Bacteriologa Dr.

Csar Cevallos Columbus

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANNTACNA

FACULTAD DE CIENCIAS: E.P. BIOLOGA MICROBIOLOGA
Curso: Bacteriologa
PRCTICAS DE LABORATORIO N 07

BACILOS GRAM NEGATIVOS: FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE

INTRODUCCIN

Los bacilos Gram negativos conforman un grupo compuesto por mltiples familias bacterianas
entre las que destacan la familia Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Pseudomonadaceae y otras.

La familia Enterobacteraceae constituye el conjunto mayor y ms heterogneo de bacilos Gram

negativos. Se han descrito al menos 27 gneros y 7 grupos entricos con ms de 110 especies.
Estos gneros se han clasificado en funcin de la homologa del ADN, propiedades bioqumicas,
reacciones serolgicas, susceptibilidad a bacterifagos especficos y patrones de sensibilidad a
los antibiticos. Son bacilos Gram negativos, facultativos que fermentan glucosa, son oxidasa
negativos, reducen nitratos a nitritos y no requieren ni su desarrollo se acrecienta con NaCl.
Pueden ser mviles o inmviles, estas caractersticas sirven para diferenciar miembros de esta
familia de otros bacilos Gram negativos facultativos fermentadores de glucosa pertenecientes a la
familia Vibrionaceae.

Excepto las especies de Shigella, que rara vez causan infecciones fuera del tracto gastrointestinal,
la mayora de las Enterobacterias son capaces de producir una variedad de infecciones
extraintestinales. Sin embargo, un pequeo nmero de especies incluyendo Enterobacter
aergenes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoneae, Proteus mirabilis y
Serratia marcescens dan cuenta de la gran mayora de las infecciones. Las infecciones del tracto
urinario (ms del 70%) principalmente cistitis son las ms comunes, heridas por infecciones
respiratorias, de heridas, del torrente sanguneo y del SNC. As mismo Escherichia coli es un
contaminante de agua potable por lo que se le emplea como un indicador de contaminacin fecal
y se determina la potabilizacin del agua haciendo un recuento de coliformes fecales. De igual
forma especies de Salmonella se pueden contraer va la ingesta de alimentos, por la cual es
necesario hacer pruebas de deteccin de Salmonella.

OBJETIVO
1. Que el alumno identifique las caractersticas culturales y bioqumicas de las especies ms
representativas de la Familia Enterobacteriaceae.
2. Que el alumno aprenda las tcnicas de aislamiento, identificacin y conservacin de los
bacilos entricos

MATERIAL PARA LA PRCTICA:

1. Placas de agar Mac Conkey REACTIVOS:

2. Placas de agar EMB 1.- Reactivo de Ehrlich
3. Placas de agar SS 2.- Reactivo de Kovacs
4. Tubos con TSI 3.- Tiras de papel filtro
5. Tubos con LIA OTROS MATERIALES:
6. Tubos con Citrato de Simons Asas bacteriolgicas en anillo y en punta
7. Tubo con caldo Selenito Mecheros
8. Agua peptonada 01 cmara de anaerobiosis
Incubadora

MUESTRAS DE TRABAJO: Heces humanas, aguas residuales o cloacales, orina (infeccin

urinaria).

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PROCEDIMIENTO

PRIMER DIA.
1. Sembrar la muestra, para su aislamiento, en placas con agar Mac Conkey, agar EMB y/o SS.
Incubar a 37C por 24 horas.
2. Sembrar el tubo con caldo Selenito o caldo Tetrationato con aproximadamente un 1g de heces
e incubar a 37C por 24 horas.

SEGUNDO DIA.
1. De las placas incubadas seleccionar las colonias de bacterias que muestren caractersticas
diferentes y, con cada colonia inocular en los tubos de TSI, LIA, Citrato de Simmons, Agua
peptonada (caldo Triptfano). Medio MR/VP, Incubar a 37C por 24 horas.
2. Del tubo de caldo Selenito inocular las placas con agar Mac Conkey y agar SS e incubar a
37C por 24 horas.

TERCER DIA:
1. Interpretar las pruebas bioqumicas de acuerdo a las instrucciones de su profesor e identificar
las bacterias de acuerdo a la tabla para identificacin de Enterobacterias.
2. Realice la lectura de las placas inoculadas del caldo Selenito.

TABLA PARA LA IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS

Indol
SimonsCitrato de

Sacarosa

Ureasa

Lactosa

Licuqcun de la

Glucosa
Gas

H2S

Lisina

Ornitina
Motilidad

Enterobacterias

Gelatina
Citrobacter + + v v - + v v v v - +
Edwardsiella - + + + + + + - - v - +
Enterobacter + + - - v + + + v v -/v +
Escherichia V + - + + v v v - v - +
Klebsiella V v - v v - - v v v - +
Morganella - v - + - + + - + - - +
Proteus V v v v - + v v + - + +
Providencia + v - + - + - v v - - +
Salmonella V v v - V + v - - - - +
Serratia + v - v V + V v - v V/+ +
Shigella - - - v - - v - - - - +
Yersinia - v - v - - v v v V -/v +
SMBOLOS: - , menos del 9% cepas positivas; v, 10 a 89 % de cepas positivas; +, mas del 90% de
cepas positivas. Tomado de Manual de Microbiologa Clnica 4 Edicin. Lennette.
Adaptado de Murray F.R. ( et. al . ) pag 484.

PRUEBAS BIOQUMICAS

1. Prueba de oxidasa: Esta prueba sirve para la determinacin de la presencia de la enzima

citocromo oxidasa en preparaciones de microorganismos.

Procedimiento:
1. Levantar con el ansa una colonia del cultivo puro.
2. Aplicar dicha colonia sobre la tira de papel de filtro embebida con el reactivo de Kovacs,
asegurndose de extender bien el material.
3. Esperar 5-10 segundos y observar la coloracin.

Interpretacin de resultados:
Prueba positiva: color azul por oxidacin de dicho compuesto a azul de indofenol.
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Prueba negativa: el color de la tira de papel de filtro no se modifica.

2. Prueba de catalasa: Esta prueba sirve para comprobar la presencia de la enzima catalasa en
preparaciones de microorganismos.

Procedimiento:
1.- Colocar una gota de agua en un portaobjetos limpio.
2.- Colocar dos asadas del cultivo a probar sobre la gota de agua y hacer una suspensin espesa
(no dejar secar).
3.- Agregar 2 o 3 gotas de agua oxigenada fresca.
4.- Observar los resultados.

Interpretacin de resultados:
Prueba positiva: formacin inmediata de burbujas bien visibles (desprendimiento de O2).
Prueba negativa: no hay formacin de burbujas (no se forma O2).

3. TSI (TRIPLE SUGAR IRON)

Introduccin: El agar triple azcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar
la capacidad de produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico
medio. Tambin permite la deteccin de la produccin de H2S.

Procedimiento:
Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm
del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y
otro lado. Incubar a 35 C durante 18-24 horas, pero no ms de 24 horas.

Interpretacin y Controles
Para el TSI siempre se informa el resultado en el siguiente orden: pico, fondo, produccin de gas y
H2S.

Pico alcalino/fondo alcalino (Alc/Alc/gas-/H2S-)

No hay fermentacin de azcares. Caracterstica de bacterias no fermentadoras. Ej.
Pseudomonas sp

Pico alcalino/fondo cido (Alc/A/gas-/ H2S-)

Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay produccin de gas ni de H2S.
Ej. Shigella spp.

Pico alcalino/fondo cido (Alc/A/gas-/ H2S+)

Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay produccin de gas, si de H2S.
Ej. Salmmonella typhi.
Pico alcalino/fondo negro (Alc/A/gas+/H2S+)
Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, produccin de gas y produccin de cido
sulfhdrico. Ej. Salmonella spp. (la mayora de las especies de Salmonella).

Pico cido/fondo cido (A/A)

Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H2S o no. E.coli (A/A/H2S -)
A estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas. Ej. A/A/gas+/H2S-.

4. LIA (LYSINE IRON AGAR)

Introduccin
Este ensayo permite diferenciar los m.o. que producen descarboxilacin o desaminacin de la
lisina. Se puede detectar adems la produccin de H 2S. Es muy utilizado en las tcnicas de
bsqueda de Salmonella, principalmente para descartar otras bacterias que dan colonias de
aspecto similar en los medios diferenciales utilizados durante el aislamiento selectivo.

Principio
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Durante las primeras etapas de la incubacin el fondo virar el indicador de pH del medio al cido
(amarillo) por la fermentacin de glucosa. Luego, si el aminocido es descarboxilado se formarn
aminas que provocan un retorno al color original del medio o hacia un viraje al bsico (color
violeta).
En la desaminacin se produce un cido carboxlico y NH3 y se visualiza en la superficie la
aparicin de un color rojo intenso. La produccin de H 2S a partir de tiosulfato se visualiza por la
precipitacin de sulfuro ferroso de color negro.

Interpretacin y controles
Pico alcalino/fondo alcalino/H2S+, descarboxilacin de lisina positiva. Ej.: Salmonella
choleraesuis.
Pico rojo/fondo cido/H2S-, desaminacin de lisina positiva, descarboxilacin de lisina
negativa. Ej.: Proteus mirabilis.
Pico alcalino/fondo cido/H2S- descarboxilacin de lisina negativa. Ej. E. coli
Pico alcalino/fondo cido/H2S+ descarboxilacin de lisina negativa, produccin de H2S. Ej.
Citrobacter freundii.

5. INDOL
Introduccin
El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las
bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con
produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica
importante para la identificacin de muchas especies de m.o.

Procedimiento
Inocular el caldo triptfano con el m.o. en estudio e incubar a 35C durante 18 a 24 horas. Al
finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo.

Interpretacin
El desarrollo de un color rojo intenso en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus de
aadir el reactivo indica la presencia de indol y un resultado de la prueba positiva.

6. ROJO DE METILO - VOGES-PROSKAUER (RM VP)

Principio
Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros de
enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan
por la fermentacin de la glucosa. Se conocen dos tipos generales: la fermentacin cido-mixta y
la fermentacin del 2,3 butanodiol. En la fermentacin cido mixta se forman fundamentalmente
lctico, actico y succnico, adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se forman
cantidades menores de cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol,
etanol, H2 y CO2.

El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo),
que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido mixta.

El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol.

En medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. Este se revela en
presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia.

Procedimiento
Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no ms de 24 horas del m.o. en estudio. Incubar a
35C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin transferir 1 mL del caldo a un
tubo limpio para VP. En el caldo restante revelar RM agregando unas 4 - 8 gotas del indicador rojo
de metilo. Para revelar VP agregar 0,6 ml (10 gotas) de alfa-naftol al 5% y 1 gota de KOH al 40%.
Agitar cuidadosamente para exponer el medio al oxgeno atmosfrico y dejarlo reposar durante 10
a 15 minutos.
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Interpretacin
La prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo estable. Esto indica que la produccin de
cido es suficiente para producir el viraje del indicador y el m.o. ferment la glucosa por la va de
cido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como
positivo.
La prueba VP es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia luego de 15 minutos, que indica la
presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona.

Controles: RM positivo, VP negativo: Escherichia coli

RM negativo, VP positivo: Enterobacter aerogenes

Pruebas Medio de cultivo Reactivos a usar Reaccin positiva

Indol Caldo 523 1 ml reactivo Kovack* Color rojo
al medio cultivo
Rojo de Metilo Caldo peptonado 5 ml cultivo Color rojo
5 gotas rojo de metilo
Voges- Caldo peptonado 1 ml cultivo Color rojo
Proskauer 0,6 ml naftol 5% luego de 5-10 min
0,2 ml KOH 40%
Agar- citrato Agar-citrato Ninguno Desarrollo
(tubos) acompaado de
cambio de color

7. UTILIZACIN DE CITRATO
Introduccin

La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con
citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este
aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

Procedimiento
Se inocula la superficie del agar inclinado con una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de 24
horas en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir
falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. Incubar a 35C durante 4
das.

Interpretacin
Es positivo: cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o no de un viraje
del indicador al azul.

CUESTIONARIO:

1.- Cul es la razn del empleo de medios selectivos indicadores en el coprocultivo. Explique las
bondades de cada uno de los medios solicitados para la prctica.
2.- Qu germen podra ser si presentar las siguientes caractersticas bioqumicas: lactosa
negativo; H2S positivo, sin gas, y que no aglutina con suero polivalente de Salmonella?
3.- Adems del TSI, LIA y Citrato de Simons, qu otras pruebas bioqumicas puede nombrar.
4.- En qu consiste la prueba de Widal? Cules son sus parmetros serolgicos?
5.- Cul es la importancia de hacer un recuento de coniformes fecales? Cmo se realiza?
6.- En la prueba de deteccin de Salmonella que medios utilizara usted? Cul sera su
procedimiento?
7.- Procedera un hemocultivo en el caso de una salmonelosis alimentaria? Explique por qu.

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Tacna, octubre 2016