Anda di halaman 1dari 9

ACARA II

ISOLASI DAN EKSTRAKSI DNA


I. TUJUAN
Mahasiswa mampu melakukan isolasi DNA darah, lisis sel, purifikasi dan
presipitasi DNA dengan benar.

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 DNA
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi
untuk mengatur perkembangan biologis untuk seluruh kehidupan. DNA adalah
molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses
metabolisme dalam organism. DNA ini tersusun atas tiga komponen utama yaitu
gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida
(maulana dkk,2010 )
DNA terdapat di dalam sel makhluk hidup yang sangat berperan penting
sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan
proses metabolism lain. DNA terdapat pada nucleus berbentuk linier dan
berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan
klorolas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon (maulana
dkk, 2010 )
Isolasi DNA adalah suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA
murni yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pada proses
isolasi DNA ini, sel eukariotik harus dihancurkan terlebih dahulu melalui cara
mekanik dan enzimatis. Hal ini disebabkan membrane sel dari membra ini
sebagian besar tersusun dari lipida (Wilson et al.,2010)
2.2 Metode Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam
langkah langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan,
akurasi dan panjang pembacaan ururab basa DNA dapat dipengaruhi secara
signifikan oleh karakter sample itu sendiri., dengan metode yang dipakai untuk
ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis
sample memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam
tergantung pada jenis jaringan (termasuk darah ), bagaimana ia memperoleh dari
sumbernya dan bagaiman sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak
(Sutomo, 2002 ).
Ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan berbagai metode, baik
konvensional maupun menggunakan kit. Ekstraksi DNA secara konvensional bisa
dilakukan antara lain dengan metode CTAB/NaCl (Mulyani et al., 2011),

2.2.1 Chelex
Teknik chelex umumnya mengeluarkan DNA untai tunggal menggunakan
prosedur penambahan suspensi secara langsung untuk specimen (darah, noda
darah) kemudian melalui resin penukar ion yang mengikat ion metal polivalen,
magnesium.
Metode chelex dari ekstraksi DNA lebih cepat dibandngkan dengan
metode ekstraksi organic. Sebagai tambahan metode chelex membutuhkan lebih
banyak langkah dan kebanyakan langkah itu digunakan untuk mengkontaminasi
sampel ke sampel. Bagaimanapun hal itu menghasilkan DNA tunggal sebagai
hasil proses ekstraksi. Oleh karena itu hanya bermanfat untuk prosedur pengujian
berbasi PCR.
2.2.2 Doyle & doyle
Metode dari Doyle dan Doyle (1987) dalam Ardiana (2009) yang
dimodifikasi. Sebanyak 200 mg sampel tanpa tulang daun ditambah PVP 0,02 g
digerus dengan nitrogen cair hingga halus (tepung). Selanjutnya hasil gerusan
dipindahkan ke dalam tabung eppendorf ukuran 1,5 ml, lalu ditambah 0,5 ml
bufer ekstraksi CTAB (1,4 M NaCl, 2% CTAB, 50 mM EDTA, 1 M Tris-HCl pH
8,0 dan 0,2% -mercaptoetanol). Proses lisis dinding sel dilakukan dengan
menginkubasi tabung berisi sampel daun ke dalamwaterbath suhu 65oC selama 60
menit. Tabung diangkat dari waterbath dan dibiarkan beberapa menit sampai suhu
sampel dalam tabung menurun. Selanjutnya ditambah khloroform: isoamilalkohol
(CIA 24:1) 500 l. Tabung dikocok menggunakan vortex, kemudian disentrifugasi
pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam
tabung bar lalu ditambahkan isopropanol dingin sebanyak 1 volume, dibolak-balik
perlahan hingga tampak benang DNA. Sampel kemudian dibiarkan mengendap
selama semalam dalam lemari pendingin pada suhu 4oC. Setelah diendapkan
semalam, sampel kemudian disentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 10.000
rpm. Pellet DNA yang terbentuk di dasar tabung kemudian dikering udarakan.
Setelah itu ditambahkan 100 l ddH2O dan disimpan dalam lemari pendingin (-
4oC).
2.2.3 Kit
Metode isolasi DNA yang tepat merupakan tahap yang penting dalam
analisis molekuler di bidang mikrobiologi, salah satunya dalam kajian
bakteriologi. Oleh karena itu, metode isolasi DNA yang dapat digunakan dalam
isolasi DNA bakteri gram positif sekaligus bakteri gram negatif sangat diperlukan.
Salah satu metode yang umum digunakan untuk isolasi DNA bakteri ialah metode
CTAB/NaCl, tetapi perkembangan teknologi saat ini telah menghasilkan produk
dalam bentuk kit untuk isolasi DNA
Kit untuk isolasi DNA dikeluarkan oleh beberapa perusahaan dagang,
salah satu produknya ialah QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). QIAamp DNA Mini
Kit (Qiagen) merupakan kit yang digunakan khusus untuk isolasi DNA bakteri
baik dari kultur murni maupun dari sekret makhluk hidup seperti darah, dan dapat
digunakan dengan alat otomatis (robotik) yang bersifat closed system. Metode-
metode isolasi DNA seringkali mengalami modifikasi sesuai kebutuhan di
laboratorium.
Isolasi DNA juga dapat dilakukan dengan menggunakan kit yang sudah
diproduksi oleh beberapa perusahan untuk mempermudah dan mempercepat
proses isolasi DNA. Kit isolasi juga disesuaikan dengan kebutuhan oleh
konsumen dan jenis sel yang akan digunakan

III. METODOLOGI
3.1 Alat
a. Microcebtrifuge tube
b. Mikropipet 100L-1000L (tip biru)
c. Vortex
d. Centrifuge
e. Oven
f. GD column
g. Nano drop
3.2 Bahan
a. Darah
b. RBC lysis Buffer
c. GB buffer
d. Elution Buffer
e. Ethanol
f. W1 buffer
g. Wash buffer
3.3 Cara Kerja
a. Persiapan Sample
1. Siapkan darah 200 L, kemudian ambil dengan mikropipet
2. Tambahkan 3 kali RBC lysis buffer (600 L) kemudian dibolak balik tetapi
tidak menggunakan vortex
3. Di inkubasi selama 10 menit pada suhu ruang
4. Di centrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm suhu 20 C untuk
menghilangkan supernatant
5. Tambahkan 100 L RBC lysis buffer pada pellet di tube
b. Langkah 1 ( Lisis Sel )
1. Tambahkan 200 L GB buffer pada pellet yang ada di mikrocentrifuge
kemudian di vortex
2. Di inkubasi pada suhu 60 C selama 10 menit dengan menggunakan oven ,
setiap 3 menit tube di bolak balik
3. Elution buffer disimpan di oven
c. Langkah 2
1. Tambahkan 200 L GB buffer pada peller kemudian divortex
2. Tempatkan GD column pada 2 ml collection tube
3. Dicentrifuge 16.000 rpm selama 5 menit pada suhu 20C
4. Lepaskan 2 ml collection tube, kemudian letakan GD column pada 2 ml
collection tube yang baru
d. Langkah 3
1. Tambahkan 400 L W1 buffer pada GD column kemudian dicentrifuge
dengan kecepatan 16.000 rpm selama 1 menit suhu 20 C
2. Kemudian buang hasil saringan, GD column pindahkan ke collection tube
3. Tambahkan 600 L wash buffer ke GD column
4. Kemudian dicentrifuge dengan kecepatan 16.000 rpm selama 1 menit dengan
suhu 20 C
5. Pindahkan GD column ke collection tube
6. Dicentrifuge lagi selama 3 menit dengan kecepatan 16.000 rpm untuk
mengeringkan column matrix
e. Langkah 4
1. Pindahkan Ke GD column yang baru
2. Tambahkan 100 L elution buffer ke tengah column matrix
3. Diamkan selama 3 menit
4. Dicentrifuge lagi dengan kecepatan 16.000 rpm selama 30 detik untuk
purifikasi DNA

IV. Hasil Pengamatan


No Pengamatan Penjelasan
1 Alat alat yang
digunakan
2 Di vortex

3 Sisa akhir sel


darah

4 Di centrifuge

5 supernatan(DNA)
dipindahkan ke
tabung lain
6 Setelah
dicentrifuge

7 Pembacaan
konsentrasi DNA
dengan Nano drop
2000

8 Hasil Konsentrasi
DNA dengan
Nano drop 2000

4.1 Tabel Konsentrasi DNA yang didapat


No Kode Sampel Konsentrasi DNA 260 nm 280nm
(ng/L)
1 Kel 3 epid 29,6 0,592 0,280
Kemurnian 260 / 280 adalah 2,11

V. PEMBAHASAN
Prinsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai
organisme pada dasarnya memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang
digunakan. Bahkan beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan
kit yang diproduksi oleh suatu perusahaan. Namun, tahap tahap isolasi DNA
dalam setiap langkahnya memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan
keperluan. Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki
kelebihan dan kekurangan . Metode konvesional memiliki kelebihan harga lebih
murah dan digunakan secara luas sementara kekurangannya membutuhkan waktu
yang relative lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel.
Pada praktikum kali ini yaitu melakukan analisa DNA dapat diukur dengan
menggunakan instrument Nanodrop 2000 pada panjang gelombang 260 dan 280
nm. DNA murni jika memiliki nilai 1,8 2,0. Jika nilainya kurang dari 1,8 maka
pada sampel terdapat pengotor atau terkontaminasi protein.
Dari hasil perhitungan yang kami peroleh di dapat kemurnian DNA hasil
isolasi dengan rasio perbandingan absorbansi 260/280 sebesar 2,11 dan
menunjukkan hasil yang diperoleh menunjukkan DNA terkontaminasi RNA.

VI. KESIMPULAN
Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam
langkah-langkah kerja analisis DNA. Teknik Chelex adalah metode ekstraksi yang
cepat dan efektif menghasilkan kualitas DNA baku yang dapat digunakan dalam
uji kompleks PCR. Teknik Chelex mengeluarkan DNA untai tunggal
menggunakan prosedur penambahan suspensi resin-chelat secara langsung untuk
spesimen, kemudian melalui resin penukar ion yang mengikat ion metal polivalen,
magnesium. Dalam tahap terakhir, logam membawa materi lain dengannya yang
menghasilkan larutan dalam dua fraksi, yaitu fraksi bagian atas merupakan
supernatan yang mengandung DNA dan fraksi bawah merupakan endapan Chelex.
Isolasi DNA merupakan tahap awal dalam proses identifikasi DNA,
sampel yang didapat diambil dari darah , untuk mengidentifikasinya haruslah teliti
agar hasil yang didapat bisa akurat
Dari hasil perhitungan yang kami peroleh di dapat kemurnian DNA hasil
isolasi dengan rasio perbandingan absorbansi 260/280 sebesar 2,11 dan
menunjukkan hasil yang diperoleh menunjukkan DNA terkontaminasi RNA

DAFTAR PUSTAKA
Mulyani Y, Purwanto A, Nurruhwati I, 2011. Perbandingan Beberapa Metode
Isolasi DNA untuk Deteksi Dini Koi Herpes Virus (KHV) pada Ikan
Mas (Cyprinus carpio L.). Jatinangor : Fakultas Perikanan dan Ilmu
Kelautan, Universitas.
Wilson, Keith and John Walker. 2010. Principles and Techniques of Biochemistry
and Molecular Biology. Cambridge University Press. New York.
Zain hasan. Saved M. Safe Muhammad. et al. 2009. Genomic DNA Extraction
Method from Wormood Capilary for PCR-RAPD Studies. New York
Science Journal.
Rivadi. W Rivadi. Wahyu. 2009. Macam Spekttrofotometri dan Perbedaannya.
Milis Kimia Indonesia.
Yusminah. Oslan Jumadi. 2009. Dasar dasar Mikrobiologi. Jakarta
:Bambatanghala.
Muh. Restu, Mukrimin dan dan Gusmiaty . Optimalisasi Teknik Ekstraksi dan
Isolasi DNA Tanaman Suren ( Toona Sureni Merr) untuk analisis
Keragaman Genetik berdasarkan Random Amplified Polymorphonic
DNA (RAPD). Jurnal Natur Indonesia , Februari 2012: 138-142 ISSN
1410 - 9379

Anda mungkin juga menyukai