Anda di halaman 1dari 20

ISOLASI DAN ELEKTROFORESIS PROTEIN

LAPORAN PRAKTIKUM

Untuk Memenuhi Tugas Matakuliah Teknik Analisis Biologi Molekuler

Yang Dibimbing oleh Dra. Umie Lestari M.Si dan Prof. Dr. Agr. Moh. Amin

Oleh
Kelompok 1
Anang Januardi (130342603494)
Khilyatun Nafis (130342603476)
Rizki Amalia N. K. (130342615332)

UNIVERSITAS NEGERI MALANG


FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN BIOLOGI
DESEMBER 2015
BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Dalam perkembangan ilmu yang semakin maju dan berkembang saat ini
kajian ilmu semakian lama semakin berkembang. Salah satunya dalam bidang
ilmu biomolekuler yang disebabkan oleh teknologi teknologi modern telah
semakin modern. Salah satunya adalah isolasi pada protein menggunakan
sampel dari protein spermamembran protozoa sapi.
Isolasi protein merupakan salah satu cabang ilmu genetika yang dapat
dilakukan dengan cara dan bahan sederhana, hingga dengan teknologi modern.
Pada dasarnya isolasi protein dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain
organ manusia, darah, daun, daging buah, kalus, akar batang, daging dan sisik
ikan.
Elektroforesis merupakan sebuah proses bergeraknya molekul bermuatan
pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis
dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam
nukleat). posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan
pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan
densitometer.
Elektroforesis dapat berlangsung dalam beberapa tipe berdasarkan
medianya yaitu media gel dan media paper. Elektroforesis ini juga berguna
dalam kehidupan manusia, misalnya : penentuan kadar kemurnian suatu
protein, menganalisis protein plasma dan lain-lain. Elektroforesis juga dapat
digunakan untuk memperkirakan berat molekul protein yang belum di ketahui.

Berdasarkan latar belakang tersebut maka dilakukan praktikum isolasi


dan elektroforesis protein dengan tujuan untuk meningkatan dan
mengembangkan ilmu pengetahuan terutama dalam kajian molekuler.
1.2 Tujuan
1.2.1 Untuk mengetahui mekanisme isolasi protein pada sperma sapi
1.2.2 Untuk mengetahui mekanisme elektroforesis protein pada sperma sapi

1.3 Manfaat
Hasil dari praktikum diharapkan dapat memberikan manfaat sebagai berikut:
1. Bagi Peneliti
a. menambah pengetahuan dan wawasan mengenai mekanisme isolasi
protein dan elektroforesis pada sperma sapi
b. menambah ketrampilan dalam teknik pipeting dan cara kerja alat-alat yang
digunakan pada isolasi protein dan elektroforesis pada sperma sapi
2. Bagi mahasiswa
a. menambah pengetahuan dan wawasan mahasiswa dalam ilmu genetika
khususnya mengenai isolasi dan elektroforesis protein

BAB II

KAJIAN PUSTAKA

2.1 PROTEIN

Zahn et al. (2006) menyatakan bahwa komposisi protein plasma semen dan
membran sperma bervariasi antar individu dan berhubungan dengan ketahanan
sperma terhadap pembekuan. Selain itu protein plasma semen seperti osteopontin dan
lipocalin-rumpun prostaglandin D synthase bervariasi antara pejantan. Komposisi
plasma semen tidak homeostatis dan bervariasi tidak hanya antar spesies, tetapi juga
di antara individu dan antar ejakulasi dari hewan yang sama (Garner & Hafez 2000).
Fungsi protein yang terdapat pada membran plasma spermatozoa antara lain adalah
sebagai reseptor, antigen, signal transduksi dan stabilisasi ikatan kovalen penyusun
protein membran plasma.
Protein membran spesifik spermatozoa digunakan sebagai dasar dalam
estimasi hubungan kekerabatan, protein-protein tersebut diantaranya protein
membran spermatozoa yang terekspresi di testis selama spermatogenesis, bukan
protein-rotein yang terbentuk ketika spermatozoa berada pada saluran reproduksi
jantan (epididimis, vesikula seminalis, kelenjar prostat, dan kelenjar cowper)
(Johnson and Everitt, 2007). Pengamatan protein spesifik didasarkan pada karakter
spermatozoa yang DNA stabil akibat ikatan disulfida yang kuat DNA dengan
protamin sehingga spermatozoa tidak akan mengalami sintesis protein hingga
spermatozoa membuahi sel telur. Oleh karena itu, susunan protein struktural
membran spermatozoa tidak mengalami perubahan hingga spermatozoa membuahi
ovum (Yu, 2008).

2.2 PRINSIP KERJA ISOLASI PROTEIN

Isolasi protein membran spermatozoa sapi. Isolasi merupakan suatu cara yang
dilakukan untuk mengoleksi protein spermatozoa sapi dalam bentuk straw dengan
bahan Semen sapi dalam straw, Larutan PBS (Phosphate Buffer Saline), BO Cafein,
Larutan PBS-T (Phosphate Buffer Saline Tween), dan RSB (Reducing Sample
Buffer). Larutan PBS-T sebagai detergen yang digunakan untuk memisahkan ikatan
protein dan fosfolipid pada membran spermatozoa. Hasil dari isolasi protein membran
spermatozoa sapi ini berupa isolat protein. Selanjutnya melakukan perhitungan
konsentrasi isolat protein dengan menggunakan nanodrop, kemudian melakukan
elektroforesis SDS PAGE isolat protein membrane spermatozoa dengan bahan
Protein marker Spectra TM Multicolor Broad Range Protein Ladder #SM1841,
Akrilamid-Bis, Tris 1M pH 8,8, Tris 1M pH 6,8, SDS (Sodium Dedocyl Sulphate) 10
%, APS (Amonium Per Sulphate) 10 %. RSB (Reducing Sample Buffer), temed (N,
N, N, N, -tetramethyl-ethylenediamine), Larutan RSB Non-reducing, larutan
staining, larutan de-staining.

2.3 PRINSIP KERJA ELEKTROFORESIS PROTEIN

Elektroforesis adalah teknik pemisahan dari DNA, RNA, dan protein


menggunakan arus listrik pada matrik gel. Dalam proses elektroforesis memerlukan
gel atau agar yang digunakan sebagai medium. Elektroforesis SDS-PAGE dilakukan
dengan konsentrasi separating gel 12,5% dan stacking gel 3% menurut Lestari (2008).
Metode PAGE yang umumnya digunakan untuk analisa campuran protein secara
kualitatif adalah SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel
Electroforesis). Metode ini sering digunakan untuk menentukan berat molekul suatu
protein disamping untk memonitor pemurnian protein. Penggunaan SDS berfungsi
untuk mendenaturasi protein karena SDS bersifat sebagai deterjen yang mengakibat
ikatan dalam protein terputus membentuk protein yang dapat terelusi dalam gel begitu
juga mercaptoetanol.

Prinsip elektroforesis SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrilamide


Gel Reaction) teknik pemisahan protein darah dengan migrasi komponen acrilamida
berdasarkan perbedaan berat molekul. SDS PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-
Polyacrilamid gel electroforesis) adalah tehnik elektroforesis yang sering digunakan
dalam analisis protein laboratorium. Sampel protein denaturasi (dipanaskan) dan
dicampur dengan SDS (yang merupakan detergen yang anionik) dengan akibat
kompleks protein detergen itu bermuatan negative dan protein yang lebih besar
mempunyai muatan negative yang lebih besar. Kompleks protein detergen itu akan
dibawa oleh medan listrik kearah kutub positif (Anoda). Gel akrilamid berfungsi
sebagai dasar atau atau alas atas gerakan sampel protein. Konsentrasi akrilamid
menentukan protein SDS.
Protein-protein dapat dipisahkan berdasarkan berat molekul. SDS-PAGE
(sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electrophoresis) adalah teknik
elektroforesis yang sering digunakan dalam analisis protein di laboratorium. Sempel
protein denaturasi (dipanaskan) dan dicampur dengan SDS (yang merupakan detergen
yang anionik) dengan akibat kompleks protein-detergen itu bermuatan negatif dan
protein yang lebih besar menpunyai muatan negatif yang lebih besar. Kompleks
protein-detergen itu akan dibawa oleh medan listrik ke arah kutub positif (anoda). Gel
akrilamide berfungsi sebagai dasar atau alas atas gerakan sampel protein. Konsentrasi
akrilamide menentukan ukuran pori-pori gel dan ukuran pori-pori gel menentukan
jarak yang ditempuh oleh kompleks protein-SDS. Jadi berapa faktor harus ditentukan
untuk memaksimalkan pemisahan protein-protein melalui teknik SDS-PAGE (antara
lain: kadar SDS, konsentrasi gel akrilamide dan ukuran gelnya, kemurnian sampel
protein dan jumlah sampel yang diletakkan pada gel; voltage yang digunakan pada
alat elektroforesis dan selama medan listrik dihidupkan).

2.4 GEL POLYAKRILAMIDE

Elektroforesis menggunakan gel poliakrilamida dilakukan pada medan gerak


vertikal. Pembuatan gel poliakrilamida lebih sulit daripada gel agarosa karena gel
poliakrilamida memiliki resolusi tinggi, membutuhkan biaya yang mahal,
preparasinya lama, laju pemisahan fragmen lebih lambat serta bersifat toksik.
Penggunaan poliakrilamida mempunyai keunggulan dibandingkan dengan gel
lainnya, karena tidak bereaksi dengan sampel dan tidak membentuk matriks dengan
sampel, sehingga tidak menghambat pergerakan sampel yang memungkinkan
pemisahan protein secara sempurna. Selain itu, gel poliakrilamida ini mempunyai
daya pemisahan yang cukup tinggi.

Dalam melakukan elektroforesis, sampel molekul yang akan dianalisis


dimasukan ke dalam sumur (well) pada gel dan dimasukkan kedalam larutan
penyangga misalnya TBE 1 atau TAE 1 kemudian dialirkan listrik dan molekul
sampel akan bergerak menuju salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya.
Misalkan asam nukleat, maka arah pergerakannya akan menuju elektoda positif
karena muatan negatif pada rangka gula fosfat yang dimilikinya. Setelah proses
elektroforesis selesai maka selanjutnya dilakukan proses staining supaya molekul
sampel yang sudah terpisah dapat dilihat

Terbentuknya gel ini tidak dilakukan dengan pemanasan, tetapi dengan


mencampurkan larutan akrilamid dengan ammonium persulfat dan TEMED
(N,N,N,N-tetramethyl ethylenediamine). Pencampuran ini akan mengakibatkan
monomer akrilamid mengalami polimerisasi menjadi rantai panjang. Dengan
penambahan senyawa lain N,N-methylene bisacrylamide di dalam proses
polimerisasi, terbentuk cross linked antar rantai panjang sehingga terbentuk gel yang
tingkat porositasnya ditentukan oleh panjang rantai dan derajat penyilangan antar
rantai (cross link).

Panjang rantai polimer akrilamid ditentukan oleh konsentrasi akrilamid di


dalam reaksi polimerisasi (antara 3,5% dan 20%). Senyawa bisacrylamide yang
berfungsi sebagai cross linker ditambahkan dengan perbandingan 1:29 terhadap
akrilamid. Efektifitas pemisahan DNA di dalam gel poliakrilamid tergantung dari
konsentrasi akrilamid. Gel poliakrilamid dapat disiapkan untuk elektroforesis
sepanjang 10 cm sampai 100 cm, yang bergantung dari pemisahan DNA yang
diinginkan dan elektroforesis dilakukan pada posisi vertikal (tidak horizontal seperti
pada gel agarosa). Dibanding gel agarosa, gel poliakrilamid memiliki beberapa
keuntungan, yaitu:

1. Resolusi dalam memisahkan DNA lebih tinggi sehingga panjang molekul DNA
yang berbeda hanya satu nukleotida dapat dideteksi.

2. Gel poliakrilamid dapat menampung jumlah DNA yang labih besar daripada gel
agarosa.

3. DNA yang diekstrak dari gel poliakrilamid bersifat sangat murni dan dapat
digunakan untuk analisis lebih lanjut.

Ada dua jenis poliakrilamid yang biasa digunakan, yaitu:


1. Gel poliakrilamid non-denaturasi untuk separasi dan purifikasi molekul DNA
untai ganda (double stranded DNA). Gel ini digunakan untuk elektroforesis dalam
larutan TBE (penyangga) dengan voltase rendah (1-8 V/cm) untuk mencegah
terjadinya denaturasi (pembelahan) molekul DNA akibat panas yang ditimbulkan
aliran listrik. Kecepatan migrasi molekul DNA untai ganda di dalam gel ini kira-
kira berbanding terbalik dengan log10 ukuran molekul DNA. Kecepatan migrasi
ini juga dipengaruhi oleh komposisi basa dan sekuen DNA. Jadi, dua molekul
DNA yang berukuran persis sama mengalami migrasi dengan kecepatan yang
berbeda sekitar 10%. Karena karakter yang demikian, gel ini tidak dapat
digunakan untuk menentukan ukuran panjang molekul DNA untai ganda.

2. Gel poliakrilamid denaturasi untuk separasi dan purifikasi molekul DNA untai
tunggal (single stranded DNA). Gel ini dibuat dengan mencampurkan senyawa
kimia (urea atau dapat juga formamide) yang mencegah terjadinya penempelan
antar nukleotida yang saling berkomplemen (base pairing). Alkali tidak dapat
digunakan karena dapat mendeaminasi akrilamid sedangkan methylmercuric
hydroxide juga tidak dapat digunakan karena dapat menghambat proses
polimerisasi akrilamid. Migrasi molekul DNA untai tunggal di dalam gel ini sama
sekali tidak terpengaruh oleh komposisi basa dan sekuen DNA. Sampai saat ini,
gel jenis ini sering digunakan untuk isolasi DNA berlabel, analisis DNA hasil
digesti enzim nuklease atau yang paling sering untuk mensekuen DNA (DNA
Sequensing).

BAB III
METODE

3.1 Alat dan Bahan


a. Alat
Tube
Sentrifuge
Mikropipet
Incubator
Freezer
Nanodrop spektofotometer
Komputer
Heater
Tray elektroforesis horizontal
Uv transluminator
Vortex maxi mix II
Sonikasi
Refrigerator
Tabung falcon
Plate elektroforesis
Chamber elektroforesis
Tabung ependrof
Running elektroforesis
Rotary shaker
b. Bahan:
Isolasi protein
ml semen sapi
PBS
PBS-T
Etanol absolut
Tris cl
Elektroforesis SDS-PAGE
Akrilamid Bis 30%
Tris 1,5 M pH 8,8
dH2O
SDS 10%
APS 10%
Temed
Aquades
Tisu
Tris 0,5 M pH 6,8
Running buffer
Isolate protein
Larutan RSB
Larutan staining
3.2 Prosedur Kerja isolasi kritis
Isolasi Protein

Semen sapi diambil 2 mL

Ditambah dengan PBS dengan perbandingan volume semen : PBS yaitu


1:3

Divortex

Disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit

Supernatan dibuang, yang diambil hanya pellet jasa

Ditambah PBS-T yang mengandung 4 mM PMSF (1:5)

divortex selama
Divortex 10 menit
selama 10 menit

Disonifikasi 2 x 10 menit

Disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm. Selama 10 menit (2x) pada


suhu 4o C
Dibuang pelletnya yang diambil substratnya

Ditambahkan dengan absolut dengan perbandingan 1:1

Dimasukkan dalam refrigenator selama 24 jam

Dimasukkan dalam refrigenator selama 24 jam

Disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm. Selama 10 menit (2x) pada


suhu 4o C

Etanol absolut dibuang kemudian ekstrak dikeringkan selama overnight

Disimpan dalam suhu -20%

Disonifikasi 2 x 10 menit

Dilihat isolat proteinnya pada nanodrop

Elektroforesis Protein
1. Pembuatan separating gel 12,5 %

Bahan separating gel dicampurkan ke dalam tabung falcon dengan


menggunakan mikropipet
Larutan separating gel dimasukkan ke dalam rangkaian plate
elektroforesis yang akan digunakan

Aquades diberikan di atas gel separating agar membentuk permukaan gel


yang rata

Gel ditunggu sampai mengeras

Gel ditunggu sampai mengeras

Aquades dikeluarkan dengan menggundakan tisu

Aquades dikeluarkan dengan menggunakan tisu

2. Pembuatan separating gel 3 %

Bahan separating gel dicampurkan ke dalam tabung falcon dengan


menggunakan mikropipet

Larutan stacking gel dimasukkan ke dalam rangkaian plate elektroforesis


yang akan digunakan

Sisir elektroforesis dipasang untuk membentuk sumuran sebagai tempat


memasukkan isolat protein

Gel ditunggu sampai mengeras


Sisir elektroforesis dilepaskan dari gel.

Gel yang telah mengeras diletakkan ke dalam chamber elektroforesis.

3. Running Elektroforesis

Larutan running buffer dituang ke dalam chamber elektroforesis

Isolat protein dan larutan RSB dimasukkan ke dalam tabung eppendrof

Isolat yang sudah dipanaskan dimasukkan ke dalam sumuran gel

Running elektroforresis adalah voltage 130 V, kamir 100% kuat arus 60


mA

Rangkaian elektroforesis dilepas dan hasilnya dimasukkan ke dalam


plastik

Larutan staining dimasukkan juga sampai roting

Larutan staining dibuang dan dimasukkan ke dalam destaining dan


dishaking overnight

Larutan staining dimasukkan juga sampai roting


BAB IV

PEMBAHASAN

4.1 Kesulitan atau Hal yang perlu diperhatikan

a. Teknik pipeting

Karena masih pemula jadi belum begitu terampil dalam teknik pipetung sehingga
dalam pengambilan larutan masih berbusa jadi ukuran larutan yang diambil kurang
akurat. Selain itu pada tahap elektrosesis saat memasukkan pada sumuran juga masih
sulit sehingga cairan ada yang keluar dari sumuran.

b. Ketelitian Praktikan

Dalam hal menaruh sampel yang berisi isolate protein lebih diperhatikan dengan hati-
hati lagi agar isolate tidak rusak sehingga saat proses elektroforesis DNA dapat
berhasil menghasilkan pita pita DNA.

4.2 Fungsi Alat dan Bahan

No Nama Alat Fungsi


.
1. Lemari es / feezer Menyimpan sampel, bahan
isolasi dan bahan PCR
2. Tray dan comb Mencetak agarose
3. Vertical elektroforesis Elektroforsis hasil PCR
4. Kaca akrilamida Mencetak gel poliakrilamida
5. Magnetic stirer Menghomogenkan larutan
6. Gloves Mengurangi kontaminasi dari
tangan
7. Botol Duran Menyimpan larutan
8. Mikrosentrifuge Memisahkan molekul menurut
berat jenis
9. Vortex Menghomogenkan larutan

No. Nama Bahan Fungsi


1. SDS berfungsi untuk mendenaturasi protein karena SDS bersifat
sebagai deterjen yang mengakibat ikatan dalam protein terputus
membentuk protein yang dapat terelusi dalam gel begitu juga
mercaptoetanol.
2. Ammonium persulfate berfungsi sebagai inisiator yang mengaktifkan akrilamida agar
bereaksi dengan molekul akrilamida yang lainnya membentuk
rantai polimer yang panjang.
3. TEMED berfungsi sebagai katalisator reaksi polimerisasi
akrilamid menjadi gel poliakrilamid sehingga dapat digunakan
dalam pemisahan protein.
4. Bisakrilamida berfungsi sebagai crosslinking agen yang membentuk kisikisi
bersama polimer akrilamida
5. Protein marker digunakan untuk mengidentifikasi berat molekul dari
campuran polypeptida (Hames dan Rickwood, 1990). Marker
protein yang digunakan memiliki rentang beratmolekul 15 kDa
- 250 kDa.
6. Brom Fenol Blue Berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul
DNA pada gel.
7. Aquades Melepaskan gel poliakrilamid
8. Air deion Pelarut yang tidak mengandung ion
9. Gel polikarilamid Media untuk mengelektroforesis
10. Sodium Dedocyl Memberikan ikatan negative pada protein sehingga
Sulfate (SDS) 10% menjadikannya berbentuk linear
11. Etanol absolute dingin Mengurangi kelarutan rotein dalam buffer, untuk proses
presipitasi protein
12. EDTA berfungsi sebagai penghancur sel dengan cara mengikat ion
magnesium yang diperlukan oleh sel untuk menjaga keutuhan
selubung sel secara keseluruhan.
13. NaCl berfungsi sebagai bahan penetral pada gula fosfat DNA
14. Larutan PBS-T sebagai detergen yang digunakan untuk memisahkan ikatan
protein dan fosfolipid pada membran spermatozoa.
15. Tris Cl Sebagai larutaan penyangga (buffer)
16. PBS Larutan pencuci, garam fisiologis
17. PMSF Untuk menjamin agar sel protein yang diperoleh tidak
dihirolisis oleh enzim proteolitik.
18. Separating gel Menghasilkan profil protein dengan berat molekul pada kisaran
6-200 kDa
19. Stacking gel Untuk mengelompokkan protein dengan berat molekul berbeda
20. RSB (Reducing Sample Membantu memecah ikatan-ikatan protein
Buffer)
21. Gliserol 25 % Sebagai pemberat
22. -mecaptoethanol Memotong ikatan
23. Larutan staining buffer Pemberiwarna pada pita-pita protein
24. Larutan destaining Sebagai pelarut warna yang berlebihan dari larutan staining
buffer

4.3 Pembacaan Hasil

Berdasarkan isolasi protein yang telah dilakukan oleh kelompok 3 hari Rabu
didapatkan hasil bahwa membran spermatozoa sapi sebanyak 1899 mg/mL.

Pada Elektroforesis protein terjadi pemisahan komponen atau molekul


bermuatan berdasarkan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.
Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang
akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan
listrik yang ada pada makromolekul yang bermuatan negatif. Jika
makromolekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui satu medium
kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang bermuatan
berlawanan maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub
positif. Secara umum elektroforesis protein digunakan untuk memisahkan
fragmen protein. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah
muatan terhadap massanya (Johnson, 2007).

BAB V

PENUTUP
5.1 Kesimpulan

1. Isolasi protein dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan protein dari bahan
lain seperti lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi protein ada
tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan protein dari bahan
padat seperti selulosa, serta pemurnian protein.
2. Elektroforesis protein merupakan suatu teknik pemisahan molekul seluler
berdasarkan atas ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang
dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan
dipisahkan.

Daftar Pustaka
Arif, Muhamad. 2012. PROFIL SDS-PAGE OUTER MEMBRANE PROTEIN
Porphyromonas gingivalis (Penelitian Observasional Analitik in vitro).
Skripsi. Bagian Periodonsia Fakultas Kedokteran Gigi. Universitas Jember.
Bangun, Seri Rayani, & Lubis, Ichwan Alamsyah. Laporan Praktikum Isolasi Dna
Dari Darah Dan Ephitel,Pcr,Elektroforesis Agarose Dan Sds-Page.
Dewi, Dian Puspita, Handayani, Nursasi, Lestari, Umie. Analisis Protein Membran
Spermatozoa Sapi Madura, Sapi Simental Dan Sapi Limousin Sebagai
Pendekatan Hubungan Kekerabatan Sapi. Universitas Negeri Malang.
Garner DLE, Hafez SE. 2000. Sperm and Seminal Plasma. In: B Hafez & ESE Hafez.
Reproduction in farm animal. 7th ed. Lippincott Williams & Wilkins. USA.
hlm. 96-109.
Johnson, M. H. and Everitt, B. J. 2007. Essential Reproduction. Sixth Edition.
Garshington Road UK: Blackwell Publishing.
Lestari, Umie. 2008. Karakterisasi Dan Spesifikasi Protein Membran Spermatozoa
Manusia Dan Antibodi Hasil Induksinya Untuk Pengembangan Kandidat Bahan
Imunokontrasepsi. Disertasi Tidak Diterbitkan. Malang: Pasca Sarjana
Universitas Brawijaya Malang.
Lubis, Nita Andriani dan Gurusinga, Fery Prawira. 2013. Laporan Praktikum Isolasi
DNA Manusia (Epitelial Mulut dan Darah) Dan Teknik PCR dan Isolasi
Protein dari Darah, Elektroforesis Agarose dan SDS-PAGE.
Marques, V. A., Goulart, L.R. and Silva, A. E. D. F. 2000. Variation of Protein
Profiles and Calcium and Phospholipase A2 Concentration in Thawed Bovine
Semen and Their Relation to Acrosome Reaction. Genetics and Molecular
Biology 23(4): 825-829
Nadgas, S.K., Buchanan, T. and MCCashill, S., Mackey, J., Alvarez, G. E. and
Raychoudhury, S. 2013. Isolation of a Calcium Binding Protein of Acrosomal
Membrane of Bovine Spermatozoa. Int J Biochem Cell Biol 45(4): 876-884
Rondena, M., Ceciliani, F., Comazzi, S., Pocacqua, V., Bazocchi, C., Luvoni, C.,
Chigioni, S. and Paltrinieri, S. 2006. Identification of Bovine Doppel Protein in
Testis, Ovary and Ejaculated Spermatozoa. Theriogenology (63): 1195-1206
Yu, Yang. 2008. The Identification and Characterization of an Inner Acrosomal
Membrane Associated Protein, IAM38, Responsible for Secondary Sperm-Zona
Binding During Fertilization. Thesis tidak diterbitkan. Canada: Queens
University Press.
Zahn FS, Papa FO, Melo CM. 2006. Blood Serum. Seminal plasma and sperm
membrane protein profiles in stallions; are they corelated to semen freezability?.
Anim Reprod Sci. 94:64-66.