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PRUEBAS BIOQUMICAS DE IDENTIFICACIN BACTERIANA

UI
13/10/04
1. INTRODUCCIN

Para la identificacin de microorganismos se requiere de ciertos mtodos que evalan el


crecimiento y produccin de sustancias propias de su metabolismo como son las pruebas
bioqumicas las cuales permiten detectar fermentacin de azucares, produccin de
enzimas y algunos metabolitos.

En la mayora de los estudios microbiolgicos se requiere de un aislamiento de un


determinado grupo de bacterias, en el que se requiere de ciertos medios selectivos que
eviten la proliferacin de microorganismos indeseados y permitan apreciar caractersticas
propias del microorganismo de estudio.
2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL

Identificar microorganismos a travs de las diferentes pruebas bioqumicas

2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

Determinar la capacidad de la bacteria de atacar un hidrato especfico, usar el


citrato como nica fuente de carbono, descarboxilar un aminocido, producir
acetona a partir de glucosa, desdoblar el Indol y liberar H2S o gas.
Comprobar la presencia de enzimas como catalasa, coagulasa, ureasa, oxidasa o
gelatinasa y la existencia de flagelos que permitan su movimiento.
Analizar los resultados de las pruebas bioqumicas para la determinacin de la
bacteria que los produjo.
3. MARCO CONCEPTUAL

El metabolismo bacteriano es el conjunto de reacciones que ocurren dentro de una


clulas desde el punto de vista qumico, es decir el metabolismo le da vida y actividad a
las clulas bacterianas, ya que por medio de este puede3n utilizar la energa para
sintetizar ciertos componentes a partir del medio.

Las reacciones metablicas pueden ser: catablicas (descomposicin de molculas


grandes para produccin de molculas ms sencillas liberando energa) o anablicas
(sintetizan componentes propios del microorganismo a partir de sustancias sencillas).

En el anlisis microbiolgico, se hace uso de estos conceptos para determinar que clases
de sustancias sintetizan las bacterias y que sustancias toman del medio para efectuar el
proceso metablico. Para ello, se hace uso de ciertas pruebas bioqumicas que se utilizan
para comprobar la presencia de metabolitos producidos por ciertas reacciones cuando el
microorganismo se encuentra en un medio determinado.

Algunas de las pruebas ms importantes para la identificacin bioqumica de un


microorganismo son:

PRUEBA DE TSI O KIA


El agar con hierro de Kliger (KIA) y el agar con azcar triple hierro (TSI) son medios de
cultivos diferenciales en tubos que cumplen algunos propsitos.

a) La determinacin de un microorganismo para fermentar un hidrato de carbono


especifico incorporado en un medio de desarrollo bsico, con produccin de gas o sin
ella.
b) La determinacin de la posible formacin de cido sulfhdrico (H2S).

Estas pruebas son utilizadas para diferenciar entre los diversos grupos, gneros o
especies, principalmente entre los miembros de la familia Enterobacteriaceae. El KIA
contiene 1% de lactosa, y 0.1% de glucosa; y el TSI, al igual que el KIA, contiene lactosa y
glucosa con las mismas concentraciones, adems de sacarosa con una concentracin del
1%.

Esta fermentacin de carbohidratos tiene lugar tanto en aerobiosis (pico de flauta) como
en anaerobiosis (profundidad). La glucosa es catabolizada inicialmente por la va
metablica de Embden Meyerhot Purnas (EMP) a ATP y cido pirvico, que luego se
convierte en los diversos productos finales estables: cido lctico y/o otros cidos
orgnicos, aldehdos, alcoholes, CO2, H2 y alta energa.

PRUBA DE CITRATO
Esta prueba ayuda a determinar si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como
nica fuente de carbono para el metabolismo, utilizando como medio el Simmons Citrato.
La prueba del citrato sirve para la identificacin de la familia Enterobacteriaceae, de
microorganismos Gram() relacionados, de bacterias no fermentadoras y la diferenciacin
de los gneros. La energa puede ser proporcionada a algunas bacterias por la utilizacin
del citrato como nica fuente de carbono. En las bacterias, el desdoblamiento del citrato
involucra un sistema enzimtico sin la participacin de la coenzima A, la citratasa (citrato
oxalacetato liasa) o la citratodesmolasa. La degradacin inicial del citrato produce el
oxalacetato (sal de cido oxalactico) y acetato (sal de cido actico) que son los
intermediarios en el metabolismo del citrato.

Los productos del metabolismo del citrato dependen del pH del medio. A un pH alto
(alcalino), se produce ms acetato y formato, y se disminuye la formacin de lactato y
CO2. A un pH por encima de 7.0 no existe produccin de lactato y los productos son CO 2,
cido frmico y cido actico. A un pH cido, los principales productos son
acetilmetilcarbinol (acetona) y lactato. A este primer paso metablico en la fermentacin
del citrato, tambin produce piruvato y su degradacin depende entonces del pH del
medio.

Citrato oxalacetato + acetato


Oxalacetato Piruvato + CO 2
El medio utilizado para la fermentacin del citrato tambin contiene sales orgnicas de
amonio. Un microorganismo tambin utiliza estas sales de amonio como su nica fuente
de nitrgeno con la produccin de amoniaco (NH3+) lo que produce la alcalinizacin del
medio y la conversin del (NH32+) a hidrxido de amonio (NH4OH). La utilizacin de los
cidos orgnicos y sus sales como nica fuente de carbono produce carbonatos y
bicarbonatos alcalinos con la posterior degradacin.

PRUEBA DE MOVILIDAD
Esta prueba ayuda a determinar si un microorganismo es mvil o inmvil. Las bacterias
son mviles por medio de flagelos, aparecen sobre todo en los bacilos, sin embargo, unas
pocas formas cocoides son mviles. Los medios de cultivo utilizados para la prueba de
movilidad son semislidos del cual existen dos tipos de medios. Uno que posee pH 7.3 a
base de extracto de carne, peptona, NaCl, agar y agua destilada; y otro a base de
triptosa, NaCl, agar y agua destilada con pH 7.2. Se pueden utilizar sales de tetrazolio en
el medio para movilidad. Sin embargo, este reactivo inhibe ciertos microorganismos. Al
utilizar sales de tetrazolio hay variantes en los resultados, entonces un resultado (+) o
mvil se ve por la produccin de una nube turbia rosa que difunde en todo el medio y un
resultado () inmvil se observa produccin de una lnea roja brillante confinada a la lnea
de siembra y el medio circundante permanece claro.

PRUEBA DE VOGES PROSKAUER


Esta prueba utiliza como medio de cultivo el caldo (MR VP). Sirve para la determinacin
de la capacidad de algunos microorganismos para producir un producto final neutro,
acetilmetilcarbinol (AMC, acetona) a partir de la fermentacin de la glucosa. La glucosa
es metabolizada a cido pirvico, el principal intermediario en la gluclisis. A partir del
cido pirvico, las bacterias pueden seguir muchos caminos metablicos, la produccin
de acetona es una de las vas metablicas de degradacin de la glucosa en las bacterias.

La prueba VP se utiliza sobre todo para separar Escherichia coli de Klebsiella


Enterobacter, aunque otros miembros de la familia Enterobacteriaceae puede producir
resultados positivos de VP. Los miembros de la familia Enterobacteriaceae se clasifican
de manera caracterstica como fermentadores de la glucosa a cidos mixtos (frmico,
actico, succnico), etanol, hidrogeno y CO2. Esta familia puede ser dividida en dos
grupos.

a) Los que producen cidos pero no 2,3 butanodiol, como E. coli (VP).
b) Los que producen 2,3 butanodiol como sus productos finales, como los grupos
Klebsiella Enterobacter (VP+).

El principal producto final de la utilizacin del piruvato de estos grupos es el 2,3


butanodiol. Sin embargo, la prueba VP se basa en la de acetona, un precusor en la
produccin del 2,3 butanodiol. Una molcula de acetona se forma por la descarboxilacin
de dos molculas de cido pirvico. Tanto la acetona como el 2,3 butanodiol son
productos neutros de la fermentacin de glucosa. La produccin de 2,3 butanodiol
aumenta la produccin del CO2 lo que da por resultados en la formacin de medios cidos
y la acumulacin de acetona.
4. PROCEDIMIENTO

4.1. PRUEBA TSI Y CITRATO 4.2. PRUEBA DESCARBOXILASA

TSI
Siembras S.Citrato LIA
Siembra

Incubaciones 24h (TSI) 37C


(37C) 24h - 72h (S.C) Incubacin 24 48 h

Observaciones Observaciones

4.3. PRUEBA DE MOTILIDAD Y H2S 4.4 PRUEBA VOGES PROSKAUER

Caldo
SIM Siembra RM - VP
Siembra
37C
37C Incubacin 48 96 h
Incubacin 24 48 h.

Adicin del 0.6 ml -naftol 5%


Adicin del Kovacs
5 gotas Reactivo 0.2 ml KOH 40%
Reactivo

Agitacin
Agitacin
suave

Observaciones Aire Libre


Reposo 15 minutos

Observaciones
4.5. PRUEBA DE ROJO DE METILO 4.6. PRUEBA DE CATALASA

Caldo Asa en
Inoculacin RM - VP Tomar dos punta
colonias
37C
Incubacin 48 96 h.
Portaobjetos No frotar

Adicin del Kovacs


Reactivo 5 gotas Adicin del H2O2
Reactivo 1 gota
Observaciones
Observaciones

4.7. PRUEBA DE COAGULASA 4.8. PRUEBA INDOL

Plasma
0.5 ml Cultivo Caldo peptona
Humano Inoculacin Tripticase

37C
Incubacin 24 48 h.
Tubo de ensayo
Adicin del Kovacs
Girar Reactivo 5 gotas
suavemente
37C Agitacin
Incubacin 4 horas

Observaciones
Observaciones
4.9. PRUEBA DE NITRATO 4.10. PRUEBA GELATINASA

Caldo Medio
Inoculacin Nitrato Siembra Gelatina

37C 37C
Incubacin 24h. Incubacin 24 120 h

Adicin del Griessilosvay Refrigeracin


Reactivo 5 gotas
Tubo de
Comparacin Control
Observaciones
Observaciones

4.11. PRUEBA OXIDASA 4.12. PRUEBA UREASA

Asa en Urea de
Tomar una punta Siembra Chistensen
colonias
37C
Incubacin 24 144 h
Colocar en la
Papeleta
parte reactiva
Observaciones

Esperar 60 seg.

Observaciones
4.13. SIEMBRA EN MEDIOS SLIDOS

Siembra

Agar Braid Agar Agar Sangre Agar


Parker Hecktoen EndoC

Incubacin 37C 48Hs.

Observaciones
5. RESULTADOS

5.1. PRUEBAS BIOQUIMICAS


Prueba Medio PH Indicador Resultados
TSI TSI 7.4 Rojo de fenol Ac/Ac
Citrato Simmons Citrato 6.9 Azul de bromotimol +
Descarboxilasa LIA 6.7 Prpura de
bromocresol
Motilidad y H2S SIM 7.3 Tiosulfato de sodio Mvil, Sin H2S ni
gas.
Voges Proskauer C. MR VP 6.9 Rojo de eosina
Rojo de metilo C. MR VP 6.9 Rojo de metilo +
Catalasa H2O2 +
Coagulasa Plasma sanguneo
Indol C. Peptona Tripticase 6.8 Kovacs
Nitrato C. Nitrato 7.2 Griess ilosvay
Gelatinasa M. Gelatina 6.9 +
Oxidasa Tiras impregnadas de
oxidasa
Ureasa Urea de Christensen 7.2 Rojo de fenol +

5.2. SIEMBRA EN MEDIOS SLIDOS


Al sembrar un inoculo de Salmonella sp. de medio liquido a un medio slido se obtuvieron
los siguientes resultados:

5.2.1. Agar Hecktoen: Se present un crecimiento de colonias enteras de color negro y


verde azulado circulares y convexas con un esparcimiento en el medio de color verde.

5.2.2. Agar Endo C


Se present un esparcimiento de telillas de color fucsia sobre el medio produciendo un
cambio de color en el medio de color mamn a fucsia.

5.2.3. Agar Braid Parker


se present un ennegrecimiento del medio y las colonias crecieron por alrededor de la
lnea de siembra separndose adecuadamente las colonias de color negro, puntiformes,
convexas y enteras.

5.2.4. Agar Sangre


Al crecer el microorganismo, el medio cambi de un color rojo a caf oscuro,
esparcindose en forma de nubes blancas por todo el medio.
6. ANALISIS DE RESULTADOS

6.1. PRUEBA DE TSI


El cambio de coloracin original del medio a una coloracin amarilla en su totalidad,
corresponde a un resultado observado fue cido/ cido, por lo que este microorganismo
fermenta la lactosa, la sacarosa y la glucosa sin produccin de gas ni H2S.

6.2. PRUEBA DE CITRATO


Al cambiar de una coloracin verde a una coloracin azul en su totalidad, el resultado
para esta prueba es positiva lo que da a entender que el microorganismo utiliza el citrato
como nica fuente de carbono.

6.3. PRUEBA DE MOTILIDAD Y H2S


La prueba de Motilidad en medio SIM revel que el microorganismo es mvil, aerobio y
que no produce H2S.

6.4 PRUEBA VOGES PROSKAUER


Despus de sembrar el microorganismo en el caldo MR-VP se observaron sedimentos al
igual que la mayora de los otros caldos, pero al adicionar el reactivo indicado para la
prueba, se observ una coloracin amarilla en la superficie , lo que indica que la prueba
es negativa; es decir, el microorganismo inoculado no obtiene como producto final neutro
el acetilmetilcarbinol a partir de la fermentacin de glucosa

6.5. PRUEBA DE ROJO DE METILO


Al inocular en el caldo se present un crecimiento igual que el de la prueba para Voges
Proskauer, pero al adicionar el reactivo se produjo un anillo rojo en la superficie, indicando
que la prueba dio positiva, es decir, que el microorganismo produjo y mantuvo estable los
productos terminales cidos de la fermentacin de la glucosa, venciendo as, la capacidad
amortiguadora del sistema.
6.6. PRUEBA DE CATALASA
Al tomar una de las colonias del medio de cultivo, y adicionarles sobre un portaobjetos
H2O2, se produjo un burbujeo en la superficie, indicando que haba una enzima presente
llamada catalasa capaz de desdoblar el perxido de hidrgeno.

6.7. PRUEBA DE COAGULASA


Al mezclar una parte del microorganismo Salmonella sp. con el plasma sanguneo, y
dejarlo en incubacin durante cuatro horas, no se produjo ningn cambio, es decir, el
microorganismo es coagulasa negativo, por lo que se puede decir, que el no tiene la
capacidad de coagular el plasma.

6.8. PRUEBA INDOL


Al inocular el microorganismo de estudio en el caldo peptona tripticase y adicionar el
reactivo correspondiente, no se produjo ningn cambio en la coloracin, es decir, ste
microorganismo no posee la capacidad de desdoblar el Indol de la molcula de triptfano.

6.9. PRUEBA DE NITRATO


Al inocular el microorganismo en el caldo nitrato, y adicionar despus de el tiempo de
incubacin el reactivo respectivo, no se produjo ningn cambio de color a rosado, lo cual
indica que el microorganismo no posee la capacidad de degradar la molcula de nitrato a
nitritos.

6.10. PRUEBA GELATINASA


Al inocular en el medio gelatina, y dejar incubar el tiempo correspondiente, el
microorganismo licu la gelatina, lo cual significa que el microorganismo puede producir
enzimas de tipo proteoltico (gelatinasa), la cual es capaz de degradar la gelatina.

6.11. PRUEBA OXIDASA


Al colocar una colonia del microorganismo en la parte reaccionante de la tira que contena
oxidasa, este no produjo ningn cambio en su coloracin, por lo que se puede decir que el
microorganismo es oxidasa negativo, es decir, el microorganismo no posee la enzima
oxidasa.
6.12. PRUEBA UREASA
Al sembrar el microorganismo de prueba en un medio inclinado (Urea de Christensen), se
produjo inicialmente una coloracin amarilla que vir posteriormente a una coloracin
fucsia en su totalidad, lo cual significa que el microorganismo es ureasa positivo, es decir,
este tienen la capacidad de desdoblar la urea por la accin de la enzima ureasa,
produciendo as amoniaco.

6.13. SIEMBRA EN MEDIOS SLIDOS

6.13.1. Agar Hecktoen


Al observarse colonias negras y verde azuladas con anillos alrededor, indica que la
Salmonella sp. creci en un medio selectivo para su familia (Enterobacteriaceae), esto
quiere decir que este microorganismo es fermentador de hidratos de carbono.

5.2.2. Agar Endo C


La Salmonella sp tuvo un crecimiento inadecuado, debido a que este medio es selectivo
solo para coliformes y fue inhibida por dos sustancias llamadas sulfito sdico y fucsina
bsica.

5.2.3. Agar Braid Parker


Este medio es altamente selectivo para el Staphylococcus aureus, el cual se desarrolla de
la manera vista en los resultados obtenidos. Esta observacin conlleva a deducir que el
microorganismo que se desarroll es Staphylococcus aureus, es decir, la cepa utilizada
para sembrar, posiblemente estaba contaminada de este tipo de microorganismo.

5.2.4. Agar Sangre


Este medio es altamente selectivo para bacterias patgenas exigentes como el
Staphylococcus aureus, que se desarroll de manera exuberante, ya que abarc todo el
medio de cultivo. Esto es otro indicio de que el cultivo utilizado para sembrar estaba
contaminado por esta especie.
7. INVESTIGACIN

- Fundamento de los medios de cultivo empleados para la siembre de la Salmonella sp.

Medio PH Indicador Fundamento Resultados Microorg.


esperados
A. Hecktoen 7.7 Azul de Permite el crecimiento Colonias de Bacterias
bromotimol selectivo de microorg. que color negro, patgenas
Fucsina fermenten carbohidratos e azul verdoso, intestinales
bsica inhibe la flora acompaante con anillos como: Shigella,
Sal de hierro por medio de sales biliares. blancos a su Salmonella,
alrededor. Proteus,
Coliformes,
Pseudomonas.
A. Endo C 7.4 Fucsina Permite el crecimiento de Un brillo Staphylococcus
bsica microorganismos que metlico aureus,
fermenten lactosa, y estable en las Bacillus
produzcan aldehdos y colonias de E.coli y
cidos. reflejo verde, Enterococcus
y algunas con
coloracin
roja.0
A. Braid Parker 6.8 Telurito Permite el crecimiento de Colonias Staphylococcus
los microorganismos que negras, aureus y
reduzcan el telurio, permite convexas, con Staphylococcus
la deteccin de bordes epidermidis
Staphylococcus e inhibicin blanquecinos
de la flora acompaante rodeados por
un halo claro,
presencia de
anillos opacos
A. Sangre 6.8 ------------- Ofrece una base nutritiva Crecimiento Staphylococcus
con condiciones ptimas de precoz y con aureus, gnero
crecimiento para mayor Streptococcus,
microorganismos patgenos exuberancia Listeria,
Bacillus y
Clostridium
8. CONCLUSION

El microorganismo estudiado mediante pruebas bioqumicas es un microorganismo que


fermenta la glucosa, la lactosa, la sacarosa, usa el citrato como nica fuente de carbono,
es mvil, aerobio, no produce gas, ni sulfuro, produce y mantiene estable los productos
terminales cidos de la fermentacin de la glucosa, posee las enzimas catalasa,
gelatinasa.

Por otro lado, la Salmonella sp. que fue inoculada en medios de cultivo especiales,
resulto contaminada por el microorganismo Staphylococcus aureus, debido a que los
resultados eran poco congruentes para la Salmonella.
BIBLIOGRAFIA

MERCHANT, D. V. M. Bacteriologa y virologa veterinarias. Ed. Acribia, S.A. 3ra


Edicin. Zaragoza (Espaa). 1970.

COLLINS, C.H. Mtodos microbilogicos. Ed. Acribia, S.A. Zaragoza (Espaa).1989.

BALTIMORE BIOLOGICAL LABORATORY, INC. Medios de cultivo, materiales e


instrumentos para laboratorios de microbiologa. Editorial B.B.L. Cuarta edicin.
Baltimore, Maryland. (E.U.A). 1959.

STANIER, Roger. Microbiologa. Editorial Revert S.A. Segunda edicin. Barcelona


Espaa 1996.

Enciclopedia ENCARTA 2000. Microsoft Corporation 1993 1999.

http://www.monografias.com/trabajos15/microorganismos/microorganismos.shtml-
ANEXO A
RESULTADO DE PRUEBAS BIOQUIMICAS

1. PRUEBA TSI 2. PRUEBA CITRATO

Antes Despus
Antes Despus

3. PRUEBA MOTILIDAD Y H2S 4. PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER

Antes Despus
Antes Despus
ANEXO B
RESULTADO DE PRUEBAS BIOQUIMICAS

5. PRUEBA DE ROJO DE METILO 6. PRUEBA DE CATALASA

Antes Despus Antes Despus

7. PRUEBA DE COAGULASA 8. PRUEBA INDOL

Antes Despus Antes Despus


ANEXO C
RESULTADO DE PRUEBAS BIOQUIMICAS

9. PRUEBA DE NITRATO 10. PRUEBA DE GELATINASA

Antes Despus Antes Despus

11. PRUEBA OXIDASA 12. PRUEBA UREASA

Antes Despus
Antes Despus
ANEXO D.
RESULTADOS DE SIEMBRAS EN MEDIO SLIDOS

AGAR HECKTOEN AGAR ENDO C

AGAR BRAID PARKER AGAR SANGRE

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