Anda di halaman 1dari 13

LAPORAN PRAKTIKUM

ELEKTROFORESIS

Mata Kuliah Epidemiologi molekuler


Dosen Pengampu:Dr. rer. nat. Anto Budiharjo, M. Biotech.

Nama : Dewi wulansari


NIM : A2A215021
Hari/Tanggal : 15 November 2016
Asisten : Waheni Rizki Aprilia

FAKULTAS KESEHATAN MASYARAKAT


UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SEMARANG
2016

1
ACARA IV
ELEKTROFORESIS

I. Tujuan
Mahasiswa mampu melakukan isolasi DNA bakteri, lisis sel, purifikasi dan
presipitasi DNA dengan benar, serta mampu mengamplifikasi fragmen DNA dan
menvisualisasikan produk PCR dengan benar.
II. Tinjauan Pustaka
2.1 Gel Elektroforesis
Elektroforesis gel adalah pemisahan asam nukleat atau protein di
dalam medan listrik melalui media gel. DNA merupakan molekul bermuatan
listrik negative, dan apabila ditempatkan pada medan listrik akan bermigrasi
ke kutub positif. Kecepatan migrasi DNA tergantung pada dua factor yaitu
bentuk dan muatan listrik.
Ukuran molekul DNA akan dapat dibedakan pada elektroforesis
menggunakan gel. Gel biasanya terbuat dari agarose akan membentuk
kerangka lubang-lubang yang mampu dilewati DNA menuju electrode positif.
Makin kecil molekul DNA makin cepat migrasinya melewati gel. Oleh karena
itu elektroforesis gel mampu memisahkan molekul DNA sesuai ukurannya.
Elektroforesis selain menggunakan agarose juga mampu menggunkan
poliakrilamide.
2.2 Elektroforesis
Elektroforesis adalah pemisahan molekul bermuatan listrik di dalam
medan listrik. Elektroforesis merupakan proses migrasi molekul bermuatan
dalam medium yang dialiri arus listrik (Holme dan Hazel, 1998). Westermeier
(2005) menjelaskan bahwa prinsip dasar elektroforesis adalah molekul dan
partikel bermuatan akan bergerak ke arah elektrode yang memiliki muatan
berlawanan di bawah pengaruh medan listrik. Laju migrasi molekul bermuatan
tersebut menuju elektrode yang bermuatan negatif disebut elektromobilitas.
Elektromobilitas suatu molekul dipengaruhi oleh beberapa faktor,
sebagaimana yang dijabarkan oleh Switzer (1999) bahwa semakin besar
muatan molekul maka semakin besar pula elektromobilitasnya, nilai
elektromobilitas berbanding terbalik dengan besar ukuran molekul sehingga
molekul dengan ukuran lebih besar memiliki elektromobilitas yang lebih kecil

2
bila dibandingkan dengan molekul yang berukuran lebih kecil. Selain besar
muatan dan ukuran molekul tersebut, topologi atau bentuk molekul turut
berpengaruh pula terhadap elektromobilitas suatu molekul. Elektroforesis
DNA umumnya menggunakan metode elektroforesis gel agarosa (Karp, 2008).
Metode elektroforesis tersebut pada prinsipnya melibatkan fase stasioner yang
berupa gel agarosa dan fase gerak berupa buffer Tris-acetate EDTA (TAE) atau
Tris-borat EDTA (TBE) (Switzer, 1999). TBE (Tris-borat EDTA) 1X,
Tris/Borat merupakan buffer yang umum digunakan sebagai buffer
elektroforesis karena memiliki kapasitas buffering yang tinggi pada titik
isoelektriknya (Ausubel, et al., 2003). Borat bertindak sebagai conducting ion
sehingga dapat mempertahankan kesetimbangan ion H+ dan OH- yang
dihasilkan oleh elektrode, hal ini berhubungan dengan fungsi buffer dalam
menjaga kesetimbangan pH saat migrasi fragmen DNA berlangsung,
perubahan pH dapat mendenaturasi struktur DNA sehingga merubah
elektromobilitas DNA (Martin, 1996).
2.3 Alat dan Bahan untuk elektroforesis
2.3.1 Alat
a. Satu set alat elektroforesis

b. Mikropipet dan tip


Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan yang
bervolume cukup kecil, biasanya kurang dari 1000 l. Banyak
pilihan kapasitas dalam mikropipet, misalnya mikropipet yang
dapat diatur volume pengambilannya (adjustable volume
pipette) antara 1 l sampai 20 l, atau mikropipet yang tidak
bisa diatur volumenya, hanya tersedia satu pilihan volume
(fixed voume pipette) misalnya mikropipet 5l. Dalam
penggunaannya mikropipet memerlukan tip.

3
c. Parafilm
Parafilm adalah plastik berbahan wax yang diciptakan
untuk penggunaan laboratorium(Aungst,2004). Parafilm biasa
digunakan untuk membungkus atau melindungi bejana (seperti
flask atau kuvet). Parafilm dapat direntangkan, dapat dibentuk,
tahan air, antibau, termoplastik, semitransparan, dan dapat
melekat sendiri. parafilm juga dapat digunakan untuk
membungkus kontainer untuk menjaga kelembaban pada
penyimpanan jangka panjang. Karena sifatnya yang
termoplastik maka parafilm tidak dapat dipakai di dalam
autoklaf (Anonim, 2009).
Gambar
d. Vortex Mixer Maxi mix plus
Vortex mixer adalah alat yang digunakan untuk
mencampur larutan yang ada dalam tabung reaksi. Alat ini
terdiri dari sebuah motor listrik dengan drive shaft berorientasi
vertikal dan melekat pada sepotong karet. Ketika tabung reaksi
atau wadah lain yang sesuai ditekan pada cangkir karet vortex
mixer maka gerak akan ditransmisikan ke dalam cairan dan
terbentuk pusaran. Vortex mixer juga merupakan alat yang
digunakan untuk menghomogenkan larutan atau medium cair
dengan menggunakan wadah tabung reaksi. Prinsip kerjanya
hanya dengan mengaktifkan alat dan tekan tabung yang berisi
larutan ke permukaan vortex, secara otomatis vortex akan
menghomogenkan larutan yang ada didalam tabung reaksi.
(Koesmadja, 2006)
Gambar

4
e. Laminar Air Flow
Biological Safety Cabinet (BSC) atau dapat juga disebut
Laminar Air Flow (LAF) adalah alat yang berguna untuk
bekerja secara aseptis karena BSC mempunyai pola pengaturan
dan penyaring aliran udara sehingga menjadi steril dan
aplikasisinar UV beberapa jam sebelum digunakan .
Gambar

f. Microtube
Microtube adalah alat yang digunakan untuk tempat sampel
atau larutan agar sampel tetap terjaga kesterilannya.

g. Centrifuge
Sentrifugasi ialah proses pemisahan partikel
berdasarkan berat partikel tersebut terhadap densitas layangnya
(bouyant density). Dengan adanya gaya sentrifugal maka akan
terjadi perubahan berat partikel dari keadaan normal pada 1 xg
(sekitar 9,8 m/s2) menjadi meningkat seiring dengan kecepatan
serta sudut kemiringan perputaran partikel tersebut terhadap
sumbunya.

5
Pada pemisahan, partikel yang densitasnya lebih tinggi
daripada pelarut turun (sedimentasi), dan partikel yang lebih
ringan mengapung ke atas. Perbedaan densitas yang tinggi,
membuat partikel bergerak lebih cepat. Jika tidak terdapat
perbedaan densitas (kondisi isoponik), partikel tetap setimbang.
Pemisahan sentrifugal menggunakan prinsip dimana
objek diputar secara horizontal pada jarak tertentu. Apabila
objek berotasi di dalam tabung atau silinder yang berisi
campuran cairan dan partikel, maka campuran tersebut dapat
bergerak menuju pusat rotasi, namun hal tersebut tidak terjadi
karena adanya gaya yang berlawanan yang menuju kearah
dinding luar silinder atau tabung, gaya tersebut adalah gaya
sentrifugasi.
Gaya inilah yang menyebabkan partikelpartikel
menuju dinding tabung dan terakumulasi membentuk endapan.
Ada beberapa fungsi sentrifugal dalam pemisahan
bioteknologi. Ini tercantum di bawah ini:
1. Pemisahan (padat/cair, padat/cair/cair dan
padat/padat/cair) Sentrifugasidapat digunakan untuk
pemisahan padatcair menyediakan padatan berat dari
cairan.
2. Centrifuge juga dapat digunakan untuk memisahkan fase
berat, dan dua fasa cair ringan, dengan salah satu fase
ringan yang lebih ringan dari lainnya. Padatan dapat lebih
ringan dari cairan dan pemisahan adalah dengan flotasi
dari fase padat terdispersi.
3. Klasifikasi urutan berdasarkan ukuran dan densitas
4. Penebalan atau menghapus konsentrasi cair
5. Pemisahan kotoran dengan mencuci atau
pengenceran(repulping)

6
Gambar

h. Transluminator
UV Transilluminators digunakan untuk men-visual-kan
DNA setelah di loading atau running dalam DNA
elektroforesis. Prinsip kerja dari alat ini adalah sinar UV yang
dipancarkan akan memendarkan Ethidium bromide (EtBr) yang
menempel pada DNA. Sehingga visualisasi DNA bisa terlihat
lewat pancaran yang berwarna orange keputihan tersebut.
Gambar

i. Microwive
Microwave adalah sebuah gelombang elektromagnetik
dengan panjang gelombang antara 1 milimeter sampai 1 meter
dan berfrekuensi antara 300 megahertz sampai 300 gigahertz.
Gelombang mikro adalah gelombang elektromagnetik dengan
panjang gelombang mulai dari sepanjang satu meter sebagai
pendek sebagai satu milimeter, atau ekuivalen, dengan
frekuensi antara 300 MHz (0,3 GHz) dan 300 GHz [1]. Definisi
yang luas ini mencakup baik UHF dan EHF (gelombang
milimeter ), dan berbagai sumber menggunakan batas-batas
yang berbeda. [2] Dalam semua kasus, termasuk microwave

7
band SHF seluruh (3 sampai 30 GHz, atau 10 sampai 1 cm)
minimal, dengan teknik RF sering menempatkan batas bawah
pada 1 GHz (30 cm), dan bagian atas sekitar100GHz(3mm).

Gambar

2.3.2 Bahan
a. Bubuk agarose
Bubuk agar rose merupakan bahan yang digunakan untuk
membuat gel agarose.

b. Buffer TAE
Buffer TAE memiliki fungsi sebagai penyangga dan media
penghantar listrik yang tepat.
c. Et Br
EtBr merupakan larutan yang berfungsi sebagai pewarna agar
DNA berpendar saat visualisasi.
d. Control Positive
Control positive yang diperlukan untuk mengetahui reaksi
PCR berjalan baik atau tidak.
e. Control Negative
Control negative untuk mencegah kontaminasi pada PCR
f. Master Mix (Gotaq Polymerase)

8
Cara kerja praktikum PCR dimulai dengan pembuatan master
mix. Master mix dibuat dengan memasukkan bahan bahan
penyusunnya ke dalam sebuah tube.
g. DNA Template
Fungsi DNA template di dalam proses PCR adalah sebagai
cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang
sama.

h. Primer Forward
Primer Forward menginisiasi sintesis untai DNA dari ujung 5
------- 3.
i. Primer Reverse
Primer Reverse menginisiasi sintesis untai DNA dari ujung 3
------- 5.
j. loading dye
Loading dye berfungsi sebagai pemberat agar tidak keluar dari
sumuran.

III. Metode
3.1 Alat
3.1.1 Satu set alat elektroforesis
3.1.2. Mikropipet dan tip
3.1.3 Gel Doc
3.1.4 Parafilm
3.1.5 Thermal Cycler C1000
3.1.6 Vortex Mixer Maxi mix plus
3.1.7 Laminar Air Flow
3.1.8 Microtube
3.1.9 Centrifuge
3.1.10 Translumineter
3.1.11 Microwive
3.2 Bahan
3.2.1 Bubuk agarose
3.2.2 Buffer TAE
3.2.3 Et Br
3.2.4 Control Positive
3.2.5 Control Negative

9
3.2.6 Master Mix (Gotaq Polymerase)
3.2.7 DNA Template
3.2.8 Primer Forward
3.2.9 Primer Reverse
3.2.10 Control positif
3.2.11 Control negatif
3.2.12 ddH2O
3.2.13 Sampel
3.3 Cara Kerja
3.3.1 Siapkan alat dan bahan
3.3.2 Buat gel agarose terlebih dahulu, yaitu:
a. Campurkan bubuk agarose sebanyak 0,3 gr, dan TAE sebanyak 30
ml, kemudian masukkan ke dalam microwave dengan suhu 600C
selama 5-10 menit.
b. Tuangkan ke dalam cetakan yang ada sisirnya atau membuat
lubang(sumuran) pada gel.
c. Tambahkan EtBr (pewarna) agarv DNA berpendar saat divisualisasi
dengan UV Translumination. EtBr bisa diganti dengan florosafe/
good view.
d. Dinginkan larutan sampai menjadi gel yang padat.
e. Ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki.
f. Masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki
elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x
(pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE).
g. siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.
h. masukkan 2 jenis sampel DNA berupa sampel yang diencerkan dan
yang tidak diencerkan, tambahkan loading dye sebanyak 1l
secara merata di kertas parafilm
i. masukkan sampel yang sudah dicampurkan ke dalam UV
Translumination. Hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki
elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub
negatif berada di dekat sumuran; jika tidak demikian, ubahlah
posisi baki/gel ke arah sebaliknya).

10
j. Nyalakan sumber arus, aturlah volatase dan waktu running hingga
diperoleh angka 100V selama 30 menit.
k. Jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan
tombol run pada sumber arus.
l. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah
habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber
arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis.
m. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan
selubung kaca hitam di atas UV transluminator).
n. nyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang
tervisualisasi.
IV. Hasil dan Pembahasan
4. 1 Hasil

Berdasarkan hasil dari elektroforesis yang divisualisasi dengan UV


Transliminator dapat diperoleh hasil:
a. DB 1000 bs
b. DV 500 bs
c. AE 1000 bs
d. AE1 1000 bs

4.2 Pembahasan

11
Suhu anealing tidak sesuai, jadi ada sampel yang tidak terbaca hasilnya, yaitu sampel
tanaman. Gradient PCR untuk mengetahui suhu anealing harus optimal. DNA
Pengeliteran nyamuk hasilnya bagus. Ekstraksi DNA tergantung protokol :
a. PCR 10 20
b. Konsentrasi primer 10-20 mikromolar
c. Primer harus diencerkan.

Berdasarkan referensi dari penelitian yang dilakukan oleh Annisa Nur aini dalam judul
Pemurnian plasmid puc19 menggunakan kolom silika dengan Denaturan Urea dan
Petunjuk praktikum molekuler oleh Dr. rer. nat. Anto Budiharjo, M. Biotech, praktikum
ini tidak ada kesenjangan antara teori dan praktik.

V. Kesimpulan
1. Teknik pemisahan senyawa dengan elektroforesis gel agarose termasuk dalam jenis
elektroforesis zona dengan menggunakan teknik elektroforesis horizontal.
2. Elektroforesis memiliki prinsip kerja bahwa suatu molekul (DNA) yang bermuatan
negatif jika dialiri listrik akan bergerak menuju kutub positif milik elektroforesis
melalui matriks membran gel agarose.
3. Panjang fragmen DNA dapat terlihat dengan menggunakan gel doc yang pada saat
didalamnya disinari dengan menggunakan sinar UV, setelah sebelumnya dilakukan
tahap elektroforesis. Setelah itu panjang fragmen DNA dapat diukur menggunakan
kurva regresi linier.
4. Faktor yang mempengaruhi laju migrasi dari fragmen DNA pada elektroforesis gel
adalah ukuran molekul DNA, konsentrasi, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori
gel, voltase, dan larutan buffer elektroforesis. Selain itu ada faktor lain yang dapat
muncul sebagai yang mempengaruhi laju migrasi fragmen itu sendiri, yaitu ukuran
fragmen DNA dan faktor ketelitian serta kehati-hatian dalam proses penyimpanan
produk DNA jika produk tersebut sebelumnya disimpan.
5. Hasil dari Sampel DNA tanaman tidak begitu jelas terlihat, karena suhu anealing yang
kurang tepat, kemurnian dan konsentrasi pada saat ekstraksi DNA jg kurang tepat.

12
DAFTAR PUSTAKA

Nur, M. Anwar dan Adijuana, Hendara. 1989. Terknik Spektroskopi Dalam Analisis
Biologi. Bogor: Departemen Pendidikan dan Kebudayaan IPB.
Jusuf, Muhammad. 2001. Genetika I. Jakarta: CV. Sagung Seto.
Campbell, et al.(2004). Biologi edisi kelima jilid III. Jakarta : Erlangga.

Stansfield,William D. et. al., Biologi Molekuler Dan Sel, Jakarta: Erlangga, 2006.

Suryo. Genetika Strata 1. Yogyakarta:Universitas Gadjah Mada, 2011.

Yuwono, Triwibowo. 2007. Biologi Molekuler. Penerbit Erlangga: Jakarta

Achmadi, U.F., 2013. Dasar Dasar Penyakit Berbasis Lingkungan. Rajawali Pers.
Jakarta

Safar, Rosdiana. 2009. Parasitologi Kedokteran Protozoologi Helmintologi Entomologi.


Bandung : Yrama Widya.

Sumantri, Arif, 2010. Kesehatan Lingkungan dan Perspektif Islam. Cetakan Pertama.
Kharisma Putra Utama, Jakarta.

Slamet, JS. 2012. Kesehatan Lingkungan. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.

Budiharjo,A, Wulandari,D. 2016. Penuntun Praktikum Epidemiologi Molekuler.


Fakultas Kesehatan Mayaraktat Universitas Muhammadiyah Semarang : Semarang

13