococcus faecium depende de si el cido

flico (0) o una forma de tetrahidrofolato () se utiliza en el medio (13).

Tabla I. La concentracin (IC 50) de metotrexato (MTX) pirimetamina (Pyr) o trimetoprim (TMP) requerida para inhibir la DHFK derivado de E.
rata hgado y P. berghei (9)
E., -

INHIBIDOR DE ANLISIS
8
IC50 x 10

Enzima E. E. hgado de rata P.berghei

Compuesto
MTX 0,1 0,2 0,07
Pyr 250 70 0,05
Tmp 0,5 3 7,0 x 103
 Al mismo tiempo el desarrollo de los conocimientos de las funciones de las derivaciones de folato en la
biosntesis y el metabolismo dio una apreciacin ms plena de la importancia de la inhibicin de la
dihidrofolato reductasa (Figs. 4.5. La actividad de la enzima es necesaria para producir t etrahydrofolate
inicialmente y para reciclar despus de su reoxidacin, molcula por molcula, en la formacin de
timidilato de deoxyuridylate.

Figura 6. Una ilustracin grfica de la configuracin de la molcula de la dihidrofolato reductasa (16).

Amino determinaciones de la secuencia de aminocidos llev a cabo una apreciacin completa de la alta
variabilidad de los componentes bsicos de esta enzima en un rango de especies (15).Entre las enzimas
de dos especies bacterianas slo hay 30 porcentaje de homologa, y entre procariotas y eucariotas, por
slo 30 ciento.Es slo las especies mayores que exhiben tanto como 90 por ciento de homologa. Ching
de visitas y Roth encontraron 16 identidades entre las enzimas de Escherichia coli y las del tumor de ratn
L1210 (12).Se predijo correctamente que el estudio de una gama ms amplia de enzimas reducira el
nmero de identidad. Si se toma no en la cuenta de las enzimas en la corriente principal, por ejemplo, los
protozoos a partir de plsmidos, el nmero es an menor.
Las enzimas principales (a partir de fuentes bacterianas y de mamferos) tienen conformaciones
similares. Eso publicado por Richardson (16) puede considerarse como el tipo (fig. 6). Althou enzimas de
mamferos gh son ms grandes que esta enzima bacteriana por unos 3000 daltons, los residuos
adicionales que existen bucles que no alteran mucho la conformacin principal.Por otro lado, las enzimas
de otros tipos de organismos pueden ser tan diferentes como para crear dudas sobre si estn
intrnsecamente dihidrofolato reductasa, o si su actividad en este campo es secundaria a alguna otra
funcin desconocida, por ejemplo, Matthews (17).Figura 7 (18) muestra algunas posibles orgenes de Tipo II
DHFR.

Si su funcin normal es:

Para reducir la DHFR Para reducir / oxidar

otros compuestos

1. Otros coliformes intestinales 1.Pteridina / flavina

2.Fago T4 2.No especficos deshidrogenasas

3. Anaerobios

4. Los hongos (levaduras)

5. Protozoarios

Figura 7.Los posibles orgenes de la dihidrofolato reductasa atpico (18)

 Es pertinente en este punto para hacer referencia a algunas de las aplicaciones de los inhibidores
selectivos de la dihidrofolato reductasa. Una aplicacin importante es, por supuesto, el establecimiento de
cotrimoxazol como un antibacteriano de gran importancia.Su creacin se deriva del conocimiento de que
en la combinacin de trimetoprim con sulfametoxazol, una fue la creacin de un bloqueo secuencial de un
gran bio-sinttica en la va de una bacteria o en otros procariotas. Los E fectos mnimos sobre el anfitrin
reflejar la ausencia en eucariotas de las reacciones que conducen a la biosntesis de dihidrofolato tal como
ocurre en las clulas procariotas.
La potenciacin fuerte que se produce es indicado por los datos de la Tabla 2 (19), que muestran que las
concentraciones mnimas inhibitorias de un componente permanente puede reducirse tanto como l0-20 o
de tapa cuando el segundo componente est tambin presente.Por otra parte, la combinacin podra ser
eficaz contra el rgano de ismos que no se ver inhibida por los frmacos individuales, por ejemplo,
Klebsiella sp. Y Streptococcus grupo C, donde las concentraciones inhibitorias individuales seran dudosos o
inalcanzables.
Una ilustracin adicional de la posible utilidad de los inhibidores de bioqumicamente similares se dan en
la figura. 8 (20), donde la adicin de 8-azagua nueve a una combinacin ya potentiative de diaveridina
(BW 21OU49) con sulfa diazina aumenta la potencia.Estas naciones triples bioqumicamente orientadas
combi no se han utilizado de una manera importante, pero su potencial sigue siendo explotable.
Me gustara centrarme ahora en los usos individuales de los inhibidores de la enzima dihidrofolato
reductasa.
Cronolgicamente primero, y quizs todava primera en importancia en la quimioterapia del cncer, es
el metotrexato de los Laboratorios Lederle. Metotrexato haba asumido un papel en la terapia de la
leucemia aguda en 1948 (2 1) y sigue siendo de gran inters hoy en da.Como se muestra en la Tabla 1, sin
embargo, es

relativamente selectivo. Su utilidad teraputica depende principalmente de diferencias en la absorcin,

excrecin y glutamylation celular, el equilibrio del metabolismo celular, y otros factores.
 Considerando que el metotrexato es un anlogo ESTRUCTURALES s cerca de folato, nuestros propios
antifols fueron significativamente diferentes y altamente selectivo.Estos hechos se llev a cabo mediante
el examen de detalles de la estructura y los centros activos de varias enzimas.
Por ejemplo, puede ser ilustrado mediante el contraste de la estructura fina del complejo de
metotrexato y cofactor en la L. casei DHFR (fig. 9) (22) con la de trimetoprim y cofactor en la enzima del
hgado de pollo (fig. 10)
23Es obvio que la molcula de metotrexato es mucho ms espacio-relleno
que el trimetoprim. Tales contrastes se observan en todas las situaciones donde el
inhibidores de molculas pequeas se observan, y los contrastes de la activa
centros de las enzimas son consistentes con las selectividades de los pequeos
los inhibidores de la molcula.
No tienen een b una serie de estudios de las funciones especficas de residuos de aminocidos.Uno de
los ms convincente fue informado por Kraut y colaboradores
(24) en un documento que varios experimentos combinados.En este estudio de la E.
coli enzima, la sustitucin de aspartato por asparagina reduccin de la actividad a

0,1% de la de la
enzima inalterada, que muestra la importancia del grupo carboxilo ionizables (fig. 11).La sustitucin de
alanina por glicil, hasta la prxima, completamente inactiva la enzima, probablemente por distorsionar su
conformacin cin.Sin embargo, la sustitucin de la SH para OH (cistena por serina) tuvo poco efecto. Este
tipo de experimento puede proporcionar la base para el SIS sntesis de nuevos inhibidores y til.
 Un aspecto del
metabolismo del cido flico que apareci relativamente tarde es la identifi cacin de los derivados de alto
peso molecular del cido flico como polygluta compaeros.Dado que la longitud de cadena de la mayora
de stos sea superior al de la forma ms larga que puede ser transportado en la clula de manera
eficiente, la mayora de las clulas contienen una sintetasa pteroylpolyglutamate.El nmero de residuos
glutamil vara con el tiempo y con el tipo de clula. Las inmensas complejidades de esta situacin estn
empezando a aparecer. No obstante, es interesante y instructivo comparar las constantes de unin y los
valores cinticos de poliglutamatos en algunas de las reacciones enzimticas implicadas en el
metabolismo del folato (Tabla 3) (25).

El metotrexato inhibidor est sujeta a polyglutamylation as una s tetrahidrofolato el.En muchos casos la
relacin de poliglutamato folato para la inhibicin Tor poliglutamato no est marcadamente cambiado,
pero es previsible que entre el gran nmero de posibilidades algunas de las anomalas y algunos de los
ndices teraputicos fi explicaciones nd slidos.Algunos de los efectos de glutamylation sobre enzimas
biosintticas especficas se muestran en la Tabla 4 (26).
Deseo referirme ahora a los detalles ntimos de la estructura de las enzimas especficas y su explotacin
en la sntesis de inhibidores ms activos.Figura 12 (27) muestra el ajuste de trimetoprima en la
dihidrofolato reductasa de E. coli.En la parte superior izquierda (residuo 57), uno puede ver el grupo
guanidino de la arginina. Esto fue aprovechado por Lee Kuyper quien reemplaz a la M-metoxilo de
trimetoprima wi de una serie de radicales carboxialcoxi.La longitud ptima result ser de 5 tomos de
carbono, y el producto, la derivacin amiloxi carboxilo, la enzima unido unas 50 veces ms fuertemente
que lo hizo Trimetilbenceno-oprim (28). En el mismo sentido, Brbara Roth sintetizado br o
moacetoxyphen-oxi anlogos de trimetoprim y se encontr que el derivado unido a la histidina-22 residuo
de la enzima con un enlace covalente (29).Estos ejemplos pueden ser considerados como sondas de un
vasto futuro y excitante.
La resistencia a antifols en multpara aspectos-le apareci poco despus a trabajar en estos inhibidores
comenz.Entre las diversas expresiones de resistencia (fig. 13) era una prdida del mecanismo de
transporte celular, que ha estimulado la investigacin de los inhibidores de lipfilos que no dependen de
esta hanism mec
 para el transporte en la
clula.En la actualidad los dos frmacos son potencialmente tiles trimetrexato y piritrexim (fig. 14). La
explotacin de estos inhibidores est en su infancia, pero cada uno ha mostrado interesantes propiedades
de su cuenta. Los efectos de un trimetrexato metotrexato nd se comparan en la Tabla 5 (30).

Tabla 6. Efecto de la combinacin piritrexim-sulfadiazina en el tratamiento de la toxoplasmosis murina. Sulfadiazina (S) se administr por va

oral por sonda a concentraciones de 4, 40, y 400 mg / kg por da, y piritrexim (P) se administr por va ip a una concentracin de 20 mg / kg
por da (32).

El tratamiento (concentracin) *

Ninguno S (4)
P + S (4)
S (40)
P + S (40)
S (400)
P + S (400)

3 Perec 6 SNT especulativ Tiortalit y: el da 20

0 0 cum 9 os i 12 15 18
100
0 20 60 100 - - -
0 20 40 60 80 80 80
0 20 40 100 - - -
20 20 20 40 80 80 80
0 0 80 100 - - -
0 0 0 0 0 0 0

Tanto trimetrexato y piritrexim han demostrado interesantes actividades en contra infecciosas organismos
procariotas. La combinacin de trimetrexato y leucovorina ha sido utilizado con xito para tratar la
neumona en pacientes con SIDA pneumocystic (31). Tabla 6 muestra el efecto de la combinacin de
piritrexim y sulfadiazina para tratar la toxoplasmosis murina (32).
 Finalmente, debe mencionarse es un inhibidor selectivo de la sintetasa de timidilato (fig. 15). El primero
de stos es 5,8-dideazaisopteroylglutamate (IAHQ) (fig. 16). IAHQ especificaciones y los inhibidores de c
de las reacciones biosintticas que impliquen tetrahidrofolato representan el inicio de una quimioterapia
contra el cncer bioqumicamente orientada a la mejora (33).
Me siento increblemente bendecido por haber estado involucrado por ms de cuatro dcadas en un
campo que UES Contin a ser ms emocionante, con cada ao que pasa.Figura 17 (34) traza la historia de
aumentar los conocimientos sobre dihidro-drofolate reductasa, a partir de nuestro trabajo en la dcada de
1940. Estos primeros estudios, los no orientados llevado al desarrollo de s frmaco til para una amplia
variedad de enfermedades (Fig. 18) y ha justificado nuestra creencia de que este enfoque de
descubrimiento de frmacos es ms fructfero que la focalizacin estrecha.En 1988, esta lnea de
investigacin contina para generar nuevos compuestos tiles.

Me gustara terminar con una cita de uno de mis propios trabajos: "A la bioqumica quimioterapeuta, no es
slo una cuestin de fe, sino un hecho evidente, que cada tipo de clula debe tener un patrn bioqumico
caracterstico, y por lo tanto ser susceptible para atacar en algn lugar o loci crticos para su
supervivencia y reproduccin. "(35)