EFECTO ANTIOXIDANTE DE LA SUPLEMENTACIN DE LA DIETA DE VACAS

HOLSTEIN EN ETAPA FRESCA CON UN NUTRACUTICO A BASE DE

MANZANA

Laura Elena Escobedo-Morales, Juan Alberto Grado-Ahuir, Carlos Rodrguez

Muela, Pedro Hernndez-Briano

Facultad de Zootecnia y Ecologa, Universidad Autnoma de Chihuahua

Ph D. Juan Alberto Grado Ahuir

Facultad de Zootecnia y Ecologa, Universidad Autnoma de Chihuahua.

Perifrico Francisco R. Almada kilmetro 1., Chihuahua, Chih.

Telfono: 434-03-63 y 434-03-04 ext.15

Fax: 434-03-45

Trabajo realizado con el apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa

(CONACyT) y el Fondo Mixto CONACYT Gobierno del estado de Chihuahua.

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RESUMEN

Recientemente se ha asociado el uso de antioxidantes de origen natural en la

formulacin de las raciones de ganado con un efecto en la reduccin del estrs

oxidativo. Los compuestos fenlicos contenidos en la manzana son reconocidos

antioxidantes en plasma, mientras que a nivel celular los sistemas de defensa

preventivos estn conformados por enzimas antioxidantes. Se realiz el anlisis

de la actividad antioxidante en plasma y la expresin gentica comparativa de las

principales enzimas antioxidantes en glbulos blancos de vacas lecheras. Se

analizaron 8 vacas de la raza Holstein en etapa fresca, que fueron asignadas

aleatoriamente a uno de los dos grupos experimentales; grupo testigo y grupo

alimentado con un suplemento nutracutico elaborado a base de Manzana

(Manzarina). No se encontraron diferencias significativas en la actividad

antioxidante en plasma respecto al grupo control (P=0.07) Los genes que codifican

para las enzimas catalasa y SOD tuvieron un mayor nivel de expresin (P<0.05)

en las vacas del grupo GM (1.390.16, y 1.430.19 veces ms, respectivamente).

Para el nivel de expresin de GPX no se encontr efecto entre grupos (P=

0.4893). Mediante el anlisis de expresin realizado en este trabajo se relacionan

los efectos antioxidantes de la dieta a base de Manzarina con aumento en los

niveles de ARNm de dos enzimas antioxidantes CAT y SOD2 (mitocondrial) mas

no en la actividad antioxidante plasmtica, lo que involucra que los compuestos

antioxidantes por s mismos modulan la actividad enzimtica pero dependen de

otros factores para lograr la reduccin de EROs en plasma.

PALABRAS CLAVE: Manzana antioxidante vacas lecheras expresin enzimas

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INTRODUCCCIN

El bagazo de manzana se define como el residuo generado en el proceso de

extraccin de jugo de manzana y representa entre 15 y 20 % de la fruta procesada

en el estado de Chihuahua (Manterola, 1999), caracterizndose por su relativo alto

contenido de carbohidratos solubles y un bajo contenido proteico (5.93 %) y de un

14 a 26 % de materia seca (Ferreiro et al., 1983).

Este subproducto de la manzana se puede incorporar en la dieta de bovinos en

desarrollo hasta en un nivel del 80 %, complementndose con una fuente de

protena, donde se han obtenido ganancias de 500 gramos diarios (Castellanos,

1986).

En vacas con produccin de 12 a 15 litros/da se ha recomendado suministrar

bagazo de manzana hasta en un 40 % de la materia seca de la racin (Edwards y

Parker, 1995). Anrique y Dossow (2003) llevaron acabo un estudio donde

proporcionaron 0, 20 y 30 % de bagazo ensilado de manzana a vacas Frisn

Negro, reportando mayor produccin (5.9%) en los grupos donde se adicion

bagazo. La Manzarina se puede definir como el producto obtenido a partir del

bagazo de manzana mediante la fermentacin en estado slido, cuyo objetivo es

obtener un producto de mayor calidad, por el nivel y tipo de protenas, que se

producen durante este proceso, gracias a las levaduras y carbohidratos, que

posee el bagazo y que son fundamentales para llevar acabo el proceso de

fermentacin aerobia (Elias y Lezcano, 1993).

Un antioxidante es cualquier sustancia capaz de atenuar los efectos de oxidacin

de las sustancias oxidantes cuando se aade a stos (Sies, 1997; Duthie, 1999).

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Son sustancias que aunque estn en muy poca concentracin, tienen la capacidad

de inhibir la oxidacin causada por los radicales libres, estos pueden ser enzimas

naturales, antioxidantes obtenidos mediante la dieta o bien farmacolgicos

(Martnez-Flores et al., 2002).

Los antioxidantes se dividen en dos grupos: Internos y Externos, los primeros se

dividen a su vez en enzimticos entre los que destaca la superxido dismutasa, la

catalasa, y el sistema de la glutatin y los no enzimticos como la albmina,

ciertos cidos grasos, nicotinamida, ADP, ceruloplasmina, metabolitos

estrognicos, tocoferoles, cido ascrbico, carotenos o el cido rico y otros

compuestos activos procedentes de las plantas como polifenoles, carotenos,

antocianinas y taninos (Ramn, 1993).

Surh et al. (2005), mencionan que una amplia variedad de fitoqumicos, que son

quimiopreventivos, los cuales son principalmente antioxidantes y antiinflamatorios

que modulan los factores de transcripcin que activan los sistemas redox en la

clula. La manzana es una fruta rica en estos fitoqumicos benficos para la salud

y dentro de stos se encuentran los polifenoles con capacidad antioxidante, cuya

accin ha sido evaluada a partir de extractos de diferentes partes de la fruta, como

piel y pulpa (Gonzlez-Laredo et al., 2007). Podsedek et al. (2000), encontraron en

promedio un contenido de 2.3 a 3.6 g/kg de polifenoles totales en la manzana, de

los cuales el de mayor cantidad fue el cido clorognico (30 a 430 mg/kg); las

catequinas y equicatequinas se encontraron en un rango de 18 a 89 mg/kg.

Teniendo en cuenta lo anterior el objetivo del presente trabajo fue realizar el

anlisis de la expresin gentica comparativa, de tres enzimas antioxidantes, en

glbulos blancos de dos grupos de vacas lecheras (Testigo y Sumplementado) as

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como la actividad antioxidante total en plasma, para evaluar el efecto integral de la

suplementacin con manzarina en vacas con alta demanda metablica.

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MATERIALES Y MTODOS

Descripcin del rea de Estudio

El presente trabajo se llevo a cabo en la Unidad de Produccin Lechera y

Laboratorio de Transgnesis Animal y Fertilizacin in vitro de la Facultad de

Zootecnia y Ecologa de la Universidad Autnoma de Chihuahua, ubicada en el

Perifrico Francisco R. Almada en el km. 1 con coordenadas 28 35 de latitud

norte y 106 04 de longitud oeste.

Grupos Experimentales

Para realizar este trabajo se conto con 8 vacas de la raza Holstein en etapa

fresca, que fueron asignadas aleatoriamente a uno de los dos grupos

experimentales; grupo testigo y grupo sometido a la dieta, con pesos de 657.0

23.0 y 584.1 23.0 kg y con 2.5 y 2.0 lactancias en promedio, respectivamente.

Tratamientos

Los dos grupos de vacas fueron evaluados por un periodo de dos meses, durante

los cuales se les ofreci la misma racin (Cuadro 1), pero a un grupo se le ofreci

adems, un bloque multinutricional que proporcion el alimento nutracutico

elaborado a partir de bagazo de manzana (Manzarina) (Cuadros 2 y 3).

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CUADRO 1. DIETAS EN BASE SECA OFRECIDAS A LOS GRUPOS DE VACAS

(BASE HMEDA)

Tratamiento
Ingrediente (Kg/animal/ da)
Testigo Manzarina

Alfalfa (Kg) 5.17 5.17

Ensilado de maz (Kg) 15.0 15.0
Alimento balanceado (Kg) 12.0 11.0
Alimento nutracutico (Kg) 0 1.7
TOTAL 32.17 32.87

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CUADRO 2. CONTENIDO Y PORCENTAJE DE INGREDIENTES EN ALIMENTO

NUTRACEURICO

Ingrediente Base seca (%) Base hmeda (%)

Aglutinante (cemento) 5.55 3.01

Aglutinante (calhidra) 3.70 2.01
Bagazo de manzana 20.0 49.28
Harinolina 8.26 5.00
Maz molido 17.39 10.71
Melaza de caa 12.20 10.01
Pasta de soya 15.50 9.44
Salvado de trigo 16.45 10.02
Sal comn 0.95 0.51

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CUADRO 3. CONTENIDO DE BAGAZO DE MANZANA FERMENTENTADO

UTILIZADO COMO PRINCIPAL INGREDIENTE EN LA

FABRICACION DEL SUPLEMENTO NUTRACUTICO

Ingrediente Cantidad

Bagazo de manzana (Kg) 93.8

Inoculo de manzana (mL) 600.0
Melaza de caa (Kg) 5.0
Premezcla mineral Ganatec (Kg) 0.3
Sulfato de amonio (Kg) 0.2
Urea (Kg) 0.5
TOTAL (kg) 100

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Toma y Manejo de las Muestras

Los animales fueron muestreados cada dos semanas, 2 en el mes de marzo y 2

en el mes de Abril de 2011.Se realizaron registro del peso, y se obtuvo una

muestra por animal en ambos tratamientos, por puncin de la vena caudal; dicha

muestra se recolect en tubos con y sin EDTA como anticoagulante, fueron

transportadas en hielo y se almacenaron a temperatura de refrigeracin a 4C

para su inmediato procesamiento.

Determinacin de Actividad Antioxidante

Para esta tcnica se prepararon tres soluciones; a la primera (Solucin buffer, 300

mMol CH3COONa, pH 3.6) se le agregaron 3.1 g de acetato de sodio trihidratado,

16 mL de acido actico glacial y se afor a un litro con agua destilada. La segunda

(solucin TPTZ, 10 mMol 2,4,6-tripyridyl-s-triazine), se prepar agregando 0.031 g

de TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine) en 10 mL de solucin al 40 mMol de HCl.

La tercera (solucin de cloruro frrico hexahidratado, 20mMol FeCl36H2O) se

prepar agregando 0.054 g de cloruro frrico hexahidratado por cada 10 mL de

agua destilada. La solucin FRAP o solucin de trabajo se prepar mezclando en

una proporcin 10:1:1 la solucin buffer, la solucin TPTZ, y la solucin de cloruro

frrico. (Benzie y Strain, 1996; Szllsi y Varga, 2002; Oyawoye et al., 2003).

Preparacin de estndar y curva de calibracin. Se prepar una solucin

estndar agregando 0.0417 g de sulfato ferroso heptahidratado (FeSO47H2O) en

50 mL de metanol grado HPLC (CH3OH); de la solucin estndar se tomaron 0.0,

0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1 mL, a dichas cantidades se les agreg metanol (excepto a la

ltima) hasta completar 1 mL y posteriormente a cada una se les agreg 3 mL de

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agua destilada en celdas para espetrofotmetro (Cuadro 6), se agitaron en vortex,

se extrajeron 200 L y se agregaron en 1,800 L de solucin FRAP y nueva mente

se pasaron a vortex; despus de 10 minutos de agregada la solucin FRAP se

procedi a tomar la lectura en un espectrofotometro marca Junior II Coleman

modelo 6/20 una absorbancia de 593nm. Con los datos obtenidos se elabor una

curva de prediccin en base a una ecuacin de regresin (Chacn et al., 2006).

Preparacin de Muestras

Una vez descongelado el plasma, se tomaron 7 L y se aadieron a un tubo en el

que previamente se haban colocado 200 L de agua, posterior a lo cual se

agregaron 195 L de metanol y se mesclaron con vortex; a dichas mezclas se les

adicionaron 2,000 L de solucin FRAP, despus de 10 minutos de se procedi a

tomar la lectura a una absorbancia de 593nm registrando los datos.

PCR-RT

La retrotranscripcin del ARN a ADNc fue realizada siguiendo el protocolo de un kit

comercial (High capacity cDNA reverse transcription kit, Applied Biosystems)

brevemente se uso el mtodo de reaccin con 10x RT buffer, 25X dNTP (100mM),

10X RT iniciadores aleatorios, transcriptasa reversa multiscribe 5U/ l, inhibidor de

ARNsas y agua libre de nucleasas. Se ajustaron las concentraciones a un

volumen de reaccin de 20 l y se ejecut un programa en el termociclador que

incluye 25C 10 min, 37C 120 min, 85C 5 min, y 4C hasta retirar los tubos;

finalmente las muestras fueron cuantificadas en el Nanodrop para la opcin ADN y

almacenadas a -70C.

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PCR Cuantitativa

La PCR cuantitativa fue realizada en el equipo de PCR en tiempo real STEP ONE

de Applied Biosystems, usando sondas comercialmente disponibles para los

genes SOD2 (20X, FAM, bt03244551_ml Applied Biosystems), GPX-1 (20X, FAM,

bt03259217_gl Applied Biosystems) y CAT (20X, FAM, bt03228716_ml Applied

Biosystems), bajo las siguientes condiciones de amplificacin en el programa:

95C por 10 minutos, 95C 15 segundos, y 60C por un minuto. Las mediciones se

realizaron con una concentracin de 100ng de ARN por muestra en 20l de

reaccin. Todos los plsticos, aditamentos y reactivos fueron esterilizados, libres

de nucleasas y grado biologa molecular. El diseo de los pozos se realiz en el

programa del equipo (Stepone software v2.0) donde se analiz cada muestra por

duplicado con su control endgeno (GAPDH) el cual calcula el ciclo umbral (C T)

para cada gen analizado.

Anlisis Estadstico

La actividad antioxidante, se analiz con el procedimiento GLIMMIX del programa

SAS, el modelo fue: Yijk = + Vi + Pj + Tk + (PT)ik + .

Donde:

Yijk.- Variable de respuesta

.- Media general

Vi .- Efecto de la i-sima vaca

Pj .- Efecto del j-simo muestreo

Tk .- Efecto del k-simo tratamiento

(PT)ik Efecto de la interaccin del i-simo muestreo con el k-simo tratamiento

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- Error experimental.

Considerando como efectos aleatorios el error experimental y las vacas

seleccionado para el estudio.

Para el anlisis de expresin gentica los datos fueron analizados utilizando el

-C
paquete estadstico SAS 9.0 aplicando el mtodo 2 T descrito por Livak et al.,

(2001), ajustando un modelo mixto que incluy como efecto fijo el grupo

experimental y las vacas como efecto aleatorio, utilizando el procedimiento MIXED

(SAS, 2002).

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RESULTADOS

Actividad antioxidante

Con respecto a esta variable, las medias obtenidas para cada uno de los

tratamientos fueron: 14.33 0.037 mM Fe2 y 14.44 0.0.37 mM Fe 2 para el para el

grupo nutracutico y para el grupo testigo, respectivamente; los cuales no fueron

diferentes entre s (P=0.07 Grafica 1), al respecto Gallegos (2006) reporta

resultados donde no se encontr diferencia significativa entre tratamientos en

cuanto a la actividad antioxidante de vacas Holstein alimentadas con manzarina.

La interaccin de tratamiento y muestreo no fue estadsticamente significativa

(P>0.05; Grafica 2), se puede observar que el grupo que recibi el alimento

nutracutico mostro una actividad casi constante durante el experimento, mientras

que en el ultimo muestreo el grupo testigo mostro un aumento en su actividad

antioxidante pero aun as estas diferencias no fueron significativas

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Cuantificacin Relativa de Enzimas Antioxidantes

Para el gen que codifica para la enzima catalasa (Grfica), se encontraron

diferencias significativas entre los grupos (P=0.0146), as como entre muestreos a

travs del tiempo (P=0.0272). No se encontr significancia para la interaccin

entre grupo y muestreo (P=0.1270). Para la Superxido dismutasa 2 (Grfica), se

encontraron diferencias significativas entre grupos (P=0.0068), no se encontraron

diferencias significativas entre muestreo (P=0.7724). As mismo, no resulto

significativa la interaccin entre grupo y muestreo (P= 0.1675). Respecto a la

expresin de la enzima glutatin peroxidasa (Grficas), no se encontraron

diferencias significativas entre grupos (P= 0.4893), sin embargo se encontraron

diferencias significativas entre muestreos (P=0.0278), y no se encontr diferencia

significativa para la interaccin entre grupo y muestreo (P=0.9515). El grupo

suplementado con Manzarina present un mayor nivel de expresin para los

genes que codifican para las enzimas catalasa y SOD2 en relacin al grupo

control, mientras que no se observaron diferencias para GPX-1.

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 CUADRO Medias (Error estndar) de la expresin relativa de enzimas

antioxidantes por tratamiento

Gen Manzarina Testigo

Catalasa 2.170.16a 1.550.16b

Glutatin peroxidasa 1 6.260.43a 5.830.43a
Superxido dismutasa 2 2.720.19a 1.900.19b

a.b Literales diferentes entre filas, denotan diferencia estadsticamente significativa (P<0.05).

Expresin de CAT por Periodo

4
Manzarina
expresin (Fold change)

Control
3
Diferencias de

Periodos de muestreo

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 Las tres enzimas forman parte del sistema antioxidante enzimtico primario,

dentro de la clula a nivel mitocondrial. Una amplia variedad de compuestos son

capaces de inducir la transcripcin de dichas enzimas, entre ellas Interleucinas (IL-

1, IL-4, IL-6), TNF, Lipopolisacarido (LPS), y el interferon (IFN).

El suplemento alimenticio ofrecido a los animales, proporciona minerales,

como el Manganeso (Mn) que en humanos y cobayos estimula la expresin de

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enzimas como la SOD2, funcionando como cofactor enzimtico. Estudios de

Hernndez (2011) demuestran que la suplementacin a base de Manzarina

incrementa la actividad de estas enzimas antioxidantes en plasma de ganado

lechero, lo que se correlaciona con las expresiones a nivel ARNm. Con los

resultados obtenidos proponemos que la presencia de Manzarina en la dieta se

relaciona con la induccin a nivel mitocondrial de (ARNm) de las enzimas

antioxidantes catalasa y superxido dismutasa, que proporcionan una defensa

fundamental de los glbulos blancos sanguneos del animal a las especies

reactivas de oxgeno. Para optimizar el desempeo de las vacas en produccin

que estn sometidas a estrs calrico, oxidativo, se recomienda suplementar con

antioxidantes (Weiss et al., 1997; Allison and Laven, 2000). Trabajos realizados

por Gallegos (2007) demuestran que la dieta con Manzarina, mejora el estado de

salud del animal, al encontrarse una disminucin en el recuento de clulas

somticas, aumento de peso, aumento en la actividad antioxidante en plasma.

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