Anda di halaman 1dari 13

ISOLASI DNA DARI BUAH ALPUKAT DAN

ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA


SEMESTER GANJIL 2016/2017

PRAKTIKAN :
KELOMPOK II
AHMAD HANIF FAHRUDY 1147040003
ANITA HALIMAH 1147040012
DESI DWI WULANDARI 1147040019
KHAIRILLA AULIA RAHMA 1147040035

Tanggal praktikum : Rabu, 30 November 2016


Tanggal laporan : Jumat, 23 Desember 2016

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SUNAN GUNUNG DJATI
BANDUNG
2016
A. TUJUAN
Mengidentifikasi hasil isolasi DNA dari buah alpukat.
Menentukan absorbansi DNA pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
Mengidentifikasi kemurnian DNA hasil isolasi.
B. PRINSIP DASAR
Prinsip percobaan pada isolasi DNA dan elektroforesis adalah sebagai berikut:
Isolasi DNA: terdapat 3 prinsip utama dalam isolasi DNA, yaitu lisis, ekstraksi,
serta purifikasi. Lisis yaitu mencecah dan mengekstraksi jaringan tersebut
sehingga akan terbentuk ekstraksi sel yang terdiri dari DNA dan substansi lainnya.
Hasil ekstraksi sel selanjutnya dipisahkan karena hanya dibutuhkan DNA nya saja.
Proses pemisahan menggunakan teknik sentrifugasi, di mana prinsipnya yaitu
memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan
gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di bagian bawah,
dan molekul yang lebih ringan berada di bagian atas.
Pemurnian DNA dengan metode presipitasi, di mana DNA dipisahkan dari
larutannya dengan mencampurkannya dengan suatu bahan yang tak dapat
melarutkannya, sehingga ia memisah/terpresipitasi.
Elektroforesis gel agarosa yaitu pemisahan DNA berdasarkan perbedaan medan
listrik. Molekul DNA yang bermuatan negatif akan tertarik ke arah elektroda yang
bermuatan positif.
C. ALAT DAN BAHAN
1) NAMA ALAT
No. Nama alat Jumlah

1 Alat elektroforesis 1 buah

2 Power supply 1 buah

3 Lampu UV 1 buah

4 Gelas kimia 100 ml 2 buah

5 Batang pengaduk 1 buah

6 Tabung reaksi 2 buah

7 Sarung tangan 1 pasang

8 Pipet tetes 2 buah

2) NAMA BAHAN
No. Nama bahan Jumlah

1 Alpukat 1 buah

2 Detergen cair 10 ml

3 NaCl 3 gram

4 Etanol 9 gram
D. PROSEDUR
ISOLASI DNA DARI BUAH ALPUKAT
Buah alpukat disiapkan, diambil dagingnya dan dihaluskan dalam mortar,
ditumbuk dengan menggunakan alu. Setelah halus, ditimbang sebanyak 10 gram
dan dimasukkan ke dalam gelas kimia. NaCl sebanyak 3 gram ditambahkan ke
dalam gelas kimia berisi alpukat, lalu ditambahkan 10ml detergen cair kemudian
diaduk campuran tersebut menggunakan batang pengaduk. Setelah itu campuran
ditambah aquades hingga volume total campuran menjadi 100ml. Campuran
disaring dengan menggunakan kain kassa, hingga diperoleh filtrat campuran yang
kemudian didiamkan selama 10 menit. Filtrat dipipet sebanyak 6 ml kemudian
dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditambah 9ml etanol dingin. Diamati
perubahannya.
Gelatin yang diperoleh dimasukkan dalam tabung mikro dan didiamkan
selama 7 hari. Selanjutnya, gelatin yang telah disimpan selama 7 hari tersebut
diukur absorbansinya padapanjang gelombang () 260 nm dan 280 nm dengan
menggunakan spektrofotometer UV-VIS.

E. HASIL PENGAMATAN
PERLAKUAN HASIL PENGAMATAN

Alpukat dihaluskan dalam mortar, Alpukat halus berwarna hijau muda


ditumbuk dengan alu
Ditimbang sebanyak 10 gram, 10 gram alpukat halus berwarna hijau
dimasukkan dalam gelas kimia muda

Ditambah 3gram NaCl Campuran hijau kental

Ditambah 10 ml detergen cair, diaduk Campuran hijau kental, berbusa dan


wangi

Ditambah aquades hingga volume larutan Campuran hijau muda, cair sedikit
menjadi 100 ml berbusa dan wangi

Disaring dengan kain kassa Filtrat : hijau muda pucat


Residu : endapan berwarna hijau

Filtrat didiamkan selama 10 menit Larutan hijau muda pucat

Filtrat dipipet 6ml dan ditambah 9ml Terdapat 2 fasa


etanol dingin Fasa atas: larutan tidak berwarna
Fasa bawah: larutan hijau muda pucat

Didiamkan selama10 menit Terbentuk gelatin berwarna putih yang


berada dipermukaan larutan

Gelatin dimasukkan dalam tabung mikro Gelatin berwarna putih

Ditambah aquades Larutan putih keruh

Didiamkan selama 7 hari Larutan tidak berwarna

Diukur absorbansinya pada =260 dan Abs pada 260 = 10 A


=280 Abs pada 260 = 10 A
F. PEMBAHASAN
Khairilla Aulia Rahma (1147040035)
Pada percobaan ini dilakukan isolasi DNA untuk mengidentifikasi DNA yang
terkandung dalam buah papaya, pengamatan lebih lanjut dengan isolasi DNA dapat
mengidentifikasi jumlah pang basa, urutan basa nitrogen yang tersusun dan
pengamatan lainnya, namun pada percobaan kali ini hanya dilakukan analisa
kualitatif dan penetuan DNA yang diisolasi memiliki kualitas yang baik atau tidak
dalam proses isolasinya.
Langkah awal percobaan ialah, mengisolasi DNA dari dalam sel lebih tepatnya
di dalam nucleus, secara garis besar tahapan isolasi terbagi menjadi tiga yaitu melisis
atau menghancurkan, pemurnian larutan atau purifikasi dan presipitasi atau
pengendapan. Tahapan purifikasi adalah pemurnian larutan karena setelah sel dilisis
seluruh komponen sel akan bercampur satu sama lain, sehingga diperlukan
penambahan bahan kimia lain untuk menonaktifkan enzim dan menghilangkan
protein dari nukleus karena praktikan tidak akan menggunakan DNA yang diperoleh
untuk tujuan eksperimen khusus.
Tahapan pertama ialah melisis atau menghancurkan sel dengan cara mekanik
maupun kimiawi, karena untuk mengekstraksi DNA, dinding sel (jika ada), membran
sel, dan membran nukleus harus dihancurkan terlebih dahulu sehingga DNA dapat
keluar dan diketahui massa yang diperolehnya. Secara mekanik, proses
penghancuran dilakukan dengan menumbuk dan menghaluskan daging buah alpukat,
tujuan penghalusan ialah untuk mendegradasi dinding sel yang merupakan struktur
paling luar dari sel tumbuhan. Selain itu, penggerusan juga bertujuan untuk
memisahkan sel yang satu dengan lainnya sehingga memberikan hasil yang lebih
baik pada proses ekstraksi selanjutnya. Kemudian proses penghancurkan secara
kimiawi dilakukan dengan penambahan garam NaCl ke dalam buah alpukat yang
telah dihaluskan.
NaCl berfungsi untuk presipitasi protein dan karbohidrat yang terdapat dalam
sel. Sehingga keberadaan biomolekul besar dapat dihilangkan dan dapat diperoleh
filtrat DNA yang murni. Garam juga digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion
Na+ yang dikandung oleh NaCl mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan
kutub negatif posfat DNA, yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul
saling tolak menolak satu samalain sehingga adanya kesetimbangan dalam DNA,
ketika ditambahkan garam maka ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif
posfat DNA. Proses tersebut mempermudah pemekatan dan pengumpulan massa
DNA pada proses presipitasi DNA
DNA di dalam nukleus menjadi terurai. Namun, untuk dapat keluar dari sel,
membran sel harus didegradasi terlebih dahulu. Penambahan detergen dapat
menghancurkan dinding sel tumbuhan sehingga komponen sel dapat keluar termasuk
DNA. Mekanisme khusus degradasi dindings sel oleh detergen yaitu sisi hidrofilik
pada deterjen akan mengikat sisi protein yang bersifat hidrofilik dan sisi hidrofobik
detergen akan mengikat lipid dan sisi hidrofobik protein sehingga membentuk
senyawa lipid protein-deterjen kompleks. Peristiwa inilah menyebabkan interaksi
polar yang menyatukan membran sel, sehingga membran sel pun terdegradasi/lisis.

Gambar 1.1 sisi hidrofobik pada molekul detergen akan mengikat sisi hidrofobik protein(dan
komponen hidrofobik lain pada membran sel), demikian pula dengan sisi hidrofilik, sehingga
terbentuklah lipid-protein-detergen kompleks.
( Genetech Foundation for Biomedical Sciences, 2001)

Selanjutnya penambahan aquades dan pengadukan dilakukan untuk


mempercepat proses penghancuran membran sel, maka setelah detergen dituang,
perlu dilakukan homogenisasi antara gerusan buah dan larutan detergen. Oleh
karena itu, campuran kedua keduanya lalu ditambahkan aquades dan diaduk
perlahan. Campuran disaring dengan menggunakan kasa. Fungsi proses filtrasi ini
ialah untuk mengumpulkan larutan yang kaya akan DNA dan untuk memisahkannya
dari sisa-sisa sel dan jaringan lainnya pada buah yang kemudian akan dibuang.
Untuk mempermudah proses penyaringan, maka larutan terlebih dahulu didiamkan
selama 5-10 menit agar molekul dengan massa terbesar dapat mengendap di dasar.
Filtrat dipipet dan ditambah etanol dingin agar larutan yang berbagai
komponenenya mulai terpisah tidak menyatu kembali. Setelah beberapa saat, maka
akan segera terlihat bahwa ethanol berada di atas lapisan atas, sementara filtrat
berada di dasar, hal ini terjadi karena ethanol memiliki densitas(kerapatan) yang
lebih kecil dibandingkan air. Kemudian, setelah diamati selama 10 menit, terlihat
adanya kumpulan benang-benang putih yang melayang-layang ke permukaan
tabung reaksi. Kumpulan benang-benang putih tersebut ialah DNA yang
terpresipitasi dari filtrat. DNA dapat memisah dari larutan campuran
(ethanol+filtrat) karena DNA tidak larut dalam etanol.
Langkah selanjutnya untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA yang
diperoleh adalah denganmenggunakan spektrofotometer UV. Berdasarkan literature
pada panjang gelombang 260 nm untaian tunggal DNA memiliki koefisien absorbsi
0,027 dan untaian ganda untuk DNA 0,02. Radioabsorbsi 260/280 nm dapat
digunakan untuk mengetahui adanya kontaminan protein. Protein memiliki
absorbansi maksimum pada 280 nm, dan absorbansi maksimum DNA pada 260 nm.

Berdasarkan hasil pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan


280 nm, didapat nilai absorbansinya masing-masing 10 A. Hasil absorbansi yang
sangat besar ini kemungkinan terjadi karena adanya zat lain yang mengkontaminasi
sampel sehingga DNA tidak dapat terukur dengan baik. Wujud DNA yang
dihasilkantidakberupa benang-benang melainkanberupa serbuk dan kemungkinan
terbawanya etanol saat pengukuran dengan spektrofotometer.
Sampel DNA yang murni memiliki rasio 260/280 nm sebesar 1,8-1,9, hasil
yang diperoleh dari percobaan ini didapat rasio sebesar 1. Rasio ini berada di bawah
1,8 yang menandakan adanya ketidakmurnian yang signifikan yang msih tertinggal
di dalam sampel. Sampel DNA yang murni memilikirasio 260/280 nm sebesar 1,8-
1,9 Jika rasio tersebut di bawah 1,8 berarti ada ketidakmurnian yang signifikan yang
masih tertinggal di dalam sampel.
Ahmad Hanif Fahrudy (1147040003)
Pada percobaan ini, dilakukan isolasi DNA dari buah alpukat. Buah alpukat dipilih
untuk diisolasi DNA-nya karena buah alpukat memiliki tekstur yang lembut, sehingga
mudah untuk dihancurkan dan dihaluskan.
Langkah pertama yaitu penghancuran alpukat dengan cara menghaluskannya
dengan menggunakan cawan dan alu. Pada sel tumbuhan terdapat dinding sel yang
melindungi sel tersebut sehingga sampel buah dihaluskan sehalus mungkin untuk
merusak sel dan juga memisahkan sel yang satu dengan yang lainnya sehingga
memberikan hasil yang lebih baik pada proses selanjutnya.
Penambahan garam NaCl pada sampel dilakukan untuk menguraikan protein-
protein yang mengikat DNA sehingga DNA dapat terurai, juga memisahkan karbohidrat
(polisakarida) yang terkandung dalam sampel. Penambahan garam juga dapat membantu
proses presipitasi DNA. ion Na+ dari NaCl akan memasuki membran sel secara difusi
dan memasuki nukleus melalui pori-pori nukleus. Ion Na+ pada garam dapat mengikat
ion fosfat yang bermuatan negatif pada DNA, sehingga molekul-molekul yang memiliki
muatan yang sama(negatif) dan bersifat polar kini tidak lagi saling tolak menolak karena
tidak lagi bermuatan (netral) atau non polar. Proses tersebut mempermudah pemekatan
dan pengumpulan massa DNA pada proses presipitasi DNA.
Meskipun DNA di dalam nukleus terpisah, DNA masih berada di dalam sel. Agar
DNA dapat keluar dari dalam sel, membran sel harus didegradasi terlebih dahulu.
Membran sel tersusun atas fosfolipid, protein, glikogen, dan kolesterol. Komponen-
komponen membran sel tersebut ada yang bersifat hidrofilik (glikoprotein, protein
ekstrinsik, dan kepala fosfolipid), dan yang bersifat hidrofob (kolesterol, sebagian
protein intrinsik, dan ekor fosfolipid). Oleh karena itulah diperlukan detergen yang dapat
mendegradasi membran sel melalui mekanisme khusus (detergen memiliki gugus
hidrofilik dan gugus hidrofob). Sisi hidrofilik pada detergen akan mengikat sisi protein
yang bersifat hidrofilik dan sisi hidrofob detergen akan mengikat lipid sehingga
membentuk senyawa lipid protein-deterjen kompleks. Peristiwa ini menyebabkan
interaksi polar yang menyatukan membran sel, sehingga membran sel pun
terdegradasi/lisis.
Penambahan akuades dan pengadukan dilakukan untuk mempercepat proses
penghancuran membran sel. Warna larutan yang hijau setelah pengadukan menandakan
bahwa larutan telah homogen.
Setelah homogen, larutan disaring untuk memisahkan larutan yang kaya DNA dari
sisa-sisa sel dan jaringan lainnya pada buah alpukat. Larutan kemudian didiamkan
selama 10 menit dan ditambah etanol dingin. Etanol digunakan untuk memurnikan
DNA. Setelah didiamkan selama beberapa menit, terlihat lapisan DNA berwarna putih
pada larutan. DNA dapat terpisah dari etanol karena DNA tak larut dalam etanol.
DNA merupakan senyawa polar karena memiliki muatan negatif dari gugus rangka
fosfatnya. Etanol memiliki tingkat kepolaran yang lebih rendah dari pada air. Artinya,
penambahan etanol pada larutan DNA akan mengacaukan penyaringan muatan oleh air.
Jika ethanol dalam jumlah memadai ditambahkan , maka daya tarik antara fosfat dan
beberapa ion positif yang terlarut (contohnya ion Na+ dari NaCl yang telah ditambahkan
sebelumnya) menjadi cukup kuat untuk membentuk ikatan ion yang stabil dan
mempresipitasikan/ memisahkan DNA. Hal ini umumnya terjadi jika jumlah ethanol
telah mencapai 64% dari volume larutan, dan mekanisme tersebut mengharuskan adanya
ion positif yang terlarut. Ion positif yang terlarut di sini yaitu Na+ pada NaCl yang telah
ditambahkan sebelumnya.
Suhu etanol yang dingin berperan dalam mempermudah proses pemekatan DNA.
Semakin dingin suhu etanol, maka DNA yang terkumpul dan terpresipitasi akan semakin
banyak. Walaupun DNA yang terkumpul sangat banyak, kita tidak akan dapat melihat
DNA dalam susunan double helix meskipun dilihat dengan mikroskop elektronik
sekalipun, karena susunan double helix DNA hanya gambar mikrograf saja.
Berdasarkan hasil pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan
280 nm, didapat nilai absorbansinya masing-masing 10 A. Hasil absorbansi yang sangat
besar ini dapat terjadi karena kesalahan konfigurasi alat, baik software UV-Vis maupun
hardwarenya, sehingga spektrofotometer tidak dapat mengukur absorbansi sesuai dengan
konsentrasi sampel DNA.
Dilakukan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 260 nm yaitu karena
panjang gelombang tersebut adalah panjang gelombang maksimum pada absorpsi DNA,
sedangkan panjang gelombang 280 nm adalah panjang gelombang maksimum pada
absorpsi protein.
Untuk mengidentifikasi kemurnian protein, dapat dihitung nilai absorbansi pada
260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 nm. Rentang kemurnian DNA yaitu 1,8-2,0.
Jika nilai melebihi 2,0 maka larutan yang diuji masih mengandung kontaminan dari
protein membran/ senyawa lainnya sehingga kadar DNA plasmid yang didapat belum
murni. Jika kurang dari 1,8 maka kandungan air yang diambil terlalu banyak sedangkan
DNA yang diambil terlalu sedikit.
Berdasarkan data absorbansi sampel buah alpukat ini, didapat nilai kemurnian
DNA yaitu 1,0 sehingga DNA kurang murni karena terlalu banyak air dan terlalu sedikit
DNA yang diambil.
G. KESIMPULAN

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa:


DNA dari buah alpukat dapat diisolasi. DNA berbentuk gel yang berwarna putih
kehijauan.
Absorbansi pada panjang gelombang 260 nm maupun 280 nm yaitu 10 A.
Nilai kemurnian DNA yaitu 1,0 sehingga DNA kurang murni karena terlalu
banyak air dan terlalu sedikit DNA yang diambil.

DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2016. DNA. https://id.wikipedia.org/wiki/Asam_deoksiribonukleat diakses
pada 6 Desember 2016 pukul 23.07 WIB.
Harton, Robert. 2006. Principles of Biochemistry. New Jersey: Prentice Hall.
Leihninger. 2013. Principles of Biochemistry. New York: W. H. Freeman.
Poedjiadi, Anna. 2006. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: UI Press.
Rosahdi, TD. Penuntun Praktikum Biokimia. Bandung: Universitas Islam Negeri Sunan
Gunung Djati Bandung.