Validao de mtodo de cromatografia lquida para

Artigo Tcnico
a determinao de sete cidos graxos volteis
intermedirios da digesto anaerbia
Validation of a liquid chromatography methodology for the analysis of seven
volatile fatty acids intermediates of anaerobic digestion

Patrcia da Luz Mesquita

Doutoranda em Engenharia Metalrgica, de Materiais e de Minas pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)
Mestre em Engenharia Ambiental pela Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP) Ouro Preto (MG), Brasil.
Professora do Departamento de Engenharia Qumica e Estatstica da Universidade Federal de So Joo Del-Rei, Campus Alto Paraopeba
Ouro Branco (MG), Brasil.

Robson Jos de Cssia Franco Afonso

Ph.D. em Qumica (Royal Holloway College).
Professor Adjunto do Departamento de Qumica da UFOP, Campus Morro do Cruzeiro Ouro Preto (MG), Brasil.

Srgio Francisco de Aquino

Ph.D. em Engenharia Qumica (Imperial College London). Professor Adjunto do Departamento de Qumica da UFOP, Campus Morro do Cruzeiro Ouro Preto (MG), Brasil.

Gustavo de Sousa Leite

Graduado em Qumica Industrial e Mestre em Engenharia Ambiental pela UFOP, Campus Morro do Cruzeiro Ouro Preto (MG), Brasil.

Resumo
cidos graxos volteis (AGV) so importantes compostos intermedirios indicadores da digesto anaerbia. Este artigo apresenta dados de validao de uma
metodologia para anlise de uma mistura de sete AGV (C1 a C5) em amostras ambientais por cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE). Foi utilizada
uma coluna de excluso inica a 55C, volume de injeo de 10 L e fase mvel (0,01 mol.L-1 H2SO4) a 0,6 mL.min-1. Os critrios de validao foram: limites
de deteco e de quantificao, que ficaram na faixa de 5,0 a 10 mg.L-1 e 15 a 30 mg.L-1, respectivamente; linearidade (comprovada para todos os cidos);
repetitividade e sensibilidade (muito boa para a maioria dos cidos); efeito de matriz (efeito de supresso observado para o cido isobutrico) e exatido (85 a
104%). Sendo assim, as condies operacionais adotadas se mostraram vlidas para a quantificao de AGV em efluentes de reatores anaerbios.

Palavras-chave: cidos graxos volteis; cromatografia lquida de alta eficincia; validao de mtodo de anlise.

Abstract
Volatile fatty acids (VFA) are important intermediate compounds that somehow indicate the efficiency of anaerobic systems. This paper presents results of
method validation for seven VFA (C1 to C5) analysis in environmental samples by high performance liquid chromatography (HPLC). It was used an ion exclusion
column kept at 55C; injection volume of 10 L and mobile phase (0.01 mol.L-1 H2SO4) at 0.6 mL.min-1. The validation criteria adopted were: limits of detection
and quantification, that fell in the ranges of 5.0 10 mg.L-1 and 1530 mg.L-1, respectively; linearity (verified for all acids); repeatability and sensibility (very good
for most acids); matrix effect (suppression effect observed for isobutyric acid) and accuracy (from 85 to 104%). Therefore, the operational conditions adopted
seemed to be adequate and valid to measure VFA in samples from anaerobic reactors.

Keywords: volatile fatty acids; high performance liquid chromatography; analysis method validation.

Endereo para correspondncia: Patrcia da Luz Mesquita Universidade Federal de So Joo Del-Rei Campus Alto Paraopeba Rodovia MG-443, km 7 Fazenda
do Cadete 36420-000 Ouro Branco (MG), Brasil E-mail: patriciamesquita@ufsj.edu.br
Recebido: 08/11/11 Aceito: 23/07/13 Reg. ABES: 121

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 Mesquita, P.L. et al.
Introduo
Os cidos graxos volteis (AGV) so cidos orgnicos de cadeia
curta, de baixo peso molecular, de elevado carter hidroflico, e que
apresentam valores de pKa que variam de 3,75 a 4,87. Os AGV que
contm de 1 a 5 carbonos so comumente denominados cidos fr-
mico (C1), actico (C2), propinico (C3), butrico (C4), isobutrico
(C4), valrico (C5) e isovalrico (C5), e apresentam-se predominan-
temente dissociados em meios cujos valores de pH sejam maiores que
os respectivos valores de pKa. Em funo disso, comum na literatu-
ra da engenharia sanitria e ambiental se referir a tais compostos pelo
nome do sal correspondente (ex.: acetato, propionato).
Os AGV so os principais intermedirios da digesto anaerbia
de compostos orgnicos presentes em resduos e efluentes. Como em
condies anaerbias os microrganismos no dispem de um acep-
tor final de eltrons (tal qual o oxignio nos processos aerbios), o
substrato orgnico ao mesmo tempo utilizado como aceptor e doa-
dor de eltrons, ou seja, uma parte do composto orgnico poluente
oxidada enquanto outra parte reduzida, no processo conhecido
como fermentao. Segundo Rittmann e McCarty (2001), durante a
fermentao de matria orgnica por culturas mistas encontradas no
tratamento de esgotos e resduos, a formao de AGV preferencial
do etanol porque os microrganismos dominantes so geralmente
aqueles que encontraram as melhores rotas para obteno de energia
disponvel nas condies impostas.
Em um reator estvel, operado sob condies timas de cresci-
mento microbiano e na ausncia de fatores de estresse, as etapas aci-
dognica, acetognica e metanognica ocorrero em passos similares,
de forma a haver uma equalizao nas taxas de produo e consu-
mo dos AGV. Contudo, mudanas de condies ambientais (tempe-
ratura, ausncia temporria de nutrientes, presena temporria de
compostos txicos) e operacionais (choques de carga orgnica ou
hidrulica) podem resultar no acmulo de AGV devido a limitaes
cinticas ou termodinmicas (Aquino & Chernicharo, 2005).
Dessa forma importante monitorar a concentrao de AGV nos rea-
tores anaerbios como forma de prevenir problemas operacionais e/ou
subsidiar aes corretivas em sistemas desbalanceados. Alm disso,
a especiao dos AGV, ou seja, a determinao da concentrao in-
dividual de cada cido importante para diagnosticar o grupo de
microrganismos mais afetado pelas condies adversas.
Entre os AGV potencialmente formados em reatores anaer-
bios, os cidos frmico, actico e propinico merecem destaque.
O cido actico o mais importante AGV uma vez que precursor dire-
to dos microrganismos metanognicos acetoclsticos, que contribuem
com cerca de 70% do metano produzido biologicamente (Aquino
& Chernicharo, 2005). O cido propinico outro intermedirio
comum do metabolismo de acares, protenas, cidos orgnicos de
cadeia longa e compostos orgnicos mais complexos, podendo respon-
der por at 20% do fluxo de eltrons canalizado para a produo de
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metano (Speece, 1996). Baixas concentraes de propionato so in-
dicativas de um bom funcionamento do processo anaerbio, ao passo
que o acmulo de tal intermedirio normalmente reflete um desequi-
lbrio entre as etapas metablicas que governam a digesto anaerbia.
Por sua vez, o cido frmico o mais simples dos AGV e tem sido
relatado como importante intermedirio formado na degradao de
compostos orgnicos complexos ou sob condies de estresse (Zaher
et al., 2006; Voolapali & Stuckey, 2001). Alm disso, a meta-
nognese mais rpida a partir de formiato do que acetato, e inde-
pende da concentrao de gs hidrognio dissolvido no meio, sendo
por isso a rota preferida por microrganismos metanognicos capazes
de efetivarem a reduo do formiato. Segundo Speece (1996), o cido
frmico de difcil deteco por cromatografia gasosa com deteco
por ionizao de chama (CG-DIC), o que resultou, por muitos anos,
em escassez de informao sobre a concentrao de tal composto em
sistemas anaerbios.
Outro aspecto importante relacionado presena de AGV em
efluentes anaerbios e anxicos que eles contribuem diretamente para
a demanda qumica de oxignio (DQO), de forma que o aumento da
eficincia da digesto anaerbia passa pela degradao e reduo
da concentrao de tais metablitos. Sendo assim, o monitoramen-
to da concentrao individualizada dos AGV em sistemas anaerbios
importante para avaliar se a DQO residual causada pelo acmulo
de tais compostos (Mesquita et al., 2010; Corra, 2009), o que re-
fletiria uma condio de estresse; devido recalcitrncia de compostos
presentes no afluente ou a produtos microbianos (PMS) gerados durante
o tratamento. Segundo balos et al. (2000), a presena de AGV em siste-
mas de tratamento de efluentes contribui ainda para a gerao de odor
desagradvel, juntamente com aminas e substncias sulfurosas. Alm
disso, a remoo biolgica de fsforo e nitrognio em sistemas de lodos
ativados tambm pode envolver a participao dos AGV, o que justifica
o crescente interesse na determinao correta de tais compostos inter-
medirios (Randall et al., 1997; Eilersen et al., 1995).
Diversos procedimentos j foram desenvolvidos para a anlise
de AGV, tais como os mtodos potenciomtricos e condutimtricos
que permitem a quantificao total de AGV (Ribas et al., 2007), e
mtodos cromatogrficos (de fase gasosa ou lquida) que permitem
a especiao dos AGV presentes. H ainda metodologias de anlise
de AGV por eletroforese capilar com deteco UV-Vis; fluorescncia
induzida por laser (Zuriguel et al., 1997); anlise de injeo em
fluxo (AIF) (Ribas et al., 2007), que so tcnicas menos usadas que
quelas previamente mencionadas.
No caso de emprego de cromatografia de fase gasosa, a amostra
deve ser inicialmente preparada para extrair os AGV do meio aquo-
so. Os procedimentos usados para tal finalidade incluem extrao
lquido-lquido em meio previamente acidificado (Moraes et al.,
2001; Manni & Caron, 1995); destilao (Moraes et al., 2001);
purga e aprisionamento (Clark & Bunch, 1997) e microextrao
em fase slida (balos et al., 2000). O uso de cromatografia de fase

gasosa tem como principal inconveniente a necessidade de extrao
dos AGV da amostra aquosa, o que, alm de aumentar o tempo de
anlise, usualmente requer o uso de solventes orgnicos controlados
(ex.: ter metil ter butlico EMTB) ou clorados (ex:. diclorometano).
Alm disso, como os solventes no clorados (ex.: ter metlico) do boa
resposta nos detectores de ionizao de chama, h a possibilidade dos
cidosde menor cadeia (ex.: frmico) serem coeludos da coluna no
tempo dereteno do solvente, conforme relatado por Speece (1996).
O uso de cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) per-
mite a anlise direta (aps simples filtrao) das amostras com ex-
celente resoluo dos principais AGV em equipamentos providos
de detectores de uso comum (ex.: UV-Vis). Nesse caso, podem ser
utilizadas colunas de troca inica (Ribas et al., 2007) ou de fase re-
versa (Cerqueira et al., 2011), com detectores de condutividade
(Moraes et al., 2001) ou, mais comumente, com espectrometria de
absoro na regio do ultravioleta (Santos et al., 2010; Ribas et al.,
2007; Aquino & Stuckey, 2004).
Independente da metodologia de anlise empregada, impor-
tante que ela seja devidamente validada, uma vez que a validao
garante qualidade metrolgica dos ensaios e confiabilidade tcnica
dos resultados obtidos. A reviso da literatura mostra que poucos
trabalhos relatam a utilizao de mtodos validados para o monito-
ramento de reatores biolgicos, o que muitas vezes coloca sob sus-
peita os resultados e as discusses apresentadas. Tendo em vista a
importncia do monitoramento individualizado dos cidos orgnicos
intermedirios da digesto anaerbia, o objetivo deste trabalho foi o
desenvolvimento de uma metodologia que emprega a utilizao de
cromatografia lquida de alta eficincia com deteco por absoro no concentraes, partindo do limite de quantificao. As concentraes fo-
UV-Vis usando arranjo de diodos (CLAE-DAD) para anlise dos sete
principais AGV em efluentes anaerbios.
Metodologia
A mistura de cidos graxos volteis (AGV) foi preparada a partir
dos cidos frmico, actico, propinico, isobutrico, butrico, isoval- curva analtica (Lanas, 2004). Foi feita anlise de regresso por m-
rico e valrico, todos adquiridos da Sigma-Aldrich, com grau de pu-
reza que variou de 99,5 a 99,9%. As anlises foram realizadas em sis-
tema de cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) da Shimadzu,
usando uma coluna de troca inica Aminex HPX-87H (Bio-Rad,
300,0x7,8 mm), a 55C. A fase mvel empregada foi soluo de cido
sulfrico (Sigma-Aldrich) 0,01 mol.L , no modo isocrtico com uma
-1
vazo de 0,6 mL.min-1, empregando-se volume de injeo de 10L.
Os AGV foram analisados no comprimento de onda de 210nm com
detector UV-Vis com arranjo de diodos (DAD Shimadzu SPD-
M20A) em um tempo total de anlise de 35 min. Todos os reagentes
usados foram de grau PA, sendo suas solues preparadas com gua
deionizada ultrapura (Tipo I).
Para a identificao dos analitos no cromatograma, uma anlise in-
dividual foi feita, com base nos tempos de reteno de cada um. Para se
Validao de metodologia de anlise de AGV por CLAE
avaliar o efeito de matriz, amostras de efluente de reator anaerbio de
bancada (Mesquita et al., 2010) foram usadas, as quais foram previa-
mente centrifugadas (3.500 rpm, 10 min, Centrfuga Excelsa II, 206-BL,
Fanem) com posterior filtrao em membrana (acetato de celulose, po-
rosidade de 0,45 m, Millipore) para remoo de slidos suspensos. O
procedimento de preparo da amostra no resultou na alterao de pH da
amostra. Para todas as anlises descritas neste artigo, as amostras foram
apenas filtradas para a remoo de slidos suspensos, ou seja, o mtodo
proposto no requer nenhuma etapa de extrao ou concentrao dos
AGV da amostra.
A validao da metodologia de anlise dos AGV foi realizada por
meio dos seguintes critrios, conforme preceitos da Resoluo ANVISA
RE n 899, de 29 de maio de 2003 e documento INMETRO DOQ-
CGCRE-008, de 2006: limite de deteco, limite de quantificao,
faixa de trabalho, linearidade, preciso (repetitividade), sensibilidade,
seletividade e exatido, usando solues em vrias concentraes.
Para a determinao dos limites de deteco (LD) e de quantificao
(LQ), uma soluo-padro estoque da mistura de cidos com concentra-
o de 400 mg.L-1 foi preparada, a partir dos cidos puros, e as demais
concentraes foram obtidas por diluio. Foram injetadas amostras-
-padro preparadas em diferentes concentraes. Os relatrios gerados
foram programados para especificarem a relao sinal/rudo da anlise.
Com base nesses resultados, padres de concentraes mais diludas fo-
ram sendo preparados at ser atingido o valor sinal/rudo aproximado
de 3 para LD e 10 para LQ (Hartmann et al., 1998; Lanas, 2004).
Para a determinao do intervalo dinmico (ou faixa dinmica),
solues-padro da mistura de cidos foram preparadas em diferentes
ram 12,5; 25,0 ; 50,0 ; 100,0 ; 200,0 ; 400,0 ; 700,0 ; 1.000,0; 1.500,0
e 2.000,0 mg.L-1. Os dados para a determinao da linearidade foram
obtidos a partir das mesmas amostras injetadas para determinar a preci-
so, em sete replicatas por concentrao. As concentraes escolhidas fo-
ram 12,5; 25,0; 50,0; 100,0; 200,0 e 400,0 mg.L-1 da mistura de cidos,
atendendo assim a demanda mnima recomendada de 5 pontos para a
nimos quadrados e a correlao foi obtida por meio do coeficiente de
determinao R2.
A avaliao da preciso do mtodo foi feita neste trabalho com
base na repetitividade. Sete replicatas de soluo padro de 200 mg.L-1
(concentrao intermediria da curva analtica) foram preparadas pelo
mesmo analista, e foram analisadas em sequncia e sob as mesmas con-
dies operacionais. As mdias e os desvios-padro foram obtidos com
vistas a se determinar a preciso a partir do coeficiente de variao
(CV), conforme a Equao 1:
CV=DP/CMPx100 (1)
em que:
DP=desvio padro
CMD=concentrao mdia determinada
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A sensibilidade de um mtodo indica sua capacidade de discri- padro nas concentraes de 25, 50, 100, 200, 500 e 1.000 mg.l-1, e
minar, com uma fidelidade estabelecida, concentraes prximas de a anlise em triplicata. por meio da extrapolao da curva, a interces-
um analito. A sensibilidade pode ser determinada por intermdio da so com o eixo x proveu a informao, anteriormente desconhecida,
inclinao da curva analtica, uma vez que quanto maior a absor- da concentrao de cada cido presente na matriz original (riBAni
tividade da substncia, maior o coeficiente angular e mais sensvel et al., 2004). esse valor foi ento deduzido da concentrao total,
o mtodo. para cada curva analtica construda para a avaliao proveniente de uma curva analtica dos padres isentos da matriz
da linearidade, foi avaliado o coeficiente angular obtido a partir da (calibrao externa), usando as respostas da matriz fortificada, sendo
anlise regresso linear, o que permite comparar a sensibilidade do a diferena utilizada como valor obtido. Segundo lanas (2004), a
mtodo para cada AGV. exatido pode ser determinada pela expresso dada na equao 2.
Segundo lanas (2004), a seletividade corresponde capacidade os clculos de todos os parmetros de validao foram feitos nos
de um mtodo em determinar o analito de maneira inequvoca na pre- programas Microsoft excel 2010 e croma Validate.
sena de outras substncias susceptveis de interferirem na determina-
o. no presente estudo, a seletividade foi avaliada pelos tempos de Exatido = [1-(Vr-Vd)/Vr]x100 (2)
reteno dos analitos nos cromatogramas obtidos com gua destilada
e efluente anaerbio fortificado e pelo uso do sistema de deteco uV- em que:
Vis com arranjo de diodos, que permite a obteno de um espectro de Vr=valor real, aquele tido como verdadeiro
absoro em toda a regio do uV-Vis para cada pico eludo. Vd=valor desejado, ou obtido pela curva analtica
A adio padro foi o mtodo adotado neste estudo para avaliar a
exatido, pois ele se aplica quando for difcil ou impossvel preparar Resultados e Discusso
um branco da matriz sem a substncia de interesse (riBAni et al.,
2004), o que o caso. para o clculo da exatido, duas informaes na Figura 1, apresentado um cromatograma obtido com o m-
so necessrias: o valor real (aquele tido como verdadeiro; neste caso, todo desenvolvido, em duas diferentes matrizes, gua deionizada e
corresponde concentrao do padro preparado para a fortificao efluente de reator anaerbio, que receberam soluo padro de AGV
da matriz) e o valor obtido (que aquela concentrao obtida pela de forma que a concentrao final de cada cido fosse 400 mg.l-1.
curva analtica a partir da resposta de intensidade do pico). contudo, percebe-se que praticamente no houve deslocamento do tempo de
aps a obteno das respostas, foi necessrio determinar a concentra- reteno dos analitos em matriz complexa (efluente anaerbio). Da
o de cada cido na matriz original, uma vez que esta no era isenta mesma forma, a resoluo dos picos parece no ter sido afetada pe-
dos analitos. para tanto, foi feita uma curva analtica com adio de los componentes da matriz (efluente anaerbio). A comparao dos

mAU
3,00
cido frmico
13,5 min

2,75

2,50
cido isobutrico
19,5 min

2,25
cido propinico
cido atico
14,5 min

2,00
cido isovalrico
cido butrico
17,2 min

21,2 min

1,75
24,6 min

cido valrico
30,2 min

1,50

1,25
1,00

0,75
gua deionizada
0,50
0,25
amostra de efluente
0,00

-0,25

-0,50
12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0 37,5 min

Figura 1 Cromatograma tpico de amostras de efluente anaerbio e gua deionizada (ultrapura) fortificados com padro de cidos graxos
volteis (400 mg.L-1).

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 Validao de metodologia de anlise de AGV por CLAE

tempos de reteno dos analitos e os espectros obtidos no sistema
UV-Vis com arranjo de diodos, permitem afirmar que o mtodo foi
seletivo para todos os sete AGV analisados.
Na Tabela 1, apresentam-se os tempos de reteno para cada
cido da mistura de AGV obtidos nos cromatogramas mostrados
na Figura 1.
Limites de Deteco e Quantificao
O limite de deteco a menor concentrao de um analito
que pode ser, com segurana, diferenciado do rudo instrumental
(Lanas, 2004). A literatura relata que um procedimento co-
mum aceitar como LD a concentrao do analito que produz
um sinal trs vezes maior que o rudo do sistema (Hartmann
et al., 1998). J o limite de quantificao corresponde menor
quantidade de um analito que pode ser quantificada com exati-
do. Valores aproximadamente dez vezes maiores que o desvio-
-padro do sinal gerado empregando-se um branco so aceitos
como LQ, ou seja, aproximadamente trs vezes o LD (Lanas,
2004). A Tabela 2 apresenta os resultados obtidos das relaes
sinal/rudo para cada analito estudado.
Tabela 1 Tempos de reteno aproximados para cada cido graxo
voltil presente na mistura nas amostras de efluente anaerbio e
do branco.
Tempo de reteno (min)
Analito
Branco Efluente anaerbio
Para a soluo de concentrao 5,0 mg.L-1, as relaes sinal/rudo
dos cidos isovalrico e valrico so inferiores a 3,0. Para o ci-
do butrico, essa relao ficou prxima a 3,0, e para os demais,
acima de 3,0, logo essa concentrao foi considerada o LD para
esses analitos. Como a relao sinal/rudo na soluo de concen-
trao 6,25 mg.L -1 para o cido isovalrico foi 2,9, valor pr-
ximo de 3,0, considera-se esse sendo seu LD. O cido valrico
s apresentou valor de sinal/rudo satisfatrio na concentrao
igual a 10 mg.L-1, logo esse foi o valor tomado como LD para
esse analito. A Tabela 3 sistematiza os valores de LD e LQ paraos
analitos deste estudo.
Cerqueira et al. (2011) obteve valores de LD menores do que os
aqui obtidos para os cidos actico e propinico, e igual para o ci-
do butrico, o que indica que o mtodo desenvolvido por eles seria
mais adequado para anlise desses dois analitos, quando em con-
centraes da ordem de 10 mg.L-1. Para amostras que contenham
concentraes superiores, ambas as metodologias so equiparveis.
Linearidade
A linearidade a resposta obtida em funo da concentrao do
analito, a qual deve ser estudada na faixa de trabalho. A linearidade
funo da natureza qumica do analito e do tipo de detector uti-
lizado. A Tabela 4 mostra os coeficientes de correlao linear dos
analitos estudados, os quais foram sempre maiores que 0,99 com-
provando a linearidade do mtodo na faixa de 25 a 1.000 mg.L-1.

cido frmico 13,5 13,5

Tabela 3 Valores de limite de deteco e limite de quantificao obtidos
para cada cido graxo voltil.
cido actico 14,5 14,5
Limite de Limite de
Analito
cido propinico 17,2 17,2 deteco (mg.L-1) quantificao (mg.L-1)

cido isobutrico 19,5 19,5 cido frmico 5,0 15,0

cido Butrico 21,2 21,2 cido actico 5,0 15,0

cido propinico 5,0 15,0
cido isovalrico 24,6 24,6
cido isobutrico 5,0 15,0
cido valrico 30,2 30,2
cido butrico 5,0 15,0
cido isovalrico 6,25 18,75
Tabela 2 Relao sinal/rudo obtida para cada analito na mistura de cido valrico 10,0 30,0
cidos graxos volteis.
Relao sinal/rudo
Analito Tabela 4 Coeficientes de correlao linear obtidos para cada cido
Padro Padro Padro
5,0 mg.L-1 6,25 mg.L-1 10 mg.L-1 graxo voltil e usado no teste de linearidade (faixa de trabalho).
cido frmico 4,0 10,0 16,1 Analito Coeficiente de correlao linear (R2)

cido actico 3,7 5,5 8,3 cido frmico 0,9986

cido propinico 3,5 4,6 6,2 cido actico 0,9974

cido isobutrico 3,1 6,1 7,8 cido propinico 0,9967

cido butrico 2,8 3,2 5,5 cido isobutrico 0,9958

cido butrico 0,9952
cido isovalrico 2,5 2,9 4,7
cido isovalrico 0,9934
cido valrico N/D N/D 3,1
cido valrico 0,9962
N/D: No detectado.

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Os dados apresentados em Cerqueira et al. (2011) mostram
coeficientes de correlao linear para os cidos actico, propini-
co e butrico ligeiramente superiores aos aqui relatados (iguais a
0,999 para o actico e propinico e 0,996 para o butrico), dife-
rena que no representa qualquer relevncia, ao se comparar os
dois mtodos.
Preciso (repetitividade)
A repetitividade expressa a fidelidade obtida nas mesmas con-
dies operacionais, aplicadas em um curto intervalo de tempo
(Lanas, 2004). Os valores de coeficiente de variao (CV) para as
reas dos picos cromatogrficos obtidos para a mistura de AGV numa
concentrao de 200 mg.L-1 esto expressos na Tabela 5. Valores de
CV de at 20% so aceitveis (INMETRO, 2006); portanto, pode-se
afirmar que o mtodo preciso para todos os AGV, uma vez que o
maior coeficiente de variao obtido no ensaio foi de 1,64% para oci-
do isovalrico.
O trabalho de Cerqueira et al. (2011) avalia a repetitivida-
de em um mtodo para anlise de trs AGV (cidos actico, pro-
pinico e butrico), usando uma coluna de fase reversa (Waters
Spherisorb ODS2, 150x4,6 mm, 5 m). Seus resultados demons-
tram que o coeficiente de variao para o cido propinico ficou
acima de 17%. O mtodo aqui apresentado, portanto, demonstra
melhor repetitividade.
Efeito de matriz
O efeito de matriz atesta se os componentes da amostra in-
terferem na determinao dos analitos de interesse. O mtodo da
adio padro foi o escolhido para avaliao do efeito de matriz,
uma vez que praticamente impossvel obter um efluente anae-
rbio isento dos cidos orgnicos. Para tanto, comparou-se os
coeficientes angulares das curvas de calibrao construdas na
ausncia de matriz com aquelas obtidas com amostras de efluen-
te anaerbio fortificadas com AGV, sendo o critrio adotado
como uma diferena menor ou igual a 5% (Lanas, 2004).
A Tabela 6 apresenta a diferena percentual entre os coeficientes
angulares para as amostras com e sem fortificao de AGV.
Os resultados obtidos mostram que, exceo do cido isobu-
trico em que o efeito de matriz pareceu mais pronunciado, o m-
todo utilizado foi pouco susceptvel interferncia causada pelos
componentes da amostra (efluente anaerbio). Os dados mostram
ainda que a matriz interferiu pouco na resposta do cido pro-
pinico, no qual se observou variao percentual de coeficiente
angular de apenas 1,6%.

Tabela 5 reas dos picos cromatogrficos obtidos para cada analito (200 mg.L-1) presentes na mistura de cidos graxos volteis e clculo dos
parmetros de repetitividade (desvio padro, coeficiente de variao) do mtodo.
Frmico Actico Propinico Isobutrico Butrico Isovalrico Valrico
617,16 378,12 354,19 452,32 329,18 341,08 302,07
618,82 378,76 351,56 451,13 329,56 343,06 295,57
613,37 375,59 350,74 452,72 329,27 337,11 298,21
625,80 385,51 355,81 456,45 331,33 352,65 299,77
616,94 374,00 349,25 453,76 331,00 343,26 297,11
627,55 389,95 358,84 461,63 339,23 351,47 305,69
626,00 379,56 354,52 455,96 331,36 347,98 294,32
DP 5,55 5,62 3,29 3,55 3,51 5,68 3,93
Mdia 620,81 380,21 353,56 454,85 331,56 345,23 298,96
CV (%) 0,89 1,48 0,93 0,78 1,06 1,64 1,31
DP: desvio padro; CV: coeficiente de variao.

Tabela 6 Coeficientes angulares das curvas analticas e diferenas percentuais, com e sem efeito de matriz, para teste de seletividade.
Analito Na matriz* Em gua destilada Diferena absoluta Diferena percentual (%)
cido frmico 0,8643 0,8868 -0,0225 -2,5
cido actico 0,5598 0,5761 -0,0163 -2,8
cido propinico 0,5397 0,5482 -0,0085 -1,6
cido isobutrico 0,6849 0,7934 -0,1085 -13,7
cido butrico 0,5377 0,5607 -0,023 -4,1
cido isovalrico 0,5388 0,5139 0,0249 4,8
cido valrico 0,4713 0,4812 -0,0099 -2,1
*Efluente anaerbio.

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 Validao de metodologia de anlise de AGV por CLAE

Esses resultados se equiparam com os obtidos por Cerqueira
et al. (2011), onde demonstrado que o efeito de matriz para os
cidos actico, propinico e butrico foram de, respectivamente,
1,4, -3,9 e -4,1%. Todos esses resultados so bem abaixo de 5%,
valor considerado de baixo efeito de matriz (Economou et al.,
2009 apud Cerqueira et al., 2011).
O mtodo utilizado se mostrou exato para todos os cidos, uma
vez que os valores de porcentagem mdia ficaram compreendidos
entre 85 e 104%, valores semelhantes aos reportados por Cerqueira
et al. (2011), os quais foram de 89 a 102%. Segundo Lanas (2004),
a faixa mdia aceitvel para avaliao de exatido por ensaios de
recuperao de 70 a 120%.

Exatido Sensibilidade

A exatido expressa a concordncia entre o valor encontrado e o
valor aceito como referncia. A anlise de exatido pode ser realiza-
da por meio de ensaios de recuperao, sendo essa realizada em pelo
menos trs diferentes concentraes, por exemplo, prximo ao limite
de deteco, prximo concentrao mxima permissvel e em uma
concentrao prxima mdia da faixa de uso do mtodo. Outro m-
todo o da adio padro (Ribani et al., 2004), adotado neste estudo.
O mtodo de adio padro foi adotado em funo de ser im-
possvel preparar um branco da matriz (efluente anaerbio) sem os
analitos de interesse. Para este ensaio, padres de 200 mg.L-1 de cada
cido foram adicionados ao efluente anaerbio e as concentraes
reais foram calculadas a partir da curva de calibrao. Na Tabela 7,
so apresentados os dados de exatido calculados.
Tabela 7 Exatido do mtodo para cada analito presente na mistura de
cidos graxos volteis.
Analito Exatido (%)
cido frmico 95,19
A sensibilidade de um mtodo indica sua capacidade de dis-
criminar, com uma fidelidade estabelecida, concentraes pr-
ximas de um analito. A sensibilidade pode ser determinada por
intermdio da inclinao da curva analtica, uma vez que quanto
maior a absortividade da substncia, maior o coeficiente angular,
mais sensvel o mtodo. Para cada curva analtica construda
para a avaliao da linearidade, foi avaliado o coeficiente angular
obtido a partir da anlise regresso linear, o que permite com-
parar a sensibilidade do mtodo para cada AGV. A Tabela 8 sis-
tematiza a informao dos coeficientes angulares obtidos com a
regresso linear.
Observa-se que o mtodo empregado mais sensvel para o
cido frmico (3,03) e bem menos sensvel para o cido valri-
co (1,49). De fato, esta observao confirma os diferentes com-
portamentos dos analitos na determinao dos LD e LQ, quando
foi verificado que o cido valrico era o composto determinante,
expressando a pior condio. Como o cido valrico menos sen-
svel ao mtodo de anlise, a sua deteco e quantificao desfa-
vorecida comparativamente aos demais AGV da mistura.

cido actico 93,04

cido propinico 95,21 Concluses

cido isobutrico 85,39 O mtodo de cromatografia lquida de alta eficincia proposto
cido butrico 94,27 para anlise de sete AGV (cidos frmico, actico, propinico, bu-
cido isovalrico 104,24 trico, isobutrico, valrico e isovalrico) em amostras de efluentes
anaerbios foi devidamente validado segundo os critrios de limite
cido valrico 97,10
de deteco, limite de quantificao, faixa de trabalho, linearidade,
preciso (repetitividade), sensibilidade, seletividade e exatido.
Tabela 8 Valores dos coeficientes angulares obtidos a partir das curvas
O LD calculado ficou entre 5,0 e 10,0 mg.L-1, e o LQ entre 15,0
analticas e usadas na avaliao da sensibilidade do mtodo.
e 30,0 mg.L-1. A linearidade neste intervalo foi demonstrada, na faixa
Analito Coeficiente angular de 25,00 a 1000,0 mg.L-1. O mtodo apresentou boa repetitividade
cido valrico 1,49 uma vez que a pior condio, obtida para o cido isovalrico, resul-
tou em coeficiente de variao de 1,64%. Alm disso, o mtodo apre-
cido butrico 1,72
sentou boa seletividade para os sete AGV testados, exceo do cido
cido propinico 1,76
isobutrico, para qual o efeito de matriz pareceu mais pronunciado. O
cido isovalrico 1,77 efeito de matriz pareceu ser menos interferente para o cido propi-
cido actico 1,89 nico. A exatido do mtodo tambm foi comprovada e variou de 85 a

cido isobutrico 2,30

104%. Sendo assim, as condies operacionais adotadas para as an-
lises cromatogrficas se mostraram adequadas e vlidas para a deter-
cido frmico 3,03
minao quantitativa de AGV em amostras de efluentes anaerbios.

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