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Aplicao da citometria de fluxo ao estudo do

genoma vegetal

Article January 2004

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2 authors:

Joo Loureiro Clayson Alan Dos Santos

University of Coimbra University of So Paulo
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Neo-allopatry. Invasive species as model systems for the study of the early stages of
allopatric speciation. View project

Hybridizing with a very fertile triploid deciduous azalea as the seed parent View project

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 Mtodos em Biotcnologia - Citometria de Fluxo I
Aplicao da Citometria de Fluxo ao estudo do
Genoma Vegetal
Joo Loureiro1,2, Conceio Santos1,3
1 Departamento de Biologia, Universidade de Aveiro
Laboratrio de Biotecnologia e Citmica Vegetal, Campus Universitrio de Santiago, 3810-193 Aveiro, Portugal
2 E-mail: jloureiro@bio.ua.pt
3 E-mail: csantos@bio.ua.pt
Resumo
A citometria de fluxo foi originalmente desenvolvida, no fim
dos anos 50, para a contagem e anlise de clulas sanguneas.
A hematologia e a imunologia celular foram indubitavelmen-
te as duas reas da Biologia que impulsionaram o desenvol-
vimento da tecnologia da citometria de fluxo (Crte-Real et
al. 2002). No entanto, com a natural evoluo tcnica e com
o aparecimento de novos marcadores fluorescentes, a utiliza-
o desta instrumentao generalizou-se a outras reas e a
estudos com outras clulas, como clulas vegetais e microbia-
nas (Doleel 1997a). No domnio das clulas vegetais, apesar
da utilizao da citometria de fluxo ter ocorrido apenas no
incio dos anos 80, o nmero de aplicaes tem aumentado
continuamente desde ento, sendo, hoje em dia, uma1 tcnica
rotineiramente usada em vrios laboratrios por todo o mun-
do (Doleel 1991). A oportunidade de separar subpopulaes
de partculas celulares/subcelulares (cell sorting) aumentou
ainda mais o espectro de aplicaes desta tcnica. Apesar da
citometria de fluxo aplicada ao estudo de clulas e organelos
vegetais apresentar ainda algumas limitaes, esta tcnica
permite anlises rpidas (real time) do contedo em ADN
e ARN, da expresso de transgenes e contagem de clulas,
entre outras aplicaes (Yanpaisan et al. 1999). Associada
com outras tcnicas citolgicas a citometria de fluxo con-
siderada uma ferramenta muito importante para o estudo
de citomas vegetais. O conceito de citoma foi originalmente
introduzido por Valet (2002), referindo-se a qualquer tipo de
partcula1 (estruturas celulares, rgos e indivduos). A cit-
mica uma anlise citomtrica multimolecular dos citomas
onde se obtm o mximo de informao referente expresso e fluorescncia) (Crte-Real et al. 2002). Os diferentes
global que um aparente fentipo celular pode fornecer como
resultado do seu gentipo e/ou ambiente (Valet 2002).
O objectivo deste artigo fazer uma reviso da citometria
de fluxo aplicada ao estudo de citomas vegetais, dando-se
particular ateno aos princpios bsicos e instrumentao
associados a esta tcnica, s aplicaes, nomeadamente as
relacionadas com a anlise do contedo em ADN nuclear,
aos estudos que esto a ser desenvolvidos no nosso laborat-
rio e aos estudos futuros.
Boletim de Biotecnologia
Princpios bsicos e instrumentao
A citometria de fluxo uma tcnica que envolve a anlise
das propriedades pticas (disperso da luz e fluorescncia)
de partculas que flem numa suspenso lquida. Esta
particularidade uma das diferenas existentes entre a
citometria de fluxo e outras tcnicas de anlise quantitativa
de ncleos isolados ou cromossomas (e.g. microespectro-
fotometria), que necessitam da fixao das partculas a
uma superfcie (e.g. lmina). A medio em fluxo permite
anlises a alta velocidade (e.g. 102 103 partculas por
segundo) e garante que os citomas analisados so seleccio-
nados aleatoriamente de toda a populao, sem qualquer
subjectividade associada (Doleel 1997a).
A suspenso lquida, que contm os citomas a analisar,
introduzida no centro da cmara de fluxo que se encontra
preenchida por um fludo envolvente (sheath fluid) e que
apresenta uma velocidade muito superior da suspenso
lquida. Atravs de um fenmeno fsico designado por
focagem hidrodinmica, as partculas so foradas a
moverem-se, em fludo laminar e uma a uma, no centro
do fluxo (Doleel 1997a). Estas partculas intersectam um
feixe de iluminao bastante intenso, com origem numa
ou mais fontes de iluminao (laser(s) e/ou lmpada de
vapor de mercrio). Quando as partculas intersectam o
feixe de luz, ocorre um processo de disperso fotnica
e/ou de emisso de fluorescncia, cuja intensidade est
dependente das caractersticas das partculas (Crte-Real
et al. 2002). Os fotes que so dispersos frontalmente vo
ser recebidos e analisados por um fotododo (detector da
disperso frontal) e os que so dispersos ortogonalmente
(90) so recebidos por uma srie de filtros pticos e so
analisados em tubos fotomultiplicadores (disperso lateral
tipos de filtros pticos (long-pass, short-pass, passagem
de banda e espelhos dicricos) dividem a emisso fluores-
cente permitindo a medio simultnea de vrios corantes
fluorescentes (Doleel 1991).
1
Neste trabalho manter-se- o conceito de partculas relativo
a todos os eventos que so analisados. So assim englobados os
citomas de interesse e todas as outras partculas que so analisadas,
mas que so posteriormente excludas como rudos.
 Mtodos em Biotcnologia - Citometria de Fluxo I

Hoje em dia a maior parte dos citmetros possui pelo em velocidade e convenincia com a citometria de fluxo
menos 5 tubos fotomultiplicadores: um para a disperso (Doleel 1997a).
lateral e quatro para as fluorescncias (Crte-Real et al.
Nas plantas superiores, assim como noutros eucariotas,
2002). Alguns dos citmetros mais recentes apresentam
o crescimento e diviso celular um processo cclico. No
a possibilidade de medir at oito fluorescncias simul-
modelo de ciclo celular apresentado por Howard e Pelc
taneamente. Os tubos fotomultiplicadores convertem
(1986), o tempo entre cada mitose encontra-se dividido
e amplificam os sinais luminosos recebidos em pulsos
em trs fases: G1, S e G2. Durante o perodo de cresci-
electrnicos e estes pulsos so por sua vez convertidos em
mento celular (fase G1) uma clula diplide apresenta um
pulsos analgico-digitais que so processados por analisa-
contedo 2C (C contedo de um conjunto haplide de
dores em vrios canais. Os sinais de cada partcula vo-se
cromossomas) em ADN nuclear, i.e., possui duas cpias de
acumulando em tempo real na forma de histogramas
cada gene. Durante a fase S ocorre a duplicao do genoma
mono- ou biparamtricos, que so visualizados no monitor
nuclear e na fase seguinte (fase G2) ocorre o segundo per-
de um computador (Crte-Real et al. 2002). Desta forma
odo de crescimento celular, durante o qual o contedo em
podem-se verificar simultaneamente, as distribuies dos
ADN nuclear mantido no nvel 4C. De seguida ocorre a
valores da frequncia e/ou densidade de cada parmetro.
mitose (fase M) durante a qual a clula se divide, forman-
Uma vez que a citometria de fluxo analisa as partculas
do-se duas clulas filhas, cada uma com um contedo 2C
individualmente e a uma velocidade elevada, populaes
em ADN. O resultado da distribuio do contedo em
numerosas de clulas e organelos podem ser medidas num
ADN nuclear de uma populao de clulas em crescimento
relativamente curto espao de tempo, e sub-populaes
assncrono est expresso na figura 2A. Todavia, uma vez
destes citomas podem ser facilmente detectadas (Doleel
que as medies do contedo em ADN no so perfeitas,
1997b). Na figura 1 apresenta-se um esquema ilustrativo do
as distribuies obtidas experimentalmente apresentam
princpio de funcionamento de um citmetro de fluxo.
sempre variaes (figura 2B).

Figura 1 Representao esquemtica do citmetro de uxo Coulter

EPICS-XL presente no Laboratrio de Biotecnologia e Citmica Vegetal
do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro (adaptado de
(Coulter 1998)).

Anlise do contedo em ADN nuclear

A estimativa do contedo em ADN nuclear foi a primeira
(Heller 1973) e continua a ser a principal utilizao da cito-
metria de fluxo em plantas. Presentemente, a citometria de
fluxo considerada a metodologia mais apropriada para
este tipo de ensaios. Os mtodos bioqumicos clssicos for-
necem valores mdios para nmeros elevados de ncleos e
no permitem a deteco de subpopulaes. Metodologias
mais recentes como a microespectrofotometria, a citofluo-
rometria e a anlise de imagens no conseguem competir
Figura 2 Distribuio do contedo em ADN nuclear (em unidades
arbitrrias, expressas em nmero de canais) numa populao de clulas
em crescimento assncrono (adaptado do endereo de Internet: http:
//www.ueb.cas.cz/Olomouc1/lcgcm/index.htm). (A) Distribuio ideal;
(B) Distribuio obtida aps anlise dos ncleos por citometria de
uxo.
Estas variaes esto relacionadas com as metodologias de
isolamento dos ncleos, com a colorao com fluorocro-

Boletim de Biotecnologia 19
 Mtodos em Biotcnologia - Citometria de Fluxo I

mos especficos para o ADN e com a leitura no citmetro
de fluxo (Marie e Brown 1993). As variaes observadas so
expressas num coeficiente de variao (CV = desvio padro
dividido pela mdia) que geralmente varia, em clulas
vegetais, entre 1 e 10 % (e.g. Zoldos et al. 1998; para reviso
ver Doleel 1991). Marie e Brown (1993) consideram que o
CV um critrio elementar na validao de mtodos cito-
lgicos e definem uma gama de valores entre 1 e 2 % para
anlises de alta qualidade e 3 % como um valor de rotina.
Por sua vez Galbraith et al. (2002) estabeleceu um CV <5 %
como critrio de aceitao. Todavia, para algumas espcies
vegetais recalcitrantes, como muitas plantas lenhosas, a
obteno destes valores recomendados bastante compli-
cada ou em alguns casos ainda impossvel.
Metodologia
A anlise por citometria de fluxo do contedo em ADN
nuclear baseia-se na intensidade de fluorescncia relativa
de ncleos corados com um fluorocromo especfico para
o ADN. A amostra a analisar por citometria de fluxo tem
de se encontrar na forma de uma suspenso de partculas
individuais (Doleel 1997a). O uso de protoplastos para
este tipo de determinaes tem sido progressivamente
abandonado devido a alguns problemas associados a
estas estruturas (e.g. elevada autofluorescncia e baixa
penetrao dos corantes na membrana citoplasmtica).
Os problemas associados baixa capacidade de penetrao
dos fluorocromos especficos para o ADN so facilmente
ultrapassados se se libertarem os ncleos antes da colora-
o. Esta abordagem elimina tambm o efeito da colorao
do ADN citoplasmtico e o problema da fluorescncia no
especfica das clorofilas, uma vez que os cloroplastos indivi-
duais apresentam nveis de fluorescncia muito baixos, em
comparao com os ncleos (Doleel 1991).
At ao momento foram desenvolvidas vrias metodologias
para libertar ncleos intactos de clulas vegetais. Todavia,
o mtodo clssico desenvolvido por Galbraith et al. (1983)
continua a ser o mais utilizado, dada a simplicidade e
rapidez, com que consegue libertar directamente ncleos
de tecidos vegetais (Figura 3). O tecido (approx. 50 mg,
no caso de folhas) cortado (chopped) com uma lmina
da barba numa caixa de Petri contendo o tampo de lise
(usualmente uma soluo tampo hipotnica com um
detergente no inico). Apesar de toda a sua simplicidade
e rapidez este mtodo fornece resultados bastante bons
para a maioria das espcies vegetais. de Laat et al. (1987)
utilizaram esta metodologia para isolar ncleos de folhas
de beterraba e obtiveram histogramas de fluorescncia com
CVs entre 1,2 e 1,5 %, para o pico G1. A metodologia desen-
volvida por Price e Johnston (1996) inclui a centrifugao
dos ncleos antes da adio do corante para o ADN, mas
os histogramas obtidos apresentaram CVs mais elevados
e uma quantidade maior de rudo. Alguns investigadores
isolaram ncleos de clulas ou tecidos fixados (Sgorbati et
al. 1986, Pfosser 1989), todavia esta metodologia tem sido
cada vez mais abandonada dado apresentar uma srie de
desvantagens (e.g. tendncia para a formao de aglome-
rados de ncleos, alteraes na estrutura da cromatina e

Figura 2 Diagrama da metodologia utilizada para analisar o contedo em ADN nuclear utilizando tecido foliar.

Boletim de Biotecnologia
 Mtodos em Biotcnologia - Citometria de Fluxo I

diminuio da resoluo dos histogramas obtidos). ricas em A-T do ADN (Portugal e Waring 1988), enquanto
que a coromicina A3 e a mitramicina se ligam preferen-
Tm sido usados vrios tampes no isolamento de ncleos
cialmente s regies ricas em G-C (Van Dyke e Dervan
de clulas vegetais (e.g. Galbraith et al. 1983). A sua compo-
1983). Os corantes que se ligam a pares de base especficos
sio determinada pela necessidade de inibir a actividade
fornecem geralmente resultados com CVs mais baixos (CV
das nucleases (proteco contra a degradao do ADN), de
<2) do que os corantes intercalares. Todavia, os corantes
preservar a integridade dos ncleos e de fornecer condi-
especficos de determinados pares de bases no fornecem
es ptimas para a colorao do ADN. Os tampes mais
estimativas correctas do contedo em ADN nuclear
utilizados apresentam geralmente, caties Mg2+ (Galbraith
quando se utilizam padres de referncia cuja composio
et al. 1983, Arumuganathan e Earle 1991) ou poliaminas
em bases no seja idntica composio da amostra em
(de Laat et al. 1987, Doleel et al. 1989), para estabilizar a
estudo. Doleel (1991) descreve este problema e sugere que
cromatina. O Triton X-100 geralmente usado em todos os
os corantes intercalares devem ser preferencialmente utili-
tampes como detergente no inico. Por vezes, so adicio-
zados quando se pretendem efectuar estimativas exactas do
nados ao tampo, agentes redutores (mercaptoetanol, PVP,
contedo em ADN nuclear.
etc.) que tm como funo inibir a aco de compostos
fenlicos (Endemann et al. 2002, Galbraith et al. 2002). At Apesar de todos os corantes apresentados poderem ser
ao momento foram efectuados muito poucos estudos (e.g. usados para quantificar o contedo em ADN nuclear,
de Laat et al. 1987) para comparar a eficincia dos tampes preciso ter em conta que uma poro do ADN nuclear da
de lise nuclear. Uma vez que no existe um tampo que cromatina nativa permanece no corada. Darzynkiewicz
funcione optimamente para todos os tecidos e/ou espcies e Traganos (1988) mostraram que para alguns corantes
vegetais seria porventura interessante fazer um estudo da (e.g. IP e BE) a quantidade de ADN no corado depende
eficincia dos tampes mais usados hoje em dia, de forma da estrutura da cromatina. Esta descoberta indica que a
a tentar perceber e optimizar a composio dos mesmos e estrutura da cromatina nativa (que em algumas espcies
assim obter um tampo mais verstil e universal. varia entre tecidos da mesma planta), e que alteraes
na cromatina (induzidas, p.e., por fixao do material)
Aps o isolamento dos ncleos, estes so filtrados por uma
influenciam a afinidade do ADN para vrios fluorocromos.
rede de nylon com cerca de 50 m, de forma a eliminar a
O modo de ligao e as propriedades espectrais dependem
maior parte dos resduos obtidos. De seguida os ncleos so
ainda de outros factores como o rcio ADN/corante, fora
corados com um fluorocromo que se liga especificamente e
inica e pH da soluo de colorao. Assim, necessrio ter
estequiometricamente ao ADN. A tabela I apresenta os
em considerao todos estes factores quando se comparam
fluorocromos mais utilizados na estimativa do contedo
as estimativas do contedo em ADN nuclear. Para alm
em ADN nuclear. O iodeto de propdio (IP) e o brometo
da preparao e colorao da amostra, existem tambm
de etdio (BE) intercalam-se quantitativamente na cadeia
factores instrumentais que afectam a preciso da anlise
dupla do ADN (Lepecq e Paoletti 1967). Os primeiros estu-
do contedo em ADN nuclear por citometria de fluxo.
dos foram efectuados utilizando BE no entanto Crissman
No entanto, esta preciso pode ser controlada, usando
et al. (1976) mostraram que o IP produz histogramas de
padres de instrumento como fluoroesferas marcadas,
fluorescncia com CVs ligeiramente inferiores aos obtidos
ncleos corados de glbulos vermelhos de galinha (CRBC)
com BE. Hoje em dia, o IP o corante intercalar mais usa-
ou leuccitos humanos (Fulwyler 1979, Pijnacker et al.
do em estimativas do contedo em ADN nuclear. Como
1989). Estes padres permitem fazer o ajuste do citmetro
ambos os corantes tambm se ligam cadeia dupla de
de fluxo de forma a obter um sinal de amplitude mximo e
ARN, a preciso das determinaes do contedo em ADN
coeficientes de variao mnimos (Doleel 1991).
utilizando estes corantes, est dependente da destruio
do ARN por RNases (Price e Johnston 1996). O Hoechst As determinaes do contedo em ADN nuclear por
33258 e o DAPI ligam-se preferencialmente s regies citometria de fluxo so obtidas por comparao com um

Tabela 1. Corantes uorescentes mais utilizados em citometria de uxo para estimaro contedo em ADN nuclear.

Comprimento de Onda
Fluorocromo Modo de Ligao Primrio
Excitao Emisso

Iodeto de Propdio Intercalao 525 (Azul-verde) 605 (Vermelho)

Brometo de Etdio Intercalao 535 (Azul-verde) 602 (Vermelho)

DAPI Regies ricas em A-T 345 (UV) 460 (Azul)

Hoechst 33258 Regies ricas em A-T 360 (UV) 460 (Azul)

Coromicina A3 Regies ricas em G-C 445 (Violeta-Azul) 570 (Verde)

Mitramicina Regies ricas em G-C 445 (Violeta-Azul) 575 (Verde)

Boletim de Biotecnologia 21
 Mtodos em Biotcnologia - Citometria de Fluxo I

padro de referncia. Os padres de referncia podem ser discutido, tendo ficado decidida a realizao de um estudo
preparados externa ou internamente. Os padres externos inter-laboratorial a nvel mundial para comparar os dife-
so preparados separadamente da amostra em estudo e rentes padres vegetais (Doleel, comunicao pessoal)
so verificados antes e depois de cada amostra. Este pro-
cedimento moroso e susceptvel a erros provocados por
variaes relacionadas com o aparelho e com a colorao. Aplicaes
Este erro pode ser minimizado pela utilizao do padro
internamente, i.e., preparao conjunta da amostra e do
Anlises de Ploidias
padro. Os CRBCs e os leuccitos humanos so frequen-
temente usados como padres de referncia em anlises A anlise da intensidade de fluorescncia relativa de ncle-
por citometria de fluxo do contedo em ADN nuclear e os isolados de folhas jovens produz um histograma com
nvel de ploidia em clulas humanas. O contedo em ADN um pico dominante que corresponde aos ncleos que se
nuclear destes padres est supostamente bem estabeleci- encontram na fase G1 do ciclo celular e um pico menor que
do (7,0 pg para Homo sapiens, Rasch 1985, e 2,5 pg para corresponde aos ncleos na fase G2. Para estimar o nvel de
Gallus domesticus, Tiersch et al. 1989) e por essa razo so ploidia, a posio do pico G1 de um histograma compa-
muitas vezes utilizados em estimativas do contedo de rado com o pico de uma planta padro com uma ploidia
ADN nuclear em plantas superiores. No entanto, quando conhecida (Doleel 1997a).
se utilizam estes padres, tem de se ter em considerao
A anlise por citometria de fluxo do contedo em ADN
que nestas espcies, tal como acontece noutras espcies que
nuclear em clulas em interfase uma excelente alternativa
possuem cromossomas sexuais heteromrficos, os valores
aos mtodos microscpicos clssicos de contagem de cro-
diferem entre machos e fmeas. Jakobsen (1983) verificou
mossomas. Comparativamente a citometria de fluxo apre-
que estas diferenas podem influenciar significativamente
senta as seguintes vantagens: mais conveniente (a prepa-
os resultados. Quando se utiliza CRBC como padro de
rao da amostra fcil), rpida (processamento de deze-
referncia tem de se ter igualmente em considerao que
nas de amostras num nico dia de trabalho), no necessita
as vrias variedades de galinha possuem diferenas no con-
de clulas em diviso, uma metodologia no destrutiva
tedo em ADN (Nakamura et al. 1990). Por estas razes,
(uma amostra pode ser preparada, p.e., a partir de 50 mg de
o uso de padres de referncia vegetais tem sido cada vez
tecido foliar) e capaz de detectar mixoploidias. Por estas
mais apoiado. Price et al. (1980) sugeriram que por ques-
razes, a citometria de fluxo uma metodologia utilizada
tes tcnicas os padres vegetais so mais adequados para
em diferentes reas que vo desde a investigao bsica at
estimar o contedo em ADN em plantas. Johnston et al.
ao melhoramento de plantas e indstria (Doleel 1997a).
(1999) consideraram que a escolha do padro de referncia
a usar um passo crtico para estas estimativas e recomen- Abordam-se de seguida algumas aplicaes especficas
dam que o padro vegetal a usar tenha um contedo em dentro da anlise de ploidias:
ADN prximo, mas no sobreposto, aos picos 2C e 4C da
Deteco de plantas haplides e de linhas dihaplides:
planta a analisar. Desta forma, tem de estar disponvel um
em algumas espcies (e.g. cereais) pode-se obter um eleva-
conjunto de plantas padro que possa cobrir a gama de
do nmero de plntulas a partir da antera, do micrsporo
variao existente no tamanho do genoma das plantas. No
ou de culturas do ovrio. A determinao da ploidia nestas
nosso laboratrio so usados os padres vegetais sugeridos
plntulas importante dado que as plntulas haplides
por Doleel et al. (1992). Estes autores calibraram o tama-
tm de ser tratadas com agentes poliploidizantes para
nho do genoma de cultivares seleccionados de Raphanus
produzir plntulas homozigticas diplides, enquanto que
sativus (2C = 1,11 pg), Lycopersicon esculentum (2C = 1,96
as plntulas dihaplides no necessitam deste tratamento.
pg), Glycine max (2C = 2,50 pg), Zea mays (2C = 5,72 pg),
A citometria de fluxo a nica metodologia que consegue
Pisum sativum (2C = 9,09 pg), Vicia faba (2C = 26,90 pg),
analisar um nmero bastante elevado de plntulas num
Secale cereale (2C = 16,19 pg) e Allium cepa (2C = 34,89
relativamente curto espao de tempo, o que permite a ren-
pg). Estas espcies so rotineiramente utilizadas como
tabilizao de todo o processo (Svirshchevskaya e Doleel
padres internos de referncia. Outras espcies vegetais
2001, Gemes-Juhasz et al. 2002).
que so frequentemente usadas incluem Petunia hybrida
(2C = 2,85 pg; Marie e Brown 1993) e Hordeum vulgare (2C Deteco de novos nveis de ploidia: em algumas plantas,
= 11,12 pg; OBrien et al. 1996). as cultivares utilizadas a nvel comercial so triplides e
o seu melhoramento envolve estratgias de cruzamento
Johnston et al. (1999) testaram e sugeriram um conjunto de
diferentes de forma a obter o nvel de ploidia desejado. A
padres de referncias a usar em estimativas do contedo
citometria de fluxo rotineiramente utilizada para verificar
em ADN nuclear em plantas, mas, infelizmente, entre a
o nvel de ploidia das plantas me e dos progenitores. Nou-
comunidade cientfica, ainda no se chegou a um consenso
tras plantas como a banana (Musa acuminata, van Duren
sobre que padres de ADN usar quando se analisam ncle-
et al. 1996) e a pereira (Pyrus pyrifolia, Kadota e Niimi
os de clulas vegetais. Este facto torna a comparao dos
2002), as cultivares tetraplides so mais rentveis do que
dados obtidos em diferentes laboratrios bastante difcil,
os diplides. Estas cultivares so usualmente produzidas
seno impossvel (Doleel 1997a). Recentemente, na Kew
aps o tratamento com um agente poliploidizante e atravs
Plant Genome Size Discussion Meeting, este assunto foi

Boletim de Biotecnologia
 Mtodos em Biotcnologia - Citometria de Fluxo I
da citometria de fluxo as plntulas de interesse podem rapi-
damente ser seleccionadas.
Deteco de hbridos inter-especficos: os cruzamentos
inter-especficos so muitas vezes utilizados para transfe-
rir caractersticas de interesse de uma espcie para outra.
Quando as espcies parentais diferem o suficiente no
contedo em ADN nuclear a citometria de fluxo consegue
detectar hbridos inter-especficos de acordo com os valo-
res de ADN intermdios (Keller et al. 1996, Hirsch et al.
2001).
Controlo da estabilidade do nvel de ploidia: devido sua
eficincia a citometria de fluxo a ferramenta ideal para
uma anlise rpida da conformidade de lotes de sementes
(de Laat et al. 1987). As culturas in vitro so usualmente
caracterizadas por uma frequncia baixa de clulas mit-
ticas. Muitas das clulas diferenciam-se, no se dividem, e
por essas razes o nvel de ploidia no pode ser estimado
pelos mtodos convencionais. A citometria de fluxo uma
poderosa ferramenta para estimar a estabilidade da ploidia
do tecido caloso, de embries somticos, cultura de clu-
las, etc., e verificar os efeitos da idade e das condies da
cultura nessa mesma estabilidade (Brutovsk et al. 1998,
Winklemann et al. 1998, Endemann et al. 2002).
Deteco de aneuploidia: a deteco de aneuploidia, por
citometria de fluxo, por vezes muito complicada e nestas
situaes a resoluo dos histogramas de fluorescncia
um factor bastante importante. Todavia, Pfosser et al.
(1995) e Roux et al. (2003) mostraram que a citometria de
fluxo , em algumas situaes, suficientemente sensvel para
detectar a presena ou ausncia de um nico cromossoma.
Contudo em todas estas situaes a aneuploidia foi experi-
mentalmente programada. Em estudos em que a ocorrncia
de aneuploidia pode ou no verificar-se muito difcil a sua
deteco, sendo, nestas situaes, necessrio acompanhar o
estudo de citometria de fluxo com estudos convencionais
de contagem microscpica de cromossomas.
Taxonomia: uma rea que tem beneficiado grandemente
com a utilizao da citometria de fluxo na anlise da ploidia
a taxonomia. Uma vez que a contagem cromossomtica
laboriosa, apenas pode ser analisado um nmero limitado
de plantas, de tal forma que populaes similares fenotipi-
camente, mas que diferem no nvel de ploidia podem pas-
sar despercebidas (Misset e Gourret 1996, Lysk e Doleel
1998). Assim a citometria de fluxo apresenta um potencial
enorme no estudo da estrutura e dinmica de populaes
vegetais que apresentem indivduos com sistemas genticos
anmalos (e.g. agamospermia). Estas populaes podero
ser caracterizadas por vrias microespcies que diferem no
nvel de ploidia (Renno et al. 1995).
Estimativa do tamanho do genoma
O conhecimento do tamanho do genoma tem recebido
cada vez mais ateno nos ltimos anos sendo muito
importante em diversas reas de investigao. Este conhe-
cimento tem sido bastante til em estudos de relaes
filogenticas (Zoldos et al. 1998, Lysk et al. 1999, Torrell e
Valles 2001, Moscone et al. 2003, Suda et al. 2003), na an-
lise de possveis correlaes entre o tamanho do genoma
e caractersticas fisiolgicas e agronmicas (e.g. Biradar et
al. (1994a) verificaram em milho, uma correlao negativa
entre os parmetros de crescimento e a quantidade de ADN
nuclear), e na anlise do efeito de factores ambientais no
tamanho do genoma. Os investigadores da Biologia Mole-
cular interessados no mapeamento de genomas necessitam
de conhecer a sua complexidade, e at ao momento o tama-
nho do genoma nuclear continua desconhecido para apro-
ximadamente 99 % das espcies Angiosprmicas (Bennett
e Leitch 2003). Estes autores compilaram at ao momento a
informao do contedo em ADN nuclear de mais de 3493
espcies Angiosprmicas. Devido sua preciso, rapidez e
convenincia, a citometria de fluxo tida como a metodo-
logia ideal para a realizao desta tarefa.
A estimativa do tamanho do genoma nuclear por cito-
metria de fluxo em unidades absolutas (pg de ADN ou
Mpb) pode ser conseguida pela medio simultnea da
amostra e do padro de referncia (com um tamanho do
genoma conhecido). O tamanho do genoma da amostra
de seguida calculado pelo rcio das posies dos picos G1
da amostra/padro multiplicado pelo contedo em ADN
da planta de referncia. Um aspecto que tem de se ter em
considerao no clculo do contedo 2C de ADN um
conhecimento prvio do nvel de ploidia da nossa amostra,
uma vez que a poliploidia um fenmeno frequente em
plantas superiores.
A preciso a reprodutibilidade da anlise so aspectos
crticos neste tipo de estudos, principalmente em estudos
de variaes intra-especficas do tamanho do genoma. O
nmero de trabalhos em que se verificou este tipo de varia-
es tem aumentado continuamente, no entanto, a maioria
dos resultados obtidos no foi confirmado independente-
mente. Este aspecto suscitou questes relacionadas com a
frequncia e magnitude deste tipo de variaes (Greilhuber
1998). Uma vez que existem variaes tcnicas e/ou varia-
es biolgicas, que podem levar a diferenas quantitativas
na ligao e/ou fluorescncia dos fluorocromos utilizados
(Johnston et al. 1996, Greilhuber 1998), diferenas arte-
factuais podem ocorrer e diferenas reais podem passar
indetectveis. Idealmente, o corante fluorescente deveria
ter acesso a todos os locais de ligao ao ADN, mas por
vezes isso no totalmente conseguido. Alguns tratamen-
tos fsicos e qumicos (e.g. aquecimento, adio de caties
bivalentes, modificao do pH e variao da concentrao
de NaCl) modificam a condensao da cromatina, pro-
vocando variaes de fluorescncia (Darzynkiewicz et al.
1984).
Alguns trabalhos recentes mostraram que as interaces
ncleo-citosol so uma fonte de erro estequiomtrico na
determinao, por citometria de fluxo, do contedo em
ADN nuclear em plantas. A presena de compostos extra
nucleares que reduzem a fluorescncia do IP foi detectada
em algumas espcies de plantas, nomeadamente em girassol,
Helianthus annuus L. (Price et al. 2000) e na planta do caf,
Coffea liberica var. dewevrei (Noirot et al. 2000, Noirot et
Boletim de Biotecnologia 23
 Mtodos em Biotcnologia - Citometria de Fluxo I
al. 2002, Noirot et al. 2003). Price et al. (2000) referiram
que estes tipos de inibidores que diminuem a fluorescncia
dos fluorocromos de ADN so comuns nas plantas. Assim,
deveria ser efectuado um teste de deteco destes inibidores
em todos os estudos de citometria de fluxo em plantas. Estes
investigadores no identificaram a natureza qumica destes
inibidores mas apontaram para o provvel envolvimento
dos metabolitos secundrios produzidos pelas plantas.
Noirot et al. (2000), em estudos efectuados com a planta
do caf, verificaram o efeito do citosol na acessibilidade dos
corantes ao ADN, e que os compostos presentes no citosol
podem alterar as estimativas do contedo em ADN nuclear
at cerca de 20 %.
Estes autores sugeriram os compostos fenlicos e a
cafena como possveis fontes dos erros estequiomtricos
verificados. Suportando esta hiptese foi recentemente
verificado por estes autores (Noirot et al. 2003) que a
cafena e o cido cloragnico (um percursor de polifenis)
modificam a acessibilidade do IP ao ADN de petnia
(padro interno usado nas vrias experincias). O DAPI
poderia, porventura nalguns estudos, ser usado em
substituio do IP, mas Noirot et al. (2002) demonstraram
que este corante tambm afectado por estes compostos.
Estes autores referiram que devem surgir erros
estequiomtricos sempre que o contedo em compostos
fenlicos variar e uma vez que estes compostos so bastante
comuns nas plantas, especialmente nas plantas lenhosas,
estes erros so esperados em muitas situaes.
Outras aplicaes
Estudos do ciclo celular
Uma vez que o contedo em ADN nuclear reflecte a
posio da clula no ciclo celular, a citometria de fluxo pode
ser utilizada na anlise do ciclo celular.
Galbraith et al. (1983) e Sgorbati et al. (1986) entre
outros, utilizaram esta tcnica para estudar as diferenas
de proporo de cada fase do ciclo celular, consoante os
rgos, partes dos rgos e idade das plantas. Sandoval et
al. (2003) efectuaram um estudo ao nvel do ciclo celular
em tecidos in vitro de coqueiro de forma a controlar a sua
regenerao.
Neste tipo de estudos necessrio ter conta alguns aspec-
tos. Haag et al. (1987) mostraram que a quantidade de
rudo de fundo encontrado em alguns histogramas, poder
levar a erros na estimativa da proporo de clulas que se
encontrava na fase S. No caso de estar presente, este rudo
dever ser eliminado antes das anlises dos histogramas
de ADN. Outra possvel fonte de erro seria a formao de
agregados nucleares. Com efeito, a formao de dupletos
(e.g. dois ncleos G1) poder levar a um aumento artificial
na frequncia de clulas na fase G2 mas, a maior parte dos
programas computacionais de anlise dos dados apresenta
a possibilidade de criar regies que permitem a eliminar
este tipo de clulas da anlise do ciclo celular (Price e
Boletim de Biotecnologia
Johnston 1996).
Determinao do sexo numa fase prvia do cres-
cimento
Algumas espcies vegetais economicamente importantes
so diicas e a identificao do sexo numa fase inicial de
crescimento tem uma aplicao vasta na sua produo e
melhoramento. Doleel e Ghde (1995) demonstraram
que a anlise por citometria de fluxo de elevada resoluo
de ncleos isolados de folhas jovens poder ser usada
para discriminar entre plantas masculinas e femininas
de Melandrium album. Nesta espcie, devido ao hetero-
morfismo existente nos cromossomas sexuais, as plantas
masculinas tm uma quantidade de ADN ligeiramente
superior em relao s plantas femininas. Infelizmente, este
heteromorfismo nem sempre ocorre em espcies diicas.
Anlises de genotoxicidade
Uma possvel aplicao da citometria de fluxo, que at
agora foi muito pouco explorada, a anlise do efeito do
ambiente e de compostos genotxicos na quantidade de
ADN nuclear. Biradar et al. (1994b) verificaram alteraes
no ADN nuclear de milho, induzidas por um fungicida
(Triticonazole). Por outro lado, mutagenes fsicos (e.g.
irradiao) so tidos como indutores de aberraes
cromossomticas que por sua vez provocam alteraes no
contedo em ADN.
Por exemplo, a irradiao tem sido frequentemente
utilizada para proteger os vegetais da degradao durante
um tempo de conservao prolongado. Selvan e Thomas
(1995) verificaram, por citometria de fluxo, a presena
de alteraes no contedo em ADN de clulas do tecido
meristemtico de bolbos de cebola que foram irradiados
para inibir a formao de rebentos. Se estes resultados
forem confirmados com mais estudos, a citometria de fluxo
pode vir a ser usada como um mtodo rpido e fivel de
deteco deste tipo de alteraes, no controlo de vegetais
irradiados.
Anlise e separao de cromossomas
A anlise e mapeamento do genoma da maior parte das
cultivares dificultada pelo elevado tamanho do seu geno-
ma. Esta complexidade pode ser reduzida pela purificao
de cromossomas isolados por citometria de fluxo e seriao
(Doleel et al. 1994). O modo de funcionamento da seria-
o celular e o modo de preparao dos cromossomas no
sero aqui focados (para uma reviso ver Doleel et al.
1994). Os cromossomas que so dificilmente descrimina-
dos por cariotipagem podem desta forma ser seriados em
nmeros elevados, de forma a serem utilizados em sub-
sequentes anlises moleculares. As aplicaes associadas
incluem a localizao de sequncias de ADN, o isolamento
de sondas complexas, a construo de livrarias de ADN
especficas para cada cromossoma e o isolamento de mar-
cadores moleculares especficos para os cromossomas.
 Mtodos em Biotcnologia - Citometria de Fluxo I

A citometria de uxo na UA com um laser de rgon arrefecido com ar, com 15 mW e

A citometria de fluxo sofreu um grande desenvolvimento
em Portugal no incio da dcada de 90, graas aos trabalhos
desenvolvidos em carcinomas pelo Prof. Filipe Sansonetty
do IPATIMUP (Carneiro et al. 1992). Este investigador tem
sido, desde ento, o principal dinamizador e divulgador
desta tcnica em Portugal, desenvolvendo actualmente
diversos estudos em carcinomas (Castro et al. 2001), em
leveduras (Ludovico et al. 2001) e noutros organismos
(Lage et al. 2001).
A citometria de fluxo foi implantada no Departamento de
Biologia da Universidade de Aveiro, mais concretamente
no Laboratrio de Biotecnologia e Citmica Vegetal, h
aproximadamente ano e meio, aps a aquisio de um
citmetro de fluxo Coulter EPICS-XL (Coulter Electronics,
Hialeah, Florida, USA). O citmetro de fluxo est equipado
a operar a 488 nm e apresenta, para alm dos sensores de
disperso frontal e lateral, quatro sensores de fluorescncia.
Este aparelho no est equipado com mais nenhum sistema
de iluminao (e.g. UV) e por essa razo, os estudos envol-
vendo fluorocromos implicam que estes sejam excitados
dentro do comprimento de onda de luz, disponvel (e.g. IP,
BE e SYBR Green).
Aps um perodo necessrio de aprendizagem de toda a
instrumentao, seguiu-se um perodo de aprendizagem
das metodologias de preparao e anlise de ncleos vege-
tais. Para isso muito contribuiu o apoio inicialmente pres-
tado pelo Prof. Filipe Sansonetty (Universidade do Minho)
e pelo Prof. Jaroslav Doleel do Laboratrio de Citoge-
ntica Molecular e Citometria do Instituto de Botnica
Experimental localizado em Olomouc, Repblica Checa.
Presentemente o citmetro de fluxo tem uma utilizao

Pico Mdia ID CV (%) Pico Mdia ID CV (%)

1 195.9 0.503 2.16 1 192.8 0.449 1.99

2 389.1 0.881 0.38 2 382.5 0.891 1.77

3 441.7 1.000 1.57 3 429.1 1.000 1.51

4 861.7 1.957 0.10 4 839.2 1.956 0.11

Pico Mdia ID CV (%) Pico Mdia ID CV (%)

1 215.4 0.464 2.11 1 185.8 0.444 1.92

2 420.7 0.907 0.34 2 367.3 0.878 1.21

3 463.7 1.000 1.55 3 418.1 1.000 1.68

4 902.5 1.946 0.07 4 819.0 1.959 0.11

Figura 4 Histogramas de uorescncia obtidos aps anlise simultnea de ncleos isolados de Pisum sativum cv. Ctirad (2C = 9,09 pg DNA, como
padro de referncia interno) e Ulmus minor Mill.: a) folhas do gentipo G14, b) folhas do gentipo G14 obtidas por converso de embries primrios,
c) folhas do gentipo G14 obtidas por converso de embries secundrios, d) folhas do gentipo G12. Em todos os histogramas so visveis quatro
picos: 1 ncleos na fase G0/G1 de U. minor; 2 ncleos na fase G2/M de U. minor; 3 ncleos na fase G0/G1 de P. sativum; 4 ncleos na fase G2/M
de P. sativum. DI = ndice de ADN (rcio entre o canal mdio da amostra e da planta padro), CV = coeciente de variao.

Boletim de Biotecnologia 25
 Mtodos em Biotcnologia - Citometria de Fluxo I
diria, no estando, no entanto, a sua aplicao restrita a
estudos do genoma vegetal.
Trabalhos em curso
O grupo de Biotecnologia e Citmica Vegetal do Depar-
tamento de Biologia da Universidade de Aveiro tem
experincia consolidada em micropropagao (essencial-
mente por embriognese somtica) de plantas lenhosas
como sobreiro (Pinto et al. 2002a), eucalipto (Pinto et al.
2002b), oliveira (Santos et al. 2003) e ulmeiro (Conde et al.
2004) frequentemente consideradas recalcitrantes - para
alm de outras espcies (Santos e Caldeira 1998). Nesta
linha de investigao esto a ser desenvolvidos estudos de
estabilidade, ao nvel da ploidia, de plantas derivadas de
micropropagao. Tal como foi referido anteriormente as
plantas lenhosas apresentam alguns problemas associados
com isolamento dos ncleos, nomeadamente pela provvel
interferncia de compostos do metabolismo secundrio.
Para o efeito esto a ser desenvolvidas metodologias que
tentam minimizar a aco destes compostos e assim permi-
tir a progresso dos ensaios.
Em sobreiro (Quercus suber L.) a citometria de fluxo est
a ser usada para avaliar se a embriognese somtica (Pinto
et al. 2002a) induz alteraes ao nvel de ploidia (Loureiro
et al. 2003c). Para o efeito analisaram-se por citometria
de fluxo, embries somticos morfologicamente normais
(com dois cotildones), embries somticos anormais
(com um, trs ou mais cotildones) e folhas da rvore me.
A citometria de fluxo, utilizando uma colorao com IP, foi
assim utilizada para estimar o nvel de ploidia e o conte-
do em ADN nuclear dos embries somticos e da rvore
me. At ao momento no foram detectadas diferenas
significativas entre os embries, e entre eles e a rvore me,
indicando que as culturas de embries so estveis. A esti-
mativa do contedo 2C em ADN nuclear para esta espcie
bastante similar ao valor previamente obtido por (Zoldos
et al. 1998) (2C = 1,91 pg ADN).
Em eucalipto (Eucalyptus globulus Labill.) procedeu-se
a um estudo semelhante tendo-se comparado embries
somticos (Pinto et al. 2002b) com embries zigticos da
mesma famlia (a partir dos quais foram obtidos os embri-
es somticos) (Pinto et al. 2003). Os valores obtidos foram
ainda comparados com os valores obtidos para a rvore
me. Os resultados revelaram diferenas no significativas
entre os embries somticos e a rvore me, mas ambos os
valores so significativamente diferentes dos valores obti-
dos para os embries zigticos. Todavia, e tendo em conta
que o eucalipto uma planta lenhosa, as diferenas entre
a rvore me e os embries zigticos sugerem que alguns
aspectos tm de ser analisados com bastante cuidado,
dado que o IP pode estar a ser influenciado por compostos
secundrios (e.g. antocianinas e taninos) presentes nos
embries somticos e nas folhas maduras.
Em ulmeiro (Ulmus minor Mill.), a citometria de fluxo foi
utilizada para verificar a estabilidade gentica de plantas
derivadas de embries somticos e de plantas micropro-
Boletim de Biotecnologia
pagadas (Conde et al. 2003, Loureiro et al. 2003b). No
que respeita estabilidade gentica das plantas derivadas
de embries verificaram-se diferenas significativas entre
as plantas derivadas de embries somticos obtidos por
embriognese secundria e as plantas derivadas de embri-
es somticos obtidos por embriognese primria. As
primeiras revelaram igualmente diferenas significativas
em comparao com as estimativas obtidas para a planta
me. Esta situao pode ser um caso de aneuploidia, e de
forma a comprovar esta hiptese esto em curso estudos de
cariotipagem. No que diz respeito estabilidade gentica
das plantas micropropagadas, no foram encontradas dife-
renas significativas entre os vrios gentipos comparados.
Este resultado revela estabilidade das culturas in vitro
(Figura 4). Foi ainda efectuada a primeira estimativa do
tamanho do genoma de Ulmus minor Mill. (2C = 4,02 pg
de ADN) (Loureiro et al. 2003b).
Em oliveira (Olea europea ssp. maderensis) foram compa-
rados vrios tipos de tecido caloso (embriognico, organo-
gnico e no diferenciado) entre si e com folhas da rvore
me e folhas de plntulas micropropagadas (Santos et al.
2003). At ao momento no foram detectadas diferenas
significativas entre os vrios tipos de tecidos analisados.
Estes resultados indicam que as metodologias de micro-
propagao utilizadas garantem a estabilidade gentica das
culturas. Foi ainda efectuada a primeira estimativa utilizan-
do a citometria de fluxo do tamanho do genoma de oliveira
(2C = 3,19 pg de ADN).
Na rea da toxicologia o grupo tem incidido a sua linha de
aco no mbito da toxicidade salina e metais (e.g. Santos
et al. 2001, Santos et al. 2002). Nesta linha verificou-se, p.e.,
que plantas de girassol (Helianthus annuus L.) expostas
a cdmio (5, 50 e 500 M) evidenciaram um ligeiro
decrscimo no nmero de ncleos presentes na fase G2 do
ciclo celular, corroborando outros dados morfolgicos e
fisiolgicos obtidos. No que respeita quantidade de ADN
nuclear, as plantas expostas a cdmio apresentaram valores
similares aos valores obtidos para a planta controlo suge-
rindo que este tipo de exposio genotxica no afectou
as caractersticas do genoma analisadas pelo citmetro de
fluxo (Loureiro et al. 2003a).
Foi igualmente realizado um estudo, em cooperao com
a Prof. Fernanda Leal e a Prof. Olinda Carnide do Depar-
tamento de Gentica e Biotecnologia, da Universidade de
Trs-os-Montes e Alto Douro, de deteco do nvel de
ploidia de plntulas de videira (Vitis vinifera L.) obtidas a
partir de gros de plen.
Neste momento foram iniciados dois trabalhos na rea da
taxonomia. Um dos trabalhos ser efectuado em coopera-
o com o Prof. Paulo Silveira do Departamento de Biologia
da Universidade de Aveiro e consistir na determinao do
nvel de ploidia de algumas espcies pertencentes ao gnero
Festuca L. O outro estudo ser efectuado em cooperao
com o Prof. Eduardo Dias do Departamento de Cincias
Agrrias da Universidade dos Aores e consistir na deter-
minao do contedo em ADN de alguns endemismos
 Mtodos em Biotcnologia - Citometria de Fluxo I
do Arquiplago dos Aores. Pretende-se assim, aumentar
o conhecimento que se tem do genoma nuclear destas
espcies e ainda estabelecer relaes ao nvel do contedo
em ADN nuclear entre as espcies endmicas e espcies
continentais filogeneticamente prximas.
Para alm dos estudos efectuados em plantas, e de forma a
expandir as reas de utilizao da citometria de fluxo, foram
iniciados estudos de viabilidade em leveduras (Rocha et
al. 2003) e estudos de viabilidade de espermatozides de
ratinhos expostos a diferentes metais pesados (Oliveira et
al. 2003), perspectivando-se a curto prazo o alargamento a
ensaios no mbito da citotoxicidade animal.
Trabalhos futuros
Num futuro prximo, pretendemos optimizar as metodo-
logias utilizadas para isolar e analisar ncleos de clulas
vegetais por citometria de fluxo. Para isso pretendemos
testar o efeito de vrios compostos citoslicos, comuns na
grande maioria das plantas lenhosas, na acessibilidade do
IP ao ADN. Pretende-se tambm verificar de que forma
que se pode minimizar o efeito destes compostos e assim
garantir estimativas mais rigorosas do tamanho do genoma
nas plantas. igualmente do nosso interesse efectuar um
estudo comparativo de todos os tampes de lise desen-
volvidos para isolar ncleos de clulas vegetais, quer em
termos de eficincia de isolamento (e.g. baixos CVs, boa
quantidade de eventos e baixo rudo) quer em termos de
parmetros citomtricos (disperso frontal e lateral da
luz e fluorescncia). Esta tentativa de estandardizao das
metodologias utilizadas ser efectuada em cooperao com
o Laboratrio de Citogentica Molecular e Citometria do
Instituto de Botnica Experimental da Repblica Checa.
No futuro pretendemos igualmente desenvolver novos
estudos na rea da taxonomia. Para tal temos j em pers-
pectiva o esclarecimento do nvel de ploidia de algumas
espcies pertencentes ao gnero Polygala L.
nosso objectivo ainda enveredar pelo campo da citmica
funcional em plantas, e para o efeito pretendemos verificar
a possibilidade de efectuar alguns estudos funcionais, j
utilizados em clulas animais (e.g. viabilidade, potencial
mitocondrial, potencial transmembranar, actividade das
peroxidases), em clulas vegetais. Um dos problemas que
iremos enfrentar ser a presena da parede celular que
interfere na entrada de algumas molculas (e.g. marcadores
fluorescentes) nas clulas vegetais e que so essenciais para
o desenvolvimento destes estudos. Todavia a utilizao
de protoplastos poder resolver este problema, apesar de
subsistirem algumas dvidas quanto ao sucesso da sua
utilizao.
Consideraes nais
A citometria de fluxo tornou-se uma ferramenta poderosa
para o estudo de genomas vegetais e apresenta aplicaes
que vo desde a investigao bsica at indstria. de by ow cytometry. Plant Molecular Biology Reporter 9 (3): 229-233.
esperar que o nmero de aplicaes prticas aumente e que
a citometria de fluxo seja rotineiramente utilizada em estu-
dos de melhoramento vegetal e taxonomia. Todavia como
ferramenta analtica que , a citometria de fluxo apresenta
tambm algumas limitaes que urge ultrapassar (Doleel
1991). As tcnicas de colorao do ADN por fluorescncia
quantitativa que esto disponveis para o estudo de clulas
vegetais so basicamente aquelas que foram desenvolvidas
para clulas animais. Todavia, os corantes actualmente
disponveis no atravessam a membrana plasmtica sendo,
por isso, urgente o desenvolvimento de novos corantes que
permitam efectuar a colorao vital do ADN. Este avano
permitiria determinar o contedo em ADN em clulas
vegetais vivas e possibilitaria a separao destas clulas
consoante o seu contedo em ADN.
Apesar de hoje em dia, a maior parte dos trabalhos de
estimativa do tamanho do genoma j serem realizados uti-
lizando corantes intercalares, ainda existem alguns estudos
em que se utilizam corantes especficos para determinados
pares de bases. Tal como foi j referido esta metodologia
introduz possveis erros, relacionados com as diferenas na
composio em bases entre o padro e a amostra. Outra
limitao que tambm foi abordada o facto de no existir
um consenso na comunidade cientfica acerca dos padres
de referncia a utilizar. Por esta razo os dados obtidos
em laboratrios diferentes so por vezes complicados de
comparar.
A recente problemtica da influncia dos compostos
citoslicos (e.g. compostos fenlicos, alcalides, etc.) na
acessibilidade do IP ao ADN preocupante, uma vez que,
diminui a confiana existente em algumas estimativas j
publicadas mas em que no clara uma preocupao com
este aspecto.
O nosso grupo est a desenvolver um esforo enorme de
forma a tentar optimizar as metodologias utilizadas na
anlise do contedo em ADN nuclear em plantas, e assim
eliminar algumas das limitaes que esta tcnica apresenta
e que esto inerentes ao facto de ter sido originalmente
desenvolvida para o estudo de clulas sanguneas.
Agradecimentos
A aquisio do citmetro de fluxo foi suportada pela FCT
(Projecto POCTI/AGR/C/11142/98). O Joo Loureiro est
a ser apoiado pela bolsa FCT/SFRH/BD/9003/2002. Os
autores agradecem ao Prof. Jaroslav Doleel do Labora-
trio de Citogentica Molecular e Citometria do Instituto
de Botnica Experimental da Repblica Checa pela sua
importante assistncia na citometria de fluxo. Os autores
agradecem igualmente ao Prof. Filipe Sansonetty (Univer-
sidade do Minho).
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Boletim de Biotecnologia 27
 Mtodos em Biotcnologia - Citometria de Fluxo I
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