LUIS ALVAR SANCHEZ CATZIN

RESUMEN DE: Exposicin sub-toxica de etanol modula la

expresin de genes y actividad enzimtica de sistemas
antioxidantes para proporcionar neuroproteccin en clulas
HT22 del hipocampo

Se sabe que exposiciones altas de etanol son gravemente dainas,

incluso se sabe que el hipocampo es el locus principal para alteraciones
funcionales cognitivas inducidas por etanol. Sin embargo adems de
estos efectos degradativos, muchas lneas de evidencia han sealado
que un consumo de bajas dosis de alcohol puede proporcionar un efecto
neuroprotector contra la enfermedad de Alzheimer. Interesantemente el
etanol incluso protege a las neuronas del dao de sinapsis inducido por
agregados presinpticos de -sinuclena, el cual es caracterstico del
Parkinson y demencia con cuerpos de lewy.
En este artculo se examin un posible mecanismo por el cual
concentraciones moderadas de etanol ejercen un efecto neuroprotector
en clulas del hipocampo mediante modificaciones de las capacidades
antioxidantes, es decir, exposiciones subtxicas de etanol desencadena
la activacin de sistemas antioxidantes celulares tanto enzimticamente
como transcripcionalmente.
La lnea celular inmortalizada de hipocampo de ratn, HT22, fue
cultivada en un medio estndar de DMEM (Dulbeccos modified Eagles
mdium), el cual fue cambiado cada 2 das y, cuando alcanzaba 90 % de
confluencia, las clulas fueron subcultivadas despus del tratamiento
con una mezcla de tripsina-EDTA , en matraces T25 y T75.
Despus de 24 horas de fijacin, el medio de cultivo fue remplazado
con un suplemento de medio estndar con etanol al 0.1 % con un
vehculo de solucin salina tampn de phospato (PBS). Cada 24 horas de
incubacin se reemplaz por medio nuevo con etanol y PBS o
simplemente con PBS. Se tom muestra a las 6, 23, 30 y 48 horas,
inmediatamente despus se procesaban para el anlisis de enzimtico y
glutatin y niveles de TBARs.
En primer lugar, se analiz el curso del tiempo de los efectos de la
exposicin de etanol sub-txico (0,1%) sobre la expresin de diferentes
genes que codifican para las enzimas antioxidantes con actividad
relevante en las clulas neuronales. Se exploraron las enzimas clave de
los tres principales sistemas antioxidantes, es decir, los sistemas
clsicos, tiorredoxina / peroxyredoxin, y glutatin / glutaredoxina. Los
genes diana analizados se detallan en una tabla, junto con la
informacin de los cebadores utilizados para la amplificacin por PCR.
Despus, se evalu la actividad de la mayora de las enzimas
antioxidantes codificadas por los genes que se vieron afectados por el
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tratamiento con etanol, siguiendo el mismo transcurso de tiempo

utilizado para explorar los cambios en la actividad transcripcional.
Destaca que a actividad de la superxido dismutasa aument por
tratamiento con etanol, 24 h despus de la exposicin, siendo la
actividad mxima alcanzada en 48 h.
Dentro del sistema de tiorredoxina, se explor el curso temporal de la
actividad total de la tiorredoxina reductasa (tTXNRD). Se observ que,
en lnea con los resultados de TXNRD1, la actividad TXNRD fue
estimulada desde las 6 h, y se observ la activacin mxima a las 48 h.
los anlisis posteriores.
Tambin determinamos los niveles celulares de glutatin total, glutatin
reducido, glutatin oxidado. Ninguno de estos oligopptidos pareca
estar afectada por tratamiento con etanol durante todo el experimento,
en comparacin con las clulas tratadas con PBS. Estas observaciones
sobre las especies de glutatin estn en contraste con los niveles de
expresin de gen GCLC, que se incrementaron significativamente por el
final del experimento sin embarg no se tiene una idea clara de lo que
ocurri en este caso.
Finalmente se analizaron los efectos de diferentes dosis de tratamiento
con etanol sobre la proliferacin de las clulas HT22. Se pudo observar
que las clulas HT22 alcanzan el ndice celular mxima (CI MAX) despus
de 120 a 160 h de la siembra en las condiciones de los experimentos. En
presencia de 0.1% de etanol, los valores mximos de CI fueron similares
entre PBS y las clulas tratadas con etanol. Sin embargo, cuando fueron
estimulados con 10 veces ms alta dosis de etanol, se observ una
reduccin significativa de la proliferacin celular, lo que indica un
importante grado de toxicidad por esta dosis de etanol, probablemente
causada por un estrs oxidativo excesivo, que super la efectos
citoprotectores de defensa antioxidante endgena inducida por la baja
exposicin al etanol.
Con el fin de evaluar si los cambios en la expresin gnica antioxidante
pueden conferir resistencia a las agresiones oxidativas txicos, se utiliz
glutamato, que se ha informado que causa excitotoxicidad en las clulas
HT22 (He et al., 2013) y el estrs oxidativo secundario a la reducci de
cistena (Li et al., 1998). En primer lugar, el uso de regresin no lineal a
una ecuacin logstica de cuatro parmetros, se determin el valor de
CI50 para la toxicidad del glutamato en contra de ndice de clulas, y se
encontr un valor de 19.5 mM. Luego, se ensayaron una concentracin
de glutamato de 20 mM en etanol (0,1%) - clulas tratadas, mientras
que el seguimiento de la proliferacin de clulas en tiempo real. Hemos
observado que la pre-exposicin a 0.1% de etanol impedido
significativamente la muerte celular inducida por glutamato es
aproximadamente el 80% de las clulas tratadas con etanol, en
comparacin con la muerte celular alrededor de 90% en ausencia de
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EtOH. Por lo tanto, llegamos a la conclusin de que el etanol reduce

eficazmente la muerte celular causada por la excitotoxicidad inducida
por glutamato.

Referencias:
Casaas-Snchez, V., Prez, J.A., Quinto-Alemany, D., and Daz, M. (2016) Sub-
toxic Ethanol Exposure Modulates Gene Expression and Enzyme Activity of
Antioxidant Systems to Provide Neuroprotection in Hippocampal HT22 Cells.
Front. Physiol. 7:312.
He, M., Liu, J., Cheng, S., Xing, Y., and Suo, W. Z. (2013). Differentiation renders
susceptibility to excitotoxicity in HT22 neurons. Neural Regen. Res. 8, 1297
1306.
Li, Y., Maher, P., and Schubert, D. (1998). Phosphatidylcholine-specific
phospholipase C regulates glutamate-induced nerve cell death. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 95, 77487753.

Ficha: lnea celular de hipocampo de ratn inmortalizada (HT22)

Invencin: Los investigadores del Salk desarrollaron una lnea de clulas del
hipocampo de ratn inmortalizada, HT22, que es una sub-lnea derivada de
clulas HT4 padres que han quedado inmortalizados originalmente de cultivo
neuronal del hipocampo del ratn primario.
Usos: Las clulas HT22 proporcionan un modelo en el sistema in vitro para
estudiar la citotoxicidad de glutamato, una caracterstica de muchos trastornos
neurodegenerativos tales como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad
de Parkinson
INVENTORES: David Schubert
ESTADO DE PATENTE: sin pasientes
CONTACTO: Kiren Rockenstein, PhD, 858 453 4100 x1758; kiren@salk.edu
REFERENCIA #: T09031
LINK DIRECTO: http://salkinnovations.testtechnologypublisher.com/technology/7060