Extraccin de ADN, PCR y electroforesis

Biologa
Molecular
Dr. Jose Carmen Gudio

Patricia Obregn Reyes

Objetivo
Que el alumno pueda realizar una correcta extraccin de ADN,
familiarizarse con el proceso de amplificacin e identificar los parmetros
crticos de una PCR para posteriormente lograr la correcta replicacin de
un fragmento de DNA mediante PCR y finalmente realizar una
electroforesis de cidos nucleicos para analizar la recuperacin del ADN
extrado.

Introduccin
Las metodologas de anlisis de cidos nucleicos, como la amplificacin
por PCR, digestin con enzimas de restriccin, hibridacin con sondas, etc.,
requieren de la obtencin de cidos nucleicos de buena calidad.
La extraccin de ADN requiere hacer varias series de etapas bsicas. En
primer lugar tienen que romperse la pared celular y la membrana
plasmtica para poder acceder al ncleo de la clula. Despus debe
romperse igual la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por ltimo
hay que proteger el ADN de enzimas que puedan disminuirlo y para aislarlo
hay que hacer que se precipite en alcohol. El ADN es soluble en agua,
pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la
interface entre el alcohol y el agua. Adems de permitirnos ver el ADN, el
alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son
dejados en la solucin acuosa. La sal evita la unin de las protenas al
ADN.1

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), es una tcnica de biologa

molecular, que tiene como objetivo el obtener un gran nmero de copias
de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora
basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde.
Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que
tras la amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta
probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar
personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN
amplificado.
Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN
polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos
de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN
recin formadas entre s tras cada fase de replicacin y para despus
dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas
nuevamente.

Por lo general, la PCR es una tcnica comn y normalmente indispensable

en laboratorios de investigacin mdica y biolgica para una gran
variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonacin de ADN para
la secuenciacin, la filogenia basada en ADN, el anlisis funcional de
genes, el diagnstico de trastornos hereditarios, la identificacin de huellas
genticas (usada en tcnicas forenses y test de paternidad) y la deteccin
y diagnstico de enfermedades infecciosas.

La PCR se desarrolla en tres pasos. El primero es la separacin de las dos

cadenas que forman la molcula de DNA que se quiere amplificar, para lo
cual se debe calentar el DNA a una temperatura de 95-96 C. Cada una
de estas cadenas actuar como molde para fabricar su complementaria.
A continuacin, se baja la temperatura para conseguir que cada cebador
se una a su regin complementaria dentro de la cadena de DNA. El ltimo
paso consiste en la generacin de la cadena de DNA complementaria por
accin de la DNA polimerasa.2
Las aplicaciones de la PCR y de sus numerosas variantes son muy
numerosas, entre ellas:
- Simplifica sobremanera muchos experimentos de ingeniera gentica
- Permite muchos estudios de expresin gentica
- Secuenciacin directa de secuencias amplificadas
- Deteccin de mutaciones
- Diagnsticos de enfermedades genticas e infecciosas
- En ciencia forense: identificacin de restos biolgicos, determinacin de
paternidad, pruebas periciales en criminologa
- En arqueologa y paleontologa

Al aplicar un campo elctrico a una solucin de molculas con carga

neta, stas se desplazarn hacia el polo contrario a su carga. En este
principio se basa la tcnica denominada electroforesis y el desplazamiento
de la molcula en cuestin depende de dos factores: la carga y el
tamao. La electroforesis en gel es una tcnica muy utilizada para separar
molculas o fragmentos de molculas de cidos nucleicos. Los materiales
ms comunes para separar molculas de cidos nucleicos son polmeros
como la poliacrilamida y la agarosa. Estos geles van en una cuba,
sumergidos en un tampn, con pH superior a ocho. De esta forma, las
molculas de DNA o RNA sometidas a electroforesis se desplazarn al polo
positivo, porque poseen carga neta negativa a valores de pH superiores a
cinco.

Cuando la electroforesis se realiza en un gel, ste se comporta como un

tamiz molecular y permite separar molculas cargadas basndose en su
tamao y forma. As una mezcla de molculas de DNA de diferente
tamao, que pueden resultar de una reaccin con enzimas de restriccin,
se separarn en funcin de aquel. Es importante el empleo de un
marcador de tamao conocido porque permite calcular la masa
molecular de las bandas de DNA.

Materiales
- Extraccin ADN
Materiales y Equipo
1 Columna de purificacin (cartucho +
punta de 100 L con filtro)
2 Tubos eppendorf de 1.5 ml
10 Puntas de 200 L.
Micropipeta de 250 L (1 c/u)
Tubos colectores reciclados (1/muestra)
Centrfuga con capacidad para 3500
xg.
Reactivos
Solucin de lisis del kit MagNA Pure
total NA o: Tiocianato de guanidina
/ tiocianato HCl. (1.5 mL)
Solucin de Proteinasa K (10 mg).
Etanol absoluto Grado Reactivo
Analtico (250 L)
Etanol al 70%. (500 L)
Solucin de elusin (1.0 mL).
Diatomeas (JT Baker) en Isopropanol
(0.2 g/mL)
Marcador de peso molecular 50 L
[0.5 mg/mL].

- PCR
Materiales y equipo Reactivos
Tubos emmpendorf Agua estril
Micropipetas
Puntas estriles
Microcentrifuga
Termociclador

- Electroforesis
Materiales y Equipo Reactivos
Micropipetas de 10, 50 y 1000 Solucion de acrilamida al 30%
(29.2/0.8 acril/bisacril).
Puntas para micropipetas de 10, 50 y TBE 10X
1000
Parafilm TEMED
 Fuente de poder APS 10%
Cmara Bio Rad Marcador de peso molecular
Cristales para cmara BioRad Muestras de PCR positivas
Soporte para cristales Agua destilada
Bromuro de etidio

Mtodos

- Extraccin ADN
Lisis:
PK 50
L Sol. Lisis
100 L
Mtra 50 10 min/TA
L

Captura: Susp. Mezclar 5 veces,

diatomeas 50 L reposar 10 seg
(10X)

Lavado I: Et-OH Mezclar 5 veces. Descartar

abs. 250 Centrifugar a sobrenadante
L 3000xg

Lavado II (2X):
Mezclar 5 veces.
Et-OH Descartar
Centrifugar a
70%. 250 sobrenadante
3000xg/1 min
L

Mezclar y Pasar
Lavao III:
a columna
Et-OH Centrifugar a Descartar
70%. 100 3000xg/1 min sobrenadante
L

Elusin:
Centrifugar a
Sol. Guardar a -20 o
3000xg/1 min
elusin 50 analizar
en tubo
L eppendorf
 Figura 1. Centrifugacin en la extraccin de ADN.

- PCR
1. 96 C durante 5 (desnaturalizacin)
2. 96 C durante 1 (desnaturalizacin)
3. 60 C durante 1 (hibridacin de los cebadores)
4. 72 C durante 30 (elongacin de la polimerasa) 35 veces
5. 72 C durante 5 (finalizacin de fragmentos elongados)
6. 4 C (mantener hasta retirar los tubos)

Figura 2. Termociclador en PCR.

- Electroforesis
1. Aadir 3 l de buffer de carga al vial donde tenemos el producto de
la PCR; homogeneizar y cargar el contenido del vial en un pocillo del
gel de agarosa ya polimerizado.
2. Establecer una diferencia de potencial entre los polos de la cubeta
de electroforesis. Mantener estas condiciones hasta que la
separacin de los colorantes del buffer de carga nos d idea de que
los fragmentos originados por la digestin estn bien separados (45-
60 min).
3. Visualizar por medio de luz UV.

Figura 3. Electroforesis en gel.

Resultados

Figura 4. Muestras positivas de extraccin de ADN.

Figura 5. Corrida de electroforesis en gel de poliacrilamida.

 Figura 6 Electroforesis en gel de agarosa, 1) Marcador de peso molecular, 2) Control
negativo, 3 y 4) gen amplificado.

Discusin y conclusin
La reaccin en cadena de la polimerasa o PCR es una tcnica
fundamental para la mayor parte de las aplicaciones de la biologa
molecular. Se ha presentado la base terica y prctica de la PCR. Existen
muchas variantes de la PCR convencional, como son la PCR en tiempo
real o PCR cuantitativa (que permite cuantificar la cantidad de producto
amplificado) o la PCR por transcripcin inversa (mediante la cual se
obtiene una copia de DNA complementario, DNAc, utilizando como molde
cido ribonucleico, RNA).
La PCR es una tcnica rutinaria que permite obtener en corto plazo los
resultados esperados.
En esta prctica se determin el tamao del gen de la extraccin de ADN
que realizamos, mediante la visualizacin en gel de la electroforesis
coincidiendo con el tamao consultado en la base de datos.
La electroforesis sali positiva, las corridas salieron bien y el ADN se
fragmento correctamente, eso quiere decir que realizamos bien el
procedimiento de extraccin y replicacin de ADN.
Adems de conocer la cantidad y calidad del ADN, es importante
conocer si el ADN obtenido est integro. La integridad del ADN se puede
observar mediante electroforesis en gel. Si el ADN est integro, se debe
observar una banda estrecha cercana al pozo en que se coloc la mezcla
de ADN. Si est fragmentado, se observar una banda de ms de un cm
de ancho o un sendero luminoso en el carril de la muestra. El ADN
fragmentado dificulta la amplificacin de productos de PCR de alto peso
molecular y afecta la reproducibilidad de las tcnicas.
En ocasiones el material obtenido est fragmentado. Estos mtodos son
susceptibles de contaminacin, variacin y errores por los mltiples pasos
de manipulacin. El rendimiento de los kits depende del tipo de tejido y la
cantidad de muestra inicial, as como de la capacidad de unin de la
membrana.

Referencias
[1] http://learn.genetics.utah.edu/es/units/activities/extraction/
[2] Dieffenbach CW, Dveksler GS (1995) PCR Primer. A Laboratory Manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press. Un excelente y completo manual sobre
la PCR.
[3] Highveld. 2003. The World Famous PCR Jump Station
http://highveld.com/f/fpcr.html
[4] Sosnick T. 2003. Geles de agarosa
http://sosnick.uchicago.edu/agarose_gels.html