REVISIN
BIOLOGA MOLECULAR EN MICOLOGA MDICA
M. en C. Enrique Salas Tllez, Dr. Roberto Arenas.
Biologa Molecular en Micologa Mdica. Derm.
Venez, 2001, 39: 07-10
RESUMEN
Se hace una breve revisin de las tcnicas usadas en
biologa molecular para el estudio de los hongos en
micologa mdica.
Las tcnicas genticas utilizadas en la identificacin de
especies y gneros de hongos, incluyen el Polimorfismo
en la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP,
Restriction Fragment Length Polymorphism) del
ADNmt, la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR,
Polymerase Chain Reaction), el anlisis del
polimorfismo en la longitud de los fragmentos de
restriccin de regiones amplificadas por PCR (PCR-
RFLP), el anlisis del polimorfismo en la conformacin
de las cadenas sencillas de ADN amplificado por PCR
(PCR-SSCP), o el anlisis de polimorfismo del ADN
amplificado con cebadores arbitrarios (RAPD, Random
Amplified Polymorphic DNA). En combinacin con otros
mtodos como la electroforesis en geles de agarosa y
la transferencia a membranas de ADN (Southern Blot) o
la de ARN (Northern Blot).
Palabras clave: Biologa Molecular, Hongos, Micologa
Mdica
INTRODUCCIN
Por muchas dcadas la Micologa Mdica fue rea de
limitada investigacin, debido en parte a que slo
ocasionalmente hongos patgenos producen
enfermedades serias y de amplia distribucin en
comparacin por ejemplo con bacterias, parsitos o virus.
As como, el gran polimorfismo entre especies fngicas y
adems que el manejo de patge-
* Acadmico Acadmico Facultad de Estudios Superiores Cuautitln,
U.N.A.M. Ctedra de Inmunodiagnstico de Enfermedades Micticas
y Bacterianas.
** Jefe de la Seccin de Micologa. Departamento de Dermatologa.
Hospital General Dr. Manuel Gea Gonzlez.
Direccin: Av. 1 de Mayo s/n, Campo 1 Colonia Atlanta, Cuautitln
Izcalli C.P. 54720.
DERMATOLOGIA VENEZOLANA, VOL. 39 N 1, 2001
M. en C. Enrique Salas Tllez,*
Dr. Roberto Arenas**
Molecular Biology in Medical Mycology.
ABSTRACT
We present a brief review of the molecular techniques
used in medical mycology. The genetic techniques used
for the identification of genera and species of fungi in-
elude: the (RFLP) Restriction Fragment Length
Polymorphism of the DNAmt, the (PCR), Polymerase
Chain Reaction), The PCR-RFLP, PCR-SSCP, the
(RAPD) Random Amplified Polymorphic DNA. Also in
combination with other methods such as electrophoresis
in agarose gel and the Southern and Northern Blot
Techniques.
Key words: Fungi, Medical Mycology, Molecular
Biology.
nos humanos en cultivos era frecuentemente peligroso y
se careca de las condiciones ptimas de aislamiento. Es
as, que los avances tecnolgicos en micologa mdica se
han relacionado con la ultramicroscopia, as como con
instrumentos que permitan precisar las caractersticas
inmunolgicas y bioqumicas de los hongos.2.8
En la actualidad muchos de los inconvenientes antes
mencionados ya han sido superados, quedando en claro
que las infecciones sistmicas fungales son comunes y
no raras, y que su estudio es una necesidad imperiosa .12
El rpido incremento de las tcnicas moleculares ha
tenido influencia en el estudio de problemas de micologa
mdica. Los anlisis genticos han sido de gran
provecho, y su aplicacin en microorganismos patgenos
permite nue-
7
vas ideas sobre el conocimiento biolgico de los
mismos. Sin embargo, la importancia de la aplicacin de
estas tcnicas ha trascendido a otros campos del
conocimiento de la Micologa Mdica.
Como la mayora de los hongos patgenos son
Deuteromycetes y presentan caractersticas
ambientales cambiantes, el uso de tcnicas moleculares
permite estudiar caractersticas estables y no
modificables por el ambiente, como ADN del gen y el
ARN molecular. La mejor caracterstica para discriminar
individuos, cepas, especies, gneros y familias deber
ser en el futuro cercano, la secuencia de nucletidos de
molculas de ADN que llevan la informacin gentica, e
indican la distancia gentica entre las mismas. Sin
embargo, aunque estas tcnicas se han desarrollado en
un tiempo relativamente corto y en ocasiones son
fundamentales en el diagnstico, es dudoso que puedan
suplir por completo los mtodos morfolgicos tradiciona-
les. 4,8,13
Las tcnicas genticas utilizadas en la identificacin
de especies y gneros de Hongos, incluyen el
Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de
restriccin (RFLP, Restriction Fragment Length
Polymorphism) del ADNmt, la Reaccin en Cadena de
la Polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction), el
anlisis del polimorfismo en la longitud de los
fragmentos de restriccin de regiones amplificadas por
PCR (PCR-RFLP), el anlisis del polimorfismo en la
conformacin de las cadenas sencillas de ADN
amplificado por PCR (PCR-SSCP), o el anlisis de
polimorfismo del ADN amplificado con cebadores
arbitrarios (RAPD, Random Amplified Polymorphic
DNA). En combinacin con otros mtodos como la
electroforesis en geles de agarosa y la transferencia a
membranas de ADN (Southern Blot) o la de ARN
(Northern Blot), se ha llegado a desarrollar herramientas
de gran utilidad tanto para estudios genticos,
filogenticos, epidemiolgicos y diagnsticos de los
hongos patgenos involucrados en las infecciones
micticas.
Hibridacin.- Las molculas de ADN o ARN sinttico
son muy empleadas como "sondas" en Ingeniera
gentica, para detectar, va hibridacin del cido
nucleico, las secuencias especficas de ADN o ARN. El
procedimiento general es marcar el cido nucleico
sonda, generalmente con fosfato radioactivo y dejar que
la sonda de cadena sencilla hibride con c. nucleico
monocatenario derivado del ADN clonado. Por
apareamiento especfico de bases complementarias,
dos polinucleotidos de cadena sencilla solamente se
hibridarn si son totalmente complementarias.4,10,11
Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de
restriccin (RFLP).- Esta tcnica permite diferenciar
distintos microorganismos mediante el anlisis de
patrones de bandas, derivados de la ruptura de sus
respectivos ADNs. Estos patrones, conocidos como
perfiles de restriccin del ADN,
8 DERMATOLOGIA VENEZOLANA, VOL. 39 N 1, 2001
se originan gracias a la actividad de las enzimas
endonucleasas de restriccin. Cuanto menor sea el
tamao de la secuencia nucleotdica, mayor ser el
nmero de fragmentos que se generen. Las
endonucleasas de restriccin se denominan con tres o
cuatro letras que proceden del nombre de la bacteria en
la que se han aislado (por ejemplo, la enzima Eco
procede de Escherichia coli) y adems se le aade un
nmero romano (Eco Rl, Eco Rll, Eco 47111), debido a
que se pueden encontrar varias enzimas de restriccin
diferentes, que reconocen distintas secuencias
nucleotdicas, en la misma bacteria. Los fragmentos se
pueden separar mediante electroforesis en gel de
agarosa, obtenindose perfiles de restriccin
caractersticos. Los perfiles dependern de la enzima de
restriccin empleada as como del ADN utilizado (ADNn
o ADNmt), aunque el ms empleado es el ADN mt. La
comparacin entre los perfiles permitir diferenciar
varias especies entre s o incluso poblaciones dentro de
una misma especie. 8,11,14
Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). El
gran xito obtenido a mediados de los 80 por Kary
Mullis consisti en lograr in vitro un gran nmero de
copias de fragmentos especficos de ADN, basndose
en un principio muy sencillo: la utilizacin de
mecanismos similares a los empleados or la propia
clula en la replicacin del ADN durante la ivisin
celular. La reaccin en cadena de la polimerasa onsiste
en la repeticin cclica de tres etapas:
1) Desnaturalizacin del ADN bicatenario presente en
la muestra para separar las dos cadenas, mediante
la aplicacin de temperaturas superiores a 90C.
2) Unin especfica de los cebadores (oligonucletidos
sintticos) a las cadenas sencillas mediante
complementariedad de bases. La temperatura a la
que se realiza esta unin (Ta, Annealing
temperature) es muy importante para controlar la
especificidad de la reaccin. La Ta depende de la
composicin de bases y del tamao de los
cebadores que se unen cada uno a una cadena
diferente delimitando la secuencia de nucletidos
que se pretende amplificar. La seleccin de dichos
cebadores constituye uno de los puntos ms crticos
del ensayo de PCR, y
3) Extensin de la cadena de ADN a copiar a partir de
los cebadores, utilizando los nucletidos presentes
en la solucin. Dicha extensin la lleva a cabo la
enzima ADN polimerasa, que inicia su actividad tras
reconocer la unin de los cebadores a las cadenas
de la muestra. La polimerasa empleada
inicialmente, procedente de Escherichia coli, se
desnaturalizaba cuando se someta a temperaturas
superiores a 90C durante la primera etapa de cada
ciclo y por lo tanto, habla que reponerla al inicio de
cada fase de extensin. En la actualidad, sin
embargo, se utilizan enzimas termoestables como la
Taq polimerasa, procedente del microorganismo
termfilo Thermus aquaticus. La cantidad de copias
de la secuen-
 cia de ADN delimitado por los cebadores se
incrementa exponencialmente, debido a que las
nuevas copias tambin sirven como patrones en los
subsiguientes ciclos.
La tcnica de PCR presenta sin embargo una
limitacin: es necesario conocer parte de la secuencia
que se quiere amplificar, al menos aquellas zonas en
las que se van a unir los cebadores .4,11,14
Anlisis del polimorfismo en la longitud de los
fragmentos d restriccin de regiones amplificadas
por PCR (PCRRFLP). La tcnica de PCR-RFLP consiste
en el uso combinado de la tcnica de RFLP, explicada
anteriormente y la tcnica de PCR. De esta manera, se
amplifican fragmentos de ADN especficos mediante PCR
y posteriormente se tratan con enzimas de restriccin,
que los cortan en trozos ms pequeos. Diferencias en la
secuencia nucleotdica entre las especies estudiadas,
darn lugar a fragmentos de diferentes tamaos que se
examinarn mediante electroforesis. Los perfiles de ADN
obtenidos tras la electroforesis son ms sencillos de
interpretar, puesto que hay un menor nmero de bandas
y una pequea cantidad de ADN es suficiente para llevar
a cabo el anlisis, ya que se obtiene un gran nmero de
copias tras su amplificacin por PCR. Esto reduce
significativamente la cantidad de muestra necesaria.8,11,14
Anlisis del polimorfismo en la conformacin de las
cadenas sencillas de ADN de regiones amplificadas
por PCR (PCR-SSCP). Esta tcnica se basa en la
relacin entre la movilidad electrofortica de una hebra
de ADN monocatenario (ADNmc) y su conformacin, que
en definitiva es un reflejo de su secuencia nucleotdica.
En esta tcnica el ADN bicatenario (ADNbc) se
desnaturaliza a ADNmc y posteriormente se separan dos
hebras mediante electroforesis en gel de poliacrilamida,
bajo condiciones no desnaturalizantes. Cualquier
diferencia en la secuencia del ADN dar lugar a un
cambio de movilidad de las molculas de ADNmc, que se
visualizar al final del proceso .4,11
Anlisis del polimorfismo del ADN amplificado con
cebadores arbitrarios (RAPD). La tcnica de RAPD
denominada tambin por otros autores AP-PCR
(Arbitrarily Primed PCR) o DAF (DNA Amplification
Fingerprinting) se basa en la amplificacin simultnea de
mltiples fragmentos de ADN nuclear mediante PCR,
utilizando para ello un nico cebador, normalmente de
915 bases, cuya secuencia se elige al azar. Las
temperaturas de unin (Ta) empleadas (35-39 C) son
mucho ms bajas en comparacin al PCR tradicional, lo
cual favorece la inespecificidad de la reaccin. Los
fragmentos se analizan mediante electroforesis. El
nmero y tamao de los fragmentos amplificados a partir
de un determinado ADN mediante RAPD, se mantiene
constante siempre que se utilice el mismo cebador y se
haga el estudio en las mismas condiciones. De este
modo los perfiles
DERMATOLOGIA VENEZOLANA, VOL. 39 N 1, 2001
obtenidos mediante RAPD pueden permitir la diferencia-
cin de los ADNs a nivel de especie, o incluso a nivel de
individuo .3,11,12
Las aplicaciones directas de las tcnicas de biologa
molecular se pueden observar en los siguientes
ejemplos:
a) Sondas de ADN se han desarrollado para
Histoplasma capsulatum, Coccidiodes immitis,
Cryptococcus neoformans, Blastomyces
dermatitidis,10,12 Sacharomyces, Candida albicans,
Candida krusei, Candida lusitaniae, Pneumocystis
carin, Aspergillus/Penicillium spp, Candida
glabrata/Saccharomyces cereviseae
b) La tcnica de PCR se ha desarrollado en Candida12
Pneumocystis carin, especies de Aspergillus,',10
Trichoderma,6 Pseudallescheria/Scedosporium,15
Cryptococcus neoformans variedad neoformans y
gatt as como sus cuatro serotipos,1,10 Mucor,
Sporothrix, Aspergillus nger y A. flavus.11
c) La de RFLP se a establecido para el gnero
Fonsecae' y para las especies de Candida (C.
Tropicalis, C. Parapsilopsis, C. Lusitaniae, C. Krusei
y C. Glabrata).
d) La tcnica de RAPD esta descrita en el gnero
Candida y Malassezia en sus diferentes especies; y
se ha descrito en varios hongos entre ellos
Aspergillus fumigatus.10,11
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