I.

Prosedur
1. Pembuatan Fase Gerak

Dapar disaring
ditambahkan asam dengan Filter
Pembuatan dapar
fosfat hingga pH eluen, lalu buat
Fosfat dengan
2,5 selanjutnya di eluen dengan
melarutkan 6,9
add dengan mencampur 950
Dinatrium Hidrogen
Aquadestilata mL Dapar fosfat
fosfat dengan
steril sampai 1000 pH 2,5 dan 50 mL
aquabidestilata steril
mL Asetonitril (95: 5)

2. Pembuatan Larutan Baku Induk Pembanding Akrilamid

a. Pembuatan Larutan Baku Induk Pertama (1000 ppm)

Kemudian
Timbang 50 mg Setelah larut
ditambahkan sedikit
akrilamid lalu tambahkan pelarut
pelarut (asetonitril :
masukan kedalam sampai garis tanda
Dapar fosfat) kocok
labu ukur 50 mL
hingga larut

b. Pembuatan Larutan Baku Induk Kedua (100 ppm)

Dipipet 5 mL Kemudian Setelah larut

larutan Baku induk ditambahkan sedikit tambahkan
pertama lalu pelarut (asetonitril : pelarut sampai
masukan ke dalam Dapar fosfat) kocok garis tanda
labu ukur 50 mL hingga larut

3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimumc

Penentuan Panjang gelombang maksimum dilakukan pada panjang gelombang

200-400 nm menggunakan pelarut dapar fosfat : Acetonitril (95:5)

4. Penentuan Kondisi Optimum KCKT

Kondisi percobaan dipilih kolom Zorbax Eclipse XDB-C18 (3x150 mm ; 3,5
m), laju alir 0,5 mL / menit, suhu 25 0C, volume sampel yang disuntikan 20 L.
penentuan kondisi optimum mengacu pada beberapa parameter kualitas
pemisahan , yaitu waktu pemisahan (tR) , faktor kapasitas (k) dan efisiensi kolom
 (n). Persyaratan kesesuaian sistem kromatografi , yaitu waktu retensi (5 menit <
tR < 10 menit), faktor kapasitas (1 < k < 10 ) dan jumlah plat teoritik (N > 10000)
5. Pembuatan Kurva Kalibrasi
Disuntikan Dibuat kurva
Larutan Baku sebanyak 20 L antara
eksternal dibuat ke dalam konsentrasi
dengan konsentrasi 1 kolom pada (sumbu x)
ppm,2 ppm,3 ppm,4 kondisi yang terhadap luas
ppm,5 ppm,6 ppm telah permukaan
ditentukan (sumbu y)

II. Data Pengamatan

No Konsentrasi AUC / Tinggi Puncak

1 1 ppm 2849073
2 2 ppm 4661931
3 3 ppm 8329991
4 4 ppm 10452353
5 5 ppm 13756294
6 6 ppm 15427819
 I. Prinsip Metode HPLC

HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah campuran
komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiaap komponen dalam sampel
berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya
adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang
biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe 2SiCl, dimana R adalah
rantai alkana C-18 atau C8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur
komposisinya (gradien elusi), misalnya : air:asetonitril (80:20), hal ini bergantung pada
kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan
kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang
punsak-puncaknya terpisah.

Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi karena perbedaan

kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Keunggulan menggunakan HPLC
dibandingkan kromatografi gas yaitu terletak pada kemampuannya untuk menganalisis
cuplikan yang tidak menguap dan labil pada suhu tinggi. HPLC tidak terbatas pada senyawa
organik tapi mampu menganalisis senyawa anorganik, mampu menganalisis cuplikan yang
mempunyai molekul tinggi (beratnya), mampu menganalisis cuplik yang mempunyai titik
didih yang sangat tinggi seperti polimer.

Kurva Kalibrasi Akrilamid

18000000
16000000 15427819
14000000 f(x) = 2637119.46x + 16325.4 13756294
R = 0.99
12000000
10000000 10452353
8000000 8329991
6000000
4000000 4661931
2849073
2000000
0 1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6

Ppm AUC
Linear (AUC)